基于Nrf2/NQO1/GCL信號通路探討益腎健腦方對血管性癡呆大鼠神經元凋亡的影響

〔摘要〕 目的 研究益腎健腦方對血管性癡呆（vascular dementia， VD）大鼠神經元凋亡的影響及作用機制。方法 將60只SPF級大鼠隨機分為模型制備組50只和空白組10只，模型制備組分時段結扎雙側頸總動脈，空白組僅分離雙側頸總動脈但不結扎。術后4周通過Morris水迷宮篩選出模型制備成功大鼠28只，隨機分為模型組、多奈哌齊組（0.45 mg·kg-1·d-1）、益腎健腦方高劑量組（24.3 g·kg-1·d-1）、益腎健腦方低劑量組（12.15 g·kg-1·d-1）各7只，加上空白組10只，共5組。給藥4周后，行Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶能力，HE染色觀察大腦皮質和海馬CA1區組織病理變化，TUNEL染色觀察大腦皮質和海馬CA1區神經細胞凋亡情況，免疫組織化學法檢測大腦皮質和海馬CA1區天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate-specific proteinase-3， Caspase-3）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-7（cysteinyl aspartate-specific proteinase-7， Caspase-7）蛋白表達水平，Western blot檢測海馬組織核因子E2相關因子2（nuclear factor-E2-related factor 2， Nrf2）、醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1， NQO1）、谷氨酰半胱氨酸連接酶（glutamate-cysteine ligase， GCL）蛋白表達水平。結果 與空白組比較，模型組定位航行實驗第5天逃避潛伏期明顯增加，空間探索實驗穿越平臺次數明顯減少，目標象限停留時間明顯縮短（Plt;0.01）；模型組腦組織病理損傷明顯，神經細胞凋亡率顯著升高（Plt;0.01）；模型組大腦皮質區和海馬CA1區Caspase-3、Caspase-7陽性表達顯著升高（Plt;0.01）；模型組海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達顯著降低（Plt;0.01）。與模型組比較，多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組定位航行實驗中第5天逃避潛伏期明顯縮短，空間探索實驗中穿越平臺次數增加，目標象限停留時間明顯延長（Plt;0.05，Plt;0.01）；多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組腦組織病理損傷減少，神經細胞凋亡率均顯著降低（Plt;0.01）；多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組Caspase-3、Caspase-7陽性表達均顯著降低（Plt;0.01）；多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達均顯著升高（Plt;0.01）。結論 益腎健腦方可以改善VD大鼠學習記憶能力、抑制Caspase-3和Caspase-7蛋白表達及減少神經元凋亡，其機制可能與激活Nrf2/NQO1/GCL信號通路有關。

〔關鍵詞〕 益腎健腦方；血管性癡呆；氧化應激；凋亡；核因子E2相關因子2；醌氧化還原酶1；谷氨酰半胱氨酸連接酶

〔中圖分類號〕R255" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.11.006

Effects of Yishen Jiannao Formula on neuronal apoptosis in vascular dementia rats based on Nrf2/NQO1/GCL pathway

WANG Xinqiang1， HU Guoheng1， XIE Dan1，2， WANG Yan1，2， CHEN Ya1*， HE Piao1*

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects and mechanism of action of Yishen Jiannao Formula （YSJNF） on neuronal apoptosis in rats with vascular dementia （VD）. Methods Sixty SPF-grade rats were randomized into a model preparation group （n=50） and a blank group （n=10）. The model preparation group underwent staged ligation of the bilateral common carotid arteries， while the blank group had only separation of the bilateral common carotid arteries without ligation. Four weeks after surgery， 28 rats with successful model preparation， as confirmed by the Morris water maze test， were randomized into model group， donepezil group （0.45 mg·kg-1·d-1）， as well as high-dose （24.3 g·kg-1·d-1） and low-dose （12.15 g·kg-1·d-1） YSJNF groups， with seven rats in each group， coupled with the blank group （n=10）， totaling five groups. Four weeks after administration， Morris water maze was used to assess the learning and memory abilities of the rats. HE staining was employed to observe the histopathological changes in the cerebral cortex and hippocampal CA1 area， and TUNEL staining to evaluate the neuronal apoptosis in these areas. Immunohistochemistry was used to check the protein expression levels of cysteinyl aspartate-specific proteinase-3 （Caspase-3） and cysteinyl aspartate-specific proteinase-7 （Caspase-7） in the cerebral cortex and hippocampal CA1 area， and Western blot to examine the protein expression levels of nuclear factor-E2-related factor 2 （Nrf2）， quinone oxidoreductase 1 （NQO1）， and glutamate-cysteine ligase （GCL） in the hippocampal tissue. Results Compared with the blank group， the model group showed a significantly increased escape latency on the 5th day of the place navigation test， a significantly decreased number of the platform crossings in the spatial probe test， and a significantly shorter time spent in the target quadrant （Plt;0.01）; it also exhibited significant pathological damage of the brain tissue and a markedly increased neuronal apoptosis rate （Plt;0.01）; the positive expressions of Caspase-3 and Caspase-7 in the cerebral cortex and hippocampal CA1 area were significantly elevated （Plt;0.01）， while the protein expressions of Nrf2， NQO1， and GCL in the hippocampal tissue were notably reduced in this group （Plt;0.01）. Compared with the model group， the donepezil group and high- and low-dose YSJNF groups showed a significant reduction in the escape latency on the 5th day of the place navigation test， an increase in the number of platform crossings， and an obviously longer time spent in the target quadrant in the spatial probe test （Plt;0.05， Plt;0.01）; these groups also demonstrated reduced pathological damage in the brain tissue and a significant decrease in neuronal apoptosis rate （Plt;0.01）; furthermore， the positive expressions of Caspase-3 and Caspase-7 were significantly reduced （Plt;0.01）， while the protein expressions of Nrf2， NQO1， and GCL in hippocampal tissue were significantly elevated in these groups （Plt;0.01）. Conclusion YSJNF may improve the learning and memory abilities in VD rats， inhibit the protein expressions of Caspase-3 and Caspase-7， and reduce neuronal apoptosis， the mechanism of which may be related to the activation of the Nrf2/NQO1/GCL signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Yishen Jiannao Formula; vascular dementia; oxidative stress; apoptosis; nuclear factor-E2-related factor 2; quinone oxidoreductase 1; glutamate-cysteine ligase

血管性癡呆（vascular dementia， VD）是指腦卒中等腦血管疾病造成學習、記憶、行為相關腦區血流低灌注，從而導致運動和認知功能障礙的一組臨床綜合征。到2050年，全球癡呆患者預計達到1.52億人，其中VD患者約8 200萬人，VD患者預后一般，可生存時間一般為8～10年，主要治療策略為對癥治療[1-3]。我國人口老齡化的加劇勢必伴隨著VD患者的增加，這對于照料者和社會而言都是沉重的經濟負擔[4]，預防和治療VD已成為臨床亟待解決的問題。

海馬CA1區是大腦認知功能腦區，其損傷先于自然衰老大鼠空間認知的變化，急性腦卒中或長期腦區血流低灌注所致海馬CA1區神經元損傷是VD的病理基礎[5-7]。有研究表明，在腦組織缺血缺氧時會發生氧化和抗氧化系統失衡，神經元內產生大量氧自由基，引發神經元凋亡，加劇海馬CA1區衰老退化，最終導致VD的發生[8]。因此，緩解神經元氧化損傷和凋亡是防治VD的重要策略。

中藥具有多成分、多靶點的優勢。近年來，中藥對氧化應激和凋亡的調控作用逐漸得到證實，對VD防治療效良好。益腎健腦方是基于古方七福飲化裁而成，是第六批全國名老中醫專家學術經驗傳承指導老師胡國恒教授“腎腦同治”學術思想的體現，具有益腎生髓、化痰通絡的功效，治療VD臨床療效顯著。課題組前期研究證實，益腎健腦方可以促進受損神經元修復，改善VD大鼠學習記憶能力[9]。為了進一步研究益腎健腦方治療VD的機制，本實驗采用雙側頸總動脈分時段結扎（2-VO）法建立VD大鼠模型，觀察益腎健腦方抗氧化應激損傷、抗凋亡的作用及其可能機制，為益腎健腦方的臨床推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1" 動物

雄性SPF級SD大鼠60只，體質量250～280 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（湘）2019-0004]。飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室SPF級實驗動物中心[實驗單位使用許可證編號：SYXK（湘）2020-0010]，自由攝食飲水，實驗經湖南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室實驗動物倫理委員會批準（倫理審查批號：ZYFY20210813-37）。

1.2" 藥物及制備

益腎健腦方藥物組成：熟地黃20 g，酒山茱萸15 g，黃芪15 g，白參10 g，川芎10 g，石菖蒲15 g，紅景天10 g，丹參10 g，當歸尾10 g，蜜遠志10 g，炙甘草10 g。飲片由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥房提供，經鑒定符合《中華人民共和國藥典》2020年版一部的規定。常規方法煎煮，旋轉蒸發儀濃縮至原藥材濃度為2.43 g/mL，于4 ℃冰箱中保存備用。鹽酸多奈哌齊片（安理申）[衛材（中國）藥業有限公司，國藥準字號：H20050978，批號：2203026，5 mg/片]5 mg研成細粉末后溶于110 mL蒸餾水，配制成0.045 mg/mL溶液。

1.3" 主要試劑與儀器

兔抗核因子E2相關因子2（nuclear factor-E2-related factor 2， Nrf2）抗體、鼠抗醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1， NQO1）、兔抗谷氨酰半胱氨酸連接酶（glutamate-cysteine ligase， GCL）抗體、兔抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（中國proteintech公司，批號：16396-1-AP、67240-1-Ig、12601-1-AP、20536-1-AP、SA00001-1、SA00001-2）；兔抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate-specific proteinase-3， Caspase-3）、兔抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-7（cysteinyl aspartate-specific proteinase-7， Caspase-7）抗體（英國Abcam公司，批號：ab32351、ab255818）；TUNEL試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：KGA704）；二步法試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：PV-9004、ZLI-9017）；蘇木素伊紅染色液、RIPA裂解液（上海碧云天生物技術股份有限公司，批號：BL700A、P0013B）；蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達生物科技有限公司，批號：583794）；蛋白磷酸酶抑制劑（北京普利萊基因技術有限公司，批號：P1260）；顯影液、定影液（上海市佳信科技有限公司，貨號：BW-61、BW-62）；SuperECL Plus超敏發光液（美國Advansta公司，貨號：K-12045-D50）。

Morris水迷宮視頻分析系統（型號：ZS-Morris，北京眾實迪創科技發展有限責任公司）；包埋機（型號：BMJ-A，常州市中威電子儀器有限公司）；石蠟切片機（型號：YD-315，金華市益迪醫療設備有限公司）；病理切片機（型號：RM2016，上海徠卡儀器有限公司）；雙目顯微鏡[型號：BA210T，麥克奧迪（廈門）醫療診斷系統有限公司]；生物樣品均質儀（型號：BioPrep-24，杭州奧盛儀器有限公司）；精密PH計（型號：PHS-3C，上海雷磁儀器有限公司）；酶標儀（型號：SMR60047，武漢優爾生生命科學裝備有限公司）；搖床（型號：TS-1，江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；臺式冷凍離心機（型號：H1650R，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；電泳儀、轉膜儀（型號：DYY-6C、DYCZ-40D，北京六一生物科技有限公司）。

1.4" 模型制備與評價

60只SD大鼠隨機分為空白組10只、模型制備組50只，采用改良2-VO法（雙側頸總動脈分次結扎法）制備VD模型[9]。大鼠術前禁食24 h、禁水4 h。麻醉、備皮、消毒，頸中切口，鈍性分離右側頸總動脈后用5號無菌手術縫線結扎，完全阻斷右側頸總動脈血流，縫合切口，在切口處均勻涂少量青霉素凍干粉，整個實驗過程均在無菌手術臺進行，確保無菌操作。7 d后結扎左側頸總動脈，操作同第1次手術。空白組分離雙側頸總動脈但不結扎，其余過程同模型制備組。將大鼠置于溫暖環境中，防止體溫過低，注意監測大鼠的呼吸、心跳、體溫等，連續3 d注射青霉素8萬U/250 g抗感染，增加大鼠存活率。

造模4周后，行Morris水迷宮中的定位航行試驗，將水池劃分為第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限，將平臺置于第Ⅳ象限，將清水注入迷宮并使水位在平臺上2 cm。前4 d為訓練期，將大鼠依次按第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限放入水中，若大鼠未在120 s內站上平臺，則人為引導至平臺上停留10 s，第5天從第Ⅱ象限將大鼠放入水中，大鼠爬上平臺的時間即為逃避潛伏期（escapelatency， EL），120 s未爬上平臺則記為120 s。以空白組大鼠EL平均值為參考值A，其余大鼠所測EL值為參考值B，以（B-A）/Bgt;20%為造模成功標準，篩選出模型制備成功的VD大鼠28只。

1.5" 分組及給藥

將模型制備成功的28只VD大鼠分為模型組、多奈哌齊組、益腎健腦方高劑量組、益腎健腦方低劑量組，每組7只，加上空白組10只大鼠，共5組。按照人與大鼠體表面積折算給藥劑量，多奈哌齊組：成人每天服用5 mg生藥劑量進行換算，換算后得出生藥劑量為0.45 mg·kg-1·d-1；益腎健腦方低劑量組：與70 kg成人等效劑量，以成人每天服用135 g生藥劑量進行換算，換算后得出生藥劑量為12.15 g·kg-1·d-1；益腎健腦方高劑量組：益腎健腦方低劑量組兩倍量給藥，為24.3 g·kg-1·d-1?？瞻捉M和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，均連續干預4周。

1.6" 觀察指標

1.6.1" Morris水迷宮實驗檢測學習和記憶能力" 灌胃結束后，行Morris水迷宮實驗檢測大鼠的學習和記憶能力。（1）定位航行實驗：詳細操作方法按照“1.4”，記錄各組大鼠第5天的逃避潛伏期；（2）空間探索實驗：定位航行實驗結束后，第6天撤除平臺，將大鼠從第Ⅱ象限放入水中，水迷宮軟件記錄大鼠120 s內穿越原平臺區域次數和在第Ⅳ象限停留的時間。

1.6.2" HE染色觀察大腦皮質和海馬CA1區組織病理變化" Morris水迷宮實驗后禁食24 h，麻醉后脊椎脫臼處死大鼠，斷頭取腦，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片，HE染色后梯度乙醇（95%～100%）脫水，透明后中性樹膠封片，400倍顯微鏡觀察大腦皮質和海馬CA1區組織病理變化。

1.6.3" TUNEL檢測大腦皮質和海馬CA1區神經細胞凋亡情況" 腦組織用多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋切片、脫蠟水化后進行通透（熱修復抗原），1%高碘酸封閉，生物素封閉，Streptavidin-HRP標記工作液標記，DAB顯色，蘇木素復染，晾干后加中性樹膠和蓋玻片，400倍光鏡下觀察拍照，IPP軟件分析神經元凋亡率（黃褐色陽性細胞所占百分比）。

1.6.4" 免疫組織化學檢測大腦皮質和海馬CA1區Caspase-3、Caspase-7蛋白表達水平" 取腦組織于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）抗原修復溶液處理，加入1%高碘酸滅活內源性酶，滴加適當稀釋的一抗Caspase-3（1∶200）、Caspase-7（1∶200），4 ℃過夜，PBS洗滌，滴加抗兔-IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌后DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明，封片后顯微鏡下觀察，陽性染色為黃色或棕黃色/褐色，采用IPP軟件測定平均光密度（累積光密度/陽性表達面積）。

1.6.5" Western blot檢測海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達水平" 海馬組織低溫勻漿，裂解液裂解后離心，提取上清液蛋白，測定蛋白濃度后變性處理，制膠后上樣，通過10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠75 V恒壓電泳，300 mA恒定電流轉膜，牛奶封閉，稀釋后的一抗Nrf2（1∶1 000）、NQO1（1∶5 000）、GCL（1∶2 000）、β-actin（1∶5 000）4 ℃孵育過夜，洗膜后用稀釋HRP標記的二抗（1∶6 000）孵育90 min，ECL顯色曝光后掃描，Image J軟件進行分析，以目的蛋白/內參蛋白（β-actin）光密度為目的蛋白相對表達量。

1.7" 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。計量資料用“ｘ±s”表示，多樣本計量資料符合正態分布和方差齊性者，進行單因素方差分析，兩組之間比較用獨立樣本t檢驗；方差不齊者，兩組之間比較用Dunnett's T3法。均以Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1" 益腎健腦方對VD大鼠學習記憶能力的影響

與空白組比較，模型組大鼠定位航行實驗第5天逃避潛伏期明顯增加，空間探索實驗穿越平臺次數明顯減少，目標象限停留時間明顯縮短（Plt;0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組大鼠定位航行實驗中第5天逃避潛伏期均明顯縮短，空間探索實驗中穿越平臺次數均增加，目標象限停留時間均明顯延長（Plt;0.05，Plt;0.01）。詳見圖1。

2.2" 益腎健腦方對VD大鼠大腦皮質區和海馬CA1區組織病理的影響

空白組大鼠大腦皮質區和海馬CA1區神經元排列規則緊密，細胞體形狀飽滿，輪廓清晰，細胞核核仁清晰無皺縮，染色質分布均勻無凝集；模型組神經元稀疏，排列不規則，細胞胞體腫脹，形狀不規則，細胞核固縮，染色質凝集，細胞質空泡狀；多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組神經元排列相對緊密，細胞體形狀規則，可見少部分多邊形細胞體，細胞核核仁及染色質相對清晰，偶見細胞核皺縮、染色質凝集。詳見圖2。

2.3" 益腎健腦方對VD大鼠大腦皮質區和海馬CA1區神經細胞凋亡的影響

空白組大鼠大腦皮質區和海馬CA1區可散見少量黃褐色凋亡細胞；模型組見多量黃褐色凋亡細胞彌漫分布；多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組見黃褐色凋亡細胞散在分布，但數量明顯較模型組減少。與空白組比較，模型組大腦皮質區和海馬CA1區神經細胞凋亡率顯著升高（Plt;0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組大腦皮質區和海馬CA1區神經細胞凋亡率均顯著降低（Plt;0.01）。詳見圖3。

2.4" 益腎健腦方對VD大鼠大腦皮質區和海馬CA1區Casepase-3、Casepase-7蛋白表達的影響

Caspase-3陽性染色呈棕褐色，主要在細胞質表達，Caspase-7陽性染色呈棕黃色，在細胞質和細胞核均有表達。與空白組比較，模型組大鼠大腦皮質區和海馬CA1區Caspase-3、Caspase-7陽性表達顯著升高（Plt;0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組大腦皮質區和海馬CA1區Caspase-3、Caspase-7陽性表達均顯著降低（Plt;0.01）。詳見圖4—5。

2.5" 益腎健腦方對VD大鼠海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達顯著降低（Plt;0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和益腎健腦方高、低劑量組大鼠海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達均顯著升高（Plt;0.01）。詳見圖6。

3 討論

VD分為腦卒中后癡呆、皮質下缺血性血管性癡呆、多發梗死性癡呆和混合型癡呆4種類型，發病機制尚不完全明確，也無特效治療藥物[10]。VD患者的典型癥狀為認知功能障礙、神經功能障礙和運動功能障礙，嚴重情況下可致人死亡，我國VD的患病率為1.1%～3.0%，年發病率在0.5%～0.9%[3]。隨著我國的低生育率及人口老齡化加劇，VD的患病率和發病率將進一步增加，因此，對于VD的防治研究刻不容緩。腦組織主要由易于氧化的脂質組成，耗氧量約占機體耗氧量的20%，因此，腦組織對氧化應激損傷很敏感，慢性腦低灌注（chronic cerebral hypoperfusion， CCH）誘導的氧化應激損傷導致海馬CA1區神經元凋亡、突觸樹突減少和棘密度減低，是VD認知障礙的重要因素[11-12]。

生理情況下，機體內氧化和抗氧化系統處于平衡狀態。抗氧化系統分為酶系統和非酶系統，酶類抗氧化系統主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、硒谷胱甘肽過氧化酶等，非酶類抗氧化系統主要包括維生素C、谷胱甘肽（glutathione， GSH）等，非酶類抗氧化系統是酶類抗氧化系統產生的基礎。因為腦組織耗氧多且代謝旺盛，神經元自身GSH含量不多，NQO1等抗氧化酶含量也較低，抗氧化系統薄弱，所以腦組織相對其他組織更容易受到氧化損傷，缺血缺氧后神經元內產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS消耗抗氧化物質，使得GSH減少，SOD等抗氧化酶活性降低，對細胞膜、蛋白質、DNA產生毒性作用，最終導致神經元的凋亡和老化[13]。Nrf2是重要的內源性抗氧化因子，其下游有200多種基因，具有維持體內氧化和抗氧化平衡、抑制炎癥和細胞凋亡等作用。生理狀態下，Nrf2和Kelch樣Ech相關蛋白1（Keap1）耦聯穩定存在于細胞質中，腦組織低灌注時，神經元細胞質中的Nrf2與Keap1解離，易位到細胞核與ARE的特異識別位點相互結合，進而啟動下游抗氧化酶NQO1表達和GSH合成[12，14]。NQO1是一種抗氧化酶，可抑制ROS產生，在氧化應激過程中起到保護細胞的作用，GSH是體內廣泛存在的重要抗氧化劑和自由基清除劑，GCL是GSH生物合成中的第一個限速酶，GSH與有毒的過氧化物發生還原反應，減輕氧化應激損傷[15]。

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，生理狀態下細胞凋亡對于維持內環境穩態有重要作用，在神經元缺血缺氧時發生氧化應激反應，則可通過啟動程序基因調控細胞凋亡的發生，引起神經元變性，導致認知功能障礙[16]。細胞凋亡的激活有兩條途徑，分別是死亡受體通路（外部）和線粒體通路（內部），無論是哪種途徑，都與Caspase蛋白酶家族密不可分，最終都會激活執行死亡的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶Caspase-3和Caspase-7，Caspase-3和Caspase-7能對受損或異常細胞的DNA、細胞膜和細胞器等進行剪切和降解，引起不可逆的細胞死亡過程。

VD屬于中醫學“癡呆”“呆病”范疇，腎虛腦髓失養是其病機關鍵。益腎健腦方以景岳名方七福飲為基礎加減而成，由熟地黃、酒山茱萸、黃芪、白參、川芎、石菖蒲、紅景天、丹參、當歸尾、蜜遠志、炙甘草組成，具有益腎生髓、化痰通絡之功效。方中以熟地黃、酒山茱萸為君藥，補益肝腎使腦髓得充，取“肝腎同源”之義；以黃芪、白參、紅景天為臣藥，補益脾胃化生氣血且大補元氣，使腦得所養；以川芎、當歸尾、丹參、石菖蒲、蜜遠志為佐藥，化瘀通絡兼化痰益智；炙甘草為使藥，調和諸藥。

本研究采用雙側頸總動脈分時段結扎（2-VO）法建立VD大鼠模型，結果發現VD大鼠學習記憶能力明顯降低，大腦皮質區和海馬CA1區神經元稀疏，細胞質空泡狀，細胞核固縮，黃褐色凋亡細胞彌漫分布，神經元凋亡水平上升，Caspase-3、Caspase-7蛋白表達升高，海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達水平降低，表明VD大鼠神經元發生了氧化應激及凋亡，且其引發的氧化應激可以抑制Nrf2/NQO1/GCL信號通路促進神經元凋亡；給予鹽酸多奈哌齊和益腎健腦方高、低劑量處理的大鼠學習記憶能力提高，大腦皮質和海馬CA1區病理損傷改善，神經元凋亡水平下降，Caspase-3、Caspase-7蛋白表達降低，海馬組織Nrf2、NQO1、GCL蛋白表達水平升高，表明益腎健腦方可能通過激活Nrf2/NQO1/GCL信號通路來抑制神經元凋亡，從而減輕氧化應激引起的神經元損傷，改善VD大鼠學習記憶能力。

綜上所述，益腎健腦方可通過激活Nrf2/NQO1/GCL信號通路抑制氧化應激，減輕慢性腦灌注不足導致的大腦皮質和海馬CA1區神經元凋亡，這可能是益腎健腦方防治VD、發揮其改善認知障礙作用的機制之一。

參考文獻

[1] 賈建平， 陳生弟. 神經病學[M]. 8版. 北京： 人民衛生出版社， 2018： 231-234.

[2] SMITH E E， BARBER P， FIELD T S， et al. Canadian Consensus Conference on Diagnosis and Treatment of Dementia （CCCDTD）5： Guidelines for management of vascular cognitive impairment[J]. Alzheimer's amp; Dementia， 2020， 6（1）： e12056.

[3] 余文驍， 王延江. 亞洲血管性認知損害的流行病學現狀和發展趨勢[J]. 中國醫學前沿雜志（電子版）， 2020， 12（10）： 前插1， 1-7.

[4] 秦" 茂， 伍大華， 張秀麗， 等. 滋腎活血方對血管性癡呆大鼠分裂與融合蛋白Mfn1、Mfn2、Drp1、Fis1的影響[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2023， 43（1）： 21-26.

[5] WANG N Y， TAN Y H， ZHOU Q X， et al. The impairment of the hippocampal neuro-vascular unit precedes changes in spatial cognition in naturally aged rats[J]. Neuroscience Letters， 2022， 776： 136580.

[6] 王保平， 張" 圓， 陳怡名， 等. 龍首參葛丸對血管性癡呆大鼠海馬CA1區組織結構變化的影響[J]. 西部中醫藥， 2019， 32（6）： 6-9.

[7] 王德秀， 蔡" 欣， 王" 鋼， 等. 銀杏葉提取物對血管性癡呆大鼠學習記憶的影響及海馬神經元的保護作用[J]. 中華行為醫學與腦科學雜志， 2019， 28（6）： 516-521.

[8] ZHU T T， ZHU M L， QIU Y， et al. Puerarin alleviates vascular cognitive impairment in vascular dementia rats[J]. Frontiers in Behavioral Neuroscience， 2021， 15： 717008.

[9] 李" 騰. 益腎健腦方對血管性癡呆大鼠學習記憶能力及海馬BDNF/TrkB表達的影響[D]. 長沙： 湖南中醫藥大學， 2020.

[10] CHANG WONG E， CHANG CHUI H. Vascular cognitive impairment and dementia[J]. Continuum， 2022， 28（3）： 750-780.

[11] 房娉平， 闞敏宸， 郭立靜， 等. 燈盞花素對血管性癡呆大鼠海馬CA1區病理改變及Nrf2/HO-1通路的影響[J]. 中西醫結合心腦血管病雜志， 2021， 19（16）： 2751-2756.

[12] LIAO X P， ZHANG Z L， MING M， et al. Imperatorin exerts antioxidant effects in vascular dementia via the Nrf2 signaling pathway[J]. Scientific Reports， 2023， 13： 5595.

[13] CORDARO M， D’AMICO R， MORABITO R， et al. Physiological and biochemical changes in NRF2 pathway in aged animals subjected to brain injury[J]. Cellular Physiology and Biochemistry， 2021， 55（2）： 160-179.

[14] SHENG M Y， CHEN X， YU Y， et al. Rev-erbα agonist SR9009 protects against cerebral ischemic injury through mechanisms involving Nrf2 pathway[J]. Frontiers in Pharmacology， 2023， 14： 1102567.

[15] 南" 潔. 馬鈴薯谷胱甘肽合成相關酶StGSH1和StGSH2的活性鑒定和蛋白結晶[D]. 廣州： 華南農業大學， 2019.

[16] SUN M， SHEN X M， MA Y Z. Rehmannioside A attenuates cognitive deficits in rats with vascular dementia （VD） through suppressing oxidative stress， inflammation and apoptosis[J]. Biom？鄄edicine amp; Pharmacotherapy， 2019， 120： 109492.