老山芹層積前后種子差異代謝物分析

摘要：為深入探索老山芹種子休眠機理，以老山芹層積前后種子為研究對象，采用氣相色譜-飛行時間質譜聯用技術 （gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC-TOF/MS）對其非層積種子（non-lamellarizedseeds， NS）和層積后達到發芽狀態種子（germination seeds， GS）的差異代謝物進行分析。結果表明，共檢測到995種代謝產物，NS和GS的代謝物存在明顯分離，差異代謝物有126種，其中極顯著差異代謝物75種，包括35種上調，40種下調。對極顯著差異代謝物所在代謝通路分析表明，涉及10條關鍵代謝通路。和弦圖分析表明，差異代謝物中脂質類化合物（含類脂分子）與苯類化合物呈極顯著正相關；苯丙烷類化合物（含聚酮類化合物）與有機氧類化合物呈極顯著負相關。以上研究結果為探索老山芹種子成熟后萌發提供了代謝組學理論基礎，為更好地研究老山芹種子后成熟及休眠機制提供了依據和支撐。

關鍵詞：老山芹；GC-TOF/MS；代謝組學；層積；差異代謝物

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0183

中圖分類號：S567.23+9 文獻標志碼：A 文章編號：1008?0864（2024）07?0037?13

老山芹（Heracleum moellendorffii Hance）為多年生宿根草本植物，學名東北牛防風，又名大葉芹、土當歸等，多生長于我國東北、西南及華中地區的陰濕、腐殖質多的河岸或雜草林中[1]，富含氨基酸、黃酮類化合物等，對于治療風濕、高血糖和血脂、腰膝疼痛、癌癥等有積極的輔助作用。老山芹葉基部肥大，可入菜，因膳食纖維豐富、活性成分多而深受大眾喜愛。然而受自然條件及種子休眠等因素影響，老山芹種子的發芽率極低，出苗也不整齊，只依靠自然采收遠遠滿足不了市場需求。

楊慧潔等[2]發現，老山芹出苗不整齊的主要原因是種子存在休眠。層積可以有效打破種子休眠，降低脫落酸等抑制物質的含量，增加赤霉素、細胞分裂素等含量，從而提高種子的萌發率。李富恒等[3]以5年生老山芹種子為材料，通過4種變溫層積處理發現，采用“暖溫-低溫-暖溫”層積的方法在形態學上更有利于老山芹種子后熟，而且低溫是處理的關鍵。可見，低溫層積對于解除老山芹種子休眠有積極作用。目前，關于老山芹種子休眠的研究多集中在化學成分[4]、栽培技術[1]、食用藥用[1]、蛋白質組學[5]、形態學[6]等方面，而對層積過程中老山芹種子代謝物的變化及其調控途徑鮮有報道。生物體內每時每刻都在各種因素調控作用下發生代謝變化。代謝組學可通過高通量技術定性、定量環境因素引起的細胞、組織、器官中小分子代謝物[7?8]，是從分子水平進行系統研究的重要方式之一。種子萌發不僅與大分子化學成分、種子形態結構、蛋白質等相關，還與小分子物質相關。因此，研究層積條件下種子代謝組學具有重要意義。

本研究利用4 ℃恒溫層積處理老山芹種子，通過氣相色譜-飛行時間質譜 （gas chromatographytime-of-flight mass spectrometry，GC-TOF/MS）鑒定種子的代謝物，采用正交偏最小二乘方判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）獲得OPLS-DA 模型，并用交叉驗證法檢驗模型質量；采用 OPLS-DA模型結合t檢驗尋找差異性代謝物。利用KEGG（Kyoto encyclopedia ofgenes and genomes）方法分析層積過程中老山芹種子的關鍵代謝通路，研究影響老山芹種子萌發的關鍵代謝物質及可能控制后熟到萌發階段的關鍵通路，為老山芹后熟及休眠機制、種子萌發、育苗技術的研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 種子材料

以7年生老山芹植株收獲的種子為試驗材料，由東北農業大學生命科學學院提供。種子采收后自然陰干備用。

1.1.2 試劑

試驗試劑包括75% 乙醇、提取液（甲醇與水體積比為3∶1）、核糖醇、甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽溶于吡啶，20 mg·mL?1）、含有1%（體積分數）TMCS （trimethylchlorosilane）的雙三甲基硅基三氟乙酰胺（bis-trifluoroacetamide，BSTFA）、純水（ddH2O）等。

1.1.3 儀器

GC-TOF/MS 分析使用儀器為氣相色譜儀系統（7890A型 美國安捷倫）和Pegasus HT飛行時間質譜儀（美國力可）。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子層積處理

選取大小均一、籽粒飽滿的種子，用75%乙醇滅菌30 s，再以蒸餾水清洗干凈后浸泡6 h。將處理好的種子和干凈的濕潤沙子按2∶3（體積比）的比例混勻并攪拌，放入塑料盒（長、寬和高分別為19、13和11 cm）中，并在蓋子上打孔透氣；然后將種子轉移到4 ℃進行層積處理。在4 ℃層積處理過程中，每隔2 d通過解剖鏡觀察種胚結構及胚發育情況，同時各取10 g非層積種子（non-stratified seeds，NS）和層積后達到發芽狀態的種子（germinated seeds，GS），用濾紙吸干水分，于液氮速凍后置于?80 ℃冰箱保存，用于代謝組分析（n=6，n 為每個取樣點所取重復樣品數）。

1.2.2 樣品代謝物提取

種子總代謝物利用甲氧銨鹽和BSTA法[9]提取。

1.2.3 樣品檢測

樣品分析檢測參照雷鋒杰[10]方法，具體GC-TOF/MS儀器參數如表1所示。

1.2.4 數據處理

參照雷鋒杰[10]的分析方法，使用ChromaTOF 軟件（V 4.3x，LECO）以及LECOFiehnRtx5數據庫對質譜數據進行分析，包括峰提取、峰面積積分、峰對齊等；利用SIMCA 軟件（V14.1，Sartorius Stedim Data Analytics AB，Umea，Sweden）對數據進行對數轉換加中心化格式化處理[11]，然后進行主成分分析（principal componentanalysis，PCA），觀察不同時間樣品原始數據的總體分布和整個分析過程的穩定性。通過OPLS-DA對結果進一步分析，獲取更加可靠的組間差異代謝物與試驗組的相關程度信息[11]。使用SIMCA軟件采用7次循環交互驗證及隨機多次改變分類變量排列順序檢驗的方法驗證模型。采用OPLSDA模型，設定篩選條件為VIP（variable importancein the projection）值gt;1且Plt;0.05，并將篩選結果制成火山圖。利用circos. par 函數設置參數，chordDiagram 函數繪制和弦圖。由于老山芹沒有測序，因此通過搜索KEGGPathway數據庫查找同一科植物胡蘿卜的代謝通路，并將差異代謝物在KEGG通路圖上標記，再通過對差異代謝物所在通路綜合分析，篩選與代謝物差異相關性最高的關鍵通路，并將結果繪制成氣泡圖進行分析。

2 結果與分析

2.1 GC-TOF/MS 分析

通過GC-TOF/MS 對老山芹樣品進行鑒定和分析，得到總離子色譜圖（total ion current，TIC）如圖1所示。2組的總離子色譜圖整齊，均未觀察到漂移，保留時間集中在6～32 min，重現性好，表明所用GC-TOF/MS儀器具有良好的重復性和穩定性。NS和GS樣本的主要色譜峰構成相似，但色譜峰數目存在差異。共檢測到995種代謝產物，經預處理后保留971種。通過與質譜數據庫匹配初步鑒定出315 種代謝物，包括18 種有機酸，33種氨基酸、肽及其配體，19種脂肪酸及其共軛物，12種糖醇、糖酸及其他衍生物等。

2.2 老山芹不同層積時期代謝物PCA 和OPLSDA分析

為探究萌發機理，采用SIMCA軟件對后熟時期的代謝物進行PCA和OPLS-DA回歸模型分析，如圖2和3所示。PCA得分圖中所有樣本均在95%的置信區間內，且NS聚為一類，GS聚為另一類，在第1主成分（PC1）軸完全分離，第2主成分（PC2）軸分離趨勢較小。NS和GS間代謝物差異較大，而相同處理下不同重復間化合物組成較一致（圖2A）。

利用OPLS-DA法過濾不相關的正交變量，使得到的信息更可靠。從圖2B可以看出，2組樣本區分非常顯著，且樣本均處于95%置信區間內，說明模型具有較好的穩健性。為了使判別效果及主成分的得分圖更加明顯，隨機改變分類變量的排列順序，使分類信息主要集中在1個主成分中，利用200 次置換后建立OPLS-DA 模型。由圖3可知，隨機模型的R2的截距和Q2的截距分別為0.92和-0.69，表明模型的穩健性較好，不存在過擬合，可靠性較強。

2.3 不同層積時期顯著性差異代謝物分析

由圖4可知，在NS和GS間共獲得349種差異代謝物，排除unknown及analyte代謝物，有126種代謝物存在顯著差異，其中有57 種顯著上調，69種顯著下調。為進一步確定與層積相關的候選生物標志物，參照吳菲菲等[12]的方法篩選到有明確注釋且差異極顯著的差異代謝物75種，其中上調的有35種，下調的有40種（表2）。

2.4 不同層積時期差異代謝物層次聚類分析

為了解差異代謝物的相關性，采用Lee 等[13]的方法對差異代謝物進行聚類，結果（圖5）表明，NS與GS代謝物差異較大。與NS相比，GS的一些代謝物被上調，另一些代謝物被下調，其中上調的較多。由表3可知，共計125種差異代謝物，其中有56種上調，69種下調；涉及有機酸及其衍生物類、有機氧化合物類、苯丙烷類化合物和聚酮類化合物類多為下調，而脂質和類脂分子類、有機氮化合物類、有機雜環化合物類、核苷和核苷酸及其衍生物類、苯類化合物多為上調。

2.5 差異代謝物的和弦分析

為了更好地展示差異代謝物的相關性，對代謝物進行和弦分析，如圖6所示。圖形呈近圓形，圖外圍數據節點圍繞在圓周圍輻射分布，連接帶的首尾如果寬度相同，則表示單向流量；寬度不同則表示雙向流量[14?15]。差異代謝物包括有機酸及其衍生物類、有機氧化合物類、脂質和類脂分子類、有機雜環化合物類、苯類化合物類、核苷和核苷酸及類似物類、有機氮化合物類、苯丙烷類化合物、聚酮類化合物類、其他類。選取| Log2FC|gt;20的數據節點，有苯類化合物類2種，分別為3，4-二羥基苯甲酸、間苯三酚；脂質和類脂分子類3種，分別為癸酸、天竺葵酸、棕櫚油酸；有機酸及其衍生物類2種，分別為谷氨酸、環己基氨基磺酸1；有機氧化合物類5種，分別為利比醇、麥角糖、莽草酸、1，2-環己烷二酮4、戊二醛2；有機雜環化合物類2種，分別為5，6-二氫尿嘧啶1、吡咯-2-羧酸；其他類6種，分別為萘、腎上腺素2、蘇氨酸、3-己烯二酸、10-羥基癸酸、1，2，4-苯三醇。不同類代謝物在代謝通路中的相互轉化與調控。脂質和類脂分子類（紫色）與苯類化合物類（藍色）呈極顯著正相關；苯丙烷類化合物類（淺藍色）與有機氧化合物類（淺黃色）呈極顯著負相關。

2.6 生物標志物的代謝通路分析

生物體中的代謝反應依賴于基因和蛋白質的調控。全面分析代謝和調控通路，有利于了解代謝系統的變化規律[16]。采用京都基因與KEGG通路數據庫（http：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）結合Metabolite Mapping 擬合差異代謝物，通過KEGG注釋分析找到所有差異代謝物所參與的通路，進一步對代謝差異物進行代謝通路分析和篩選，找到與代謝物差異相關性最高的關鍵通路[17]。結果表明，NS和GS有36條途徑差異顯著，如圖7所示。根據-lnPgt;1且impact scoregt;0，最終篩選出10 條關鍵通路，分別是嘧啶代謝（pyrimidinemetabolism）、氰氨基酸代謝（cyanoamino acidmetabolism）、硫代謝（sulfur metabolism）、甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝（glycine/serine/threoninemetabolism） 、賴氨酸生物合成（lysinebiosynthesis）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（cysteineand methionine metabolism）、β - 丙氨酸代謝（β-alanine metabolism） 、谷胱甘肽代謝（glutathione metabolism）、牛磺酸和次牛磺酸代謝（taurine and hypotaurine metabolism）、磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway）。

2.7 差異代謝物的代謝途徑分析

代謝通路對于研究生物細胞內物質的代謝和生理過程有重要作用[18]。利用KEGG對差異代謝物所在通路進行檢索和調控互作網絡分析，結果（圖8）表明，篩選出的10條關鍵代謝通路中主要參與代謝通路的為甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、賴氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、6-磷酸葡萄糖酸內酯、葡萄糖酸、葡萄糖、果糖、3-磷酸甘油醛、檸檬酸、α-酮戊二酸和琥珀酸等。在種子發育過程中，淀粉、糖類和脂肪提供原料、構建骨架、提供能量，使種胚繼續發育至成熟；蔗糖、可溶性糖和還原糖參與呼吸過程，提供生長發育的原料和能量，在一系列酶的作用下水解成葡萄糖和果糖。葡萄糖經過糖酵解途徑生成6-磷酸葡萄糖，再經酶的作用生成丙酮酸。丙酮酸能轉化為乙酰CoA，從而進入三羧酸循環。乙酰CoA合成后可以參加的途徑很多，如可以合成膽固醇或者脂肪酸，可以進行酮體代謝，可以進入三羧酸循環生成眾多酸，其中部分酸參與氨基酸代謝。3-磷酸甘油醛能生成3-磷酸甘油，之后進入甘油磷脂代謝途徑。半胱氨酸是谷胱甘肽代謝、牛磺酸次牛磺酸代謝、甘氨酸絲氨酸和蘇氨酸代謝通路中的共有化合物，連接多個代謝途徑；其他的還有甘氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等。磷酸戊糖途徑的核糖可參與嘌呤代謝，繼續進入糖酵解或者三羧酸循環，提供核酸合成的原料與還原力。氰基氨基酸代謝、硫代謝、甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝、牛磺酸和次牛磺酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、谷胱甘肽代謝等這些途徑均相互聯系，說明這些代謝物可能通過甘氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等相互轉化。

3 討論

本研究共檢測到種子層積代謝產物995個，預處理后保留971個，經過匹配得到差異代謝物315個。通過NS與GS的比較，有125種代謝物存在顯著差異，說明NS與GS的代謝物存在顯著差異。進一步篩選出75種差異代謝物，有35種上調，40種下調。代謝通路分析得到老山芹種子NS和GS差異相關性最高的代謝通路有36條，篩選出其中10條關鍵代謝通路，分別為嘧啶代謝、氰基氨基酸代謝、硫代謝、甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、牛磺酸和次牛磺酸代謝、賴氨酸生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、磷酸戊糖途徑，這些通路為老山芹種子低溫發育提供了能量和代謝原料。

老山芹種子的休眠是由于種子存在后熟特性，是由種胚尚未發育完全和內源性抑制物質等因素共同引起的綜合性休眠[3]。通過層積處理，創造合適的種子萌發環境，促進種胚發育和貯藏物質的轉化，使種子完成后熟，即能使種子的休眠有效解除。劉舒婭[19]研究表明，磷酸戊糖途徑在老山芹種子發育中占主導地位。本研究也篩選到了磷酸戊糖途徑可能影響老山芹種子休眠。種胚在發育后期呼吸作用增強，隨著種胚進一步生長分化，種子呼吸轉變為磷酸戊糖途徑，種子休眠得到解除[20]。研究表明，嘌呤代謝和嘧啶代謝參與種子的萌發過程[21]，嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸可參與休眠種子核酸的合成、糖類代謝、脂質代謝和一些蛋白質前身的合成。甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、高絲氨酸等各類氨基酸在生物體受到外界脅迫時，可以互相轉化或者生成其他次級代謝產物，進行代謝平衡的調控。本研究發現，嘧啶代謝及甘氨酸、絲氨酸等各類氨基酸代謝在老山芹打破休眠中發揮重要作用。郝林華等[22?23]對小麥、黃瓜幼苗的培育表明，牛磺酸可促進幼苗生長，穩定細胞膜，但未見其在種子萌發時的具體作用。而本研究篩選到牛磺酸在打破種子休眠中發揮重要作用，推測可能是牛磺酸參與了蛋氨酸或半胱氨酸生成的谷胱甘肽代謝，具體原因有待進一步研究。張彩峽等[24]研究表明，氰基氨基酸代謝在多花黑麥草的抗旱性中發揮重要作用；祝山等[25]研究表明，氰基氨基酸代謝、磷酸戊糖等途徑上的差異表達基因與細胞壁上多糖的降解有關；王一衡等[26] 分析了大白菜中與花發育相關的miRNAs 靶基因，氰基氨基酸代謝通路上富集基因顯著。氰基氨基酸代謝與丙氨酸代謝、精氨酸代謝、硒化合物代謝等多個代謝途徑相聯系，它們之間的物質流動使得氰基氨基酸代謝在整個代謝網絡中具有重要作用。本研究也發現，氰基氨基酸代謝一定程度上影響種子萌發。牛磺酸和次牛磺酸代謝、硫代謝、谷胱甘肽代謝和氰基氨基酸代謝對休眠種子的作用還有待進一步研究。

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基金項目：國家自然科學基金項目（31801872）；山西省高等學校科技創新計劃項目（2022L459）； 山西大同大學人文社科項目（2022YGZX005）；大同市科技攻關項目（2020044） ；大同大學產學研項目（2020CXZ14）。