紫外線對栽培營養(yǎng)廢液的抑菌效應(yīng)及營養(yǎng)成分影響研究

摘要：為探究紫外線輻照對栽培營養(yǎng)廢液中尖孢鐮刀菌的抑菌效果以及營養(yǎng)成分的影響，以2種典型真菌即黃瓜和番茄專化型尖孢鐮刀菌為材料，采用1.3、2.7、3.8 mW·cm-2 3種輻照強(qiáng)度和1、3、5 min 3個(gè)輻照時(shí)間對營養(yǎng)廢液進(jìn)行滅菌試驗(yàn)。結(jié)果表明，在離體培養(yǎng)下，紫外線對2種病原真菌有明顯抑制效果，且隨著輻照劑量增加，菌絲生長緩慢，菌落形態(tài)皺縮，孢子生殖量及萌發(fā)率降低，在最高劑量1 140 mJ·cm-2（3.8 mW·cm-2、5 min）下實(shí)現(xiàn)100%抑菌率；同樣在接種營養(yǎng)液下最高劑量處理顯著抑制菌孢生長，殺滅率達(dá)到95%以上。經(jīng)最高劑量紫外輻照后2種營養(yǎng)液中有機(jī)物去除率分別為92.3%、83.3%，而全氮、全磷含量無明顯變化，表明紫外輻照在實(shí)現(xiàn)有效抑菌的同時(shí)易造成營養(yǎng)液中有機(jī)質(zhì)損失而影響其后續(xù)的循環(huán)利用。以上研究結(jié)果為紫外殺菌技術(shù)在設(shè)施園藝栽培循環(huán)系統(tǒng)的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫外輻射；營養(yǎng)廢液；尖孢鐮刀菌；抑菌作用；營養(yǎng)成分

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.1075

中圖分類號：S436.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1008?0864（2024）07?0166?08

營養(yǎng)廢液的循環(huán)利用是設(shè)施無土栽培和植物工廠發(fā)展的核心技術(shù)之一，與傳統(tǒng)土壤栽培相比，無土栽培可創(chuàng)造相對優(yōu)越的生長條件，但植物遭受病原菌、藻類等侵害的風(fēng)險(xiǎn)依然存在[1?2]，主要通過局部空氣傳播、雨霧淋溶、植物凋落物以及植物根系吸附等途徑侵入到營養(yǎng)液中，且極易在循環(huán)過程中迅速蔓延，嚴(yán)重影響植物正常生長[1， 3]。尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是世界性分布的典型土傳病原真菌，能導(dǎo)致上百種植物發(fā)生枯萎病[4]，致使植株葉片黃化萎蔫、莖稈萎縮褐變、組織壞死等[5?6]，且可在營養(yǎng)液中長期營養(yǎng)兼性寄生生長，普通藥劑難以根除。營養(yǎng)液循環(huán)使用有傳播植物病原體的風(fēng)險(xiǎn)，需要對營養(yǎng)液進(jìn)行消毒以去除這種風(fēng)險(xiǎn)[7]。

目前，國內(nèi)外針對營養(yǎng)廢液的殺菌重點(diǎn)集中在物理途徑。研究表明，連續(xù)臭氧曝氣處理營養(yǎng)液對細(xì)菌、真菌和藻類的殺滅率達(dá)90%以上，可有效抑制微生物滋生，同時(shí)可使植物增產(chǎn)37%[8]。適當(dāng)提高臭氧水平，延長處理時(shí)間能維持營養(yǎng)液臭氧水平平衡，減緩衰減速率，對多種病原真菌和細(xì)菌的殺滅效果接近100%，而過多的殘余臭氧易損害植株根系，傷害率可達(dá)22.2%[9]，當(dāng)遭受臭氧脅迫后丙二醛含量增多，自身通過促進(jìn)過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶的合成來提升抗性[10]，可見經(jīng)臭氧處理后的營養(yǎng)液不能立即用于植物栽培[9]。高溫滅菌主要通過高溫使病原微生物蛋白變性失活，細(xì)胞新陳代謝紊亂而死亡，殺菌徹底但存在設(shè)備能耗大及運(yùn)行成本投入高等缺點(diǎn)。有學(xué)者利用循環(huán)水加熱85 ℃停留3 min，或者95 ℃停留30 s以上，可使番茄尖孢鐮刀菌、煙草花葉病毒和根結(jié)線蟲迅速死亡[7]。宋衛(wèi)堂等[11]發(fā)現(xiàn)，消毒機(jī)采用75 ℃溫度加熱和90 s滯留時(shí)間保溫的殺菌組合，可對番茄萎蔫病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄細(xì)菌性青枯病菌達(dá)到100%殺滅率，但加熱后的營養(yǎng)液成分變化規(guī)律需進(jìn)一步研究。

紫外線在水處理技術(shù)領(lǐng)域作為重要的消毒方式之一，相比傳統(tǒng)殺菌方法，具有無化學(xué)藥劑投放、無消毒副產(chǎn)物、滅菌高效、易操作等特點(diǎn)[12]。紫外線消毒主要通過輻射水中微生物干擾細(xì)胞內(nèi)部核酸復(fù)制，病原菌發(fā)生致變性失活而喪失傳染性[13]。研究表明，紫外線輻照能有效殺滅真菌、細(xì)菌及藻類等[3， 14-17]，其消毒效果取決于紫外波長、輻射強(qiáng)度和輻射時(shí)間[14， 18]，輻射劑量越高，病原菌存活率越低，光復(fù)活能力越弱[19]，同時(shí)也易受溶液濁度的影響，濁度過高會導(dǎo)致懸浮顆粒中的病原菌難以被殺滅[3， 20]。目前，針對營養(yǎng)液中典型枯萎病菌的殺菌性能研究及營養(yǎng)成分的損耗評估較少，本研究以設(shè)施園藝無土栽培營養(yǎng)廢液為研究對象，開展不同紫外線輻照劑量對廢液中黃瓜和番茄專化型尖孢鐮刀菌的殺滅試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行紫外線對營養(yǎng)液中全氮、全磷和有機(jī)質(zhì)含量影響的追蹤試驗(yàn)，旨在為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料

供試病原菌包括黃瓜專化型尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporium f. sp. Cucumerinum，F(xiàn)OC）和番茄專化型尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum f.sp. Lycopersici， FOL），均購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保管中心。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1.0 L，用于培養(yǎng)2種尖孢鐮刀菌菌絲及其產(chǎn)孢。設(shè)施園藝黃瓜和番茄巖棉栽培營養(yǎng)液取自北京某設(shè)施園藝科技有限公司，4 ℃低溫冰箱中保存。

1.1.2 儀器與設(shè)備

主要采用由廣州百豐環(huán)保科技有限公司生產(chǎn)的BF-GJ-L100能量密度顯示紫外線消毒殺菌設(shè)備。紫外消殺設(shè)備內(nèi)安裝有紫外線消毒燈、能量密度分級控制開關(guān)和顯示指示表、以及時(shí)間繼電器計(jì)時(shí)器等，紫外線消毒燈是低壓汞蒸氣放電燈，通過石英管狀玻璃外殼照射253.7 nm的C波段紫外線。

試驗(yàn)儀器包括立式自動壓力蒸汽滅菌鍋（GR60DA，廈門致微儀器有限公司）、恒溫培養(yǎng)振蕩儀（THZ-103B，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、超凈工作臺（BSC-1004，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、光學(xué)顯微鏡（BX51，日本奧林巴斯有限公司）、紫外分光光度計(jì)（DR 6000 型，美國HACH公司）、血球計(jì)數(shù)板（XB-K-25，上海市求精生化試劑儀器有限公司）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸浮液制備

尖孢鐮刀菌在無菌操作下接種至PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d，向產(chǎn)孢的培養(yǎng)皿中加入4～5 mL無菌水洗脫孢子，充分振蕩后經(jīng)紗布過濾去除菌絲制成孢子懸液，利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，將孢子含量調(diào)至104數(shù)量級，備用。

1.2.2 紫外線照射對菌絲生長的影響試驗(yàn)

配制PDA培養(yǎng)基，滅菌后制作平板，將致病菌菌種分別接入PDA平板，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)120 h，待菌絲長滿平板后，用直徑5 mm的打孔器從菌落邊緣切取菌餅接入PDA培養(yǎng)基中央，分別放入紫外線消殺設(shè)備箱中滅菌。

紫外線照射劑量（mJ·cm-2）為照射強(qiáng)度（mW·cm-2）與照射時(shí)間（s）的乘積。為確定不同紫外線照射劑量下最佳的滅菌參數(shù)，以2種尖孢鐮刀菌菌種為材料，選用1.3（U1.3）、2.7（U2.7）、3.8 mW·cm-2（U3.8）3個(gè)不同紫外照射強(qiáng)度（U）和1（T1）、3（T3）和5 min（T5）3個(gè)照射時(shí)間（T）進(jìn)行三因素試驗(yàn)，以未做紫外線照射處理作為對照（CK），每處理接3皿，每皿1塊，培養(yǎng)96 h后，采用十字交叉法測量菌落直徑，并計(jì)算尖孢鐮刀菌孢子生長抑制率[21]。

抑制率=（對照菌落直徑- 處理菌落直徑／對照菌落直徑）×100%（1）

1.2.3 紫外線照射對孢子萌發(fā)的影響試驗(yàn)

無菌操作下，分別吸取10 mL備用的孢子懸液于培養(yǎng)皿中，經(jīng)過不同紫外線照射劑量處理后，吸取100 μL懸液于PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)96 h，記錄菌落數(shù)量；同時(shí)吸取100 μL照射處理后孢子懸浮液接種至PDA平板中央，迅速均勻涂開。28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，顯微鏡觀察并記錄孢子萌發(fā)數(shù)[22]。重復(fù)3次。

孢子萌發(fā)率= 萌發(fā)孢子數(shù)／鏡檢孢子總數(shù)×100% （2）

1.2.4 紫外線照射對營養(yǎng)液的殺菌效果及營養(yǎng)成分的影響試驗(yàn)

取循環(huán)使用10 d無土栽培的番茄和黃瓜營養(yǎng)液，無菌操作下分別按照孢子懸液與營養(yǎng)液的體積比1∶9的比例混合接入錐形瓶中，28 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。吸取10 mL混合營養(yǎng)液于培養(yǎng)皿中，經(jīng)過不同紫外線照射劑量處理后，搖勻，吸取100 μL懸液于PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)96 h，采用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法計(jì)算滅菌前后的菌落數(shù)；同時(shí)通過研究余液滅菌前后全氮（total nitrogen， TN）、全磷（total phosphorus， TP）和有機(jī)質(zhì)含量，來確定最佳消毒參數(shù)，以達(dá)到營養(yǎng)元素利用最大化的目的。

1.3 樣品采集與測定

營養(yǎng)廢液經(jīng)紫外線照射后采集余液樣品，測定有機(jī)質(zhì)、全氮和全磷含量，各指標(biāo)均采用HACH快速測定法。樣品中加入HACH專用試劑反應(yīng)，經(jīng)HACH專用試劑消解（DRB200，COD快速消解儀，HACH Company，USA；溫度穩(wěn)定性±2 ℃）后，通過紫外可見光分光光度計(jì)（DR 6000，波長分辨率0.1 nm）測定含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2019、Excel 2010 和SPSS 24.0進(jìn)行圖表處理并統(tǒng)計(jì)分析。采用最小顯著性差異法檢驗(yàn)處理間差異的顯著性水平（Plt;0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線照射對尖孢鐮刀菌落生長的影響

紫外線照射對黃瓜和番茄專化型尖孢鐮刀菌落生長均有顯著的抑制作用，當(dāng)紫外線照射劑量增加，菌落直徑逐漸減小，表明其抑制效應(yīng)增強(qiáng)（圖1）。隨著紫外線照射強(qiáng)度和時(shí)間增加，F(xiàn)OC和FOL菌落直徑減小、生長速率降低，均在U3.8×T5互作處理下表現(xiàn)出最明顯抑制效果。與U1.3×T1 相比，F(xiàn)OC 和FOL 菌落直徑分別減小23.2%、26.7%，生長速率分別下降26.3%、33.3%（圖2），且紫外強(qiáng)度和時(shí)間的交互作用對菌落生長影響不顯著。以上說明紫外線照射能有效抑制尖孢鐮刀菌的生長，且照射劑量越多，抑菌效果越好。

2.2 紫外線照射對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響

紫外線照射對黃瓜和番茄專化型尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量均有顯著抑制作用（表1、2）。隨著紫外線照射劑量的增加，F(xiàn)OC和FOL的產(chǎn)孢量顯著減少（Plt;0.05），當(dāng)紫外線照射劑量達(dá)到684 mJ·cm-2（U3.8×T3）以上時(shí)，孢子萌發(fā)數(shù)量明顯降低，抑制率可達(dá)90%以上。而當(dāng)紫外線照射強(qiáng)度3.8 mW·cm-2、時(shí)間5 min 時(shí)，產(chǎn)孢量為0，完全抑制了孢子萌發(fā)。在紫外線照射強(qiáng)度和時(shí)間的交互作用下，2種病原菌的產(chǎn)孢量和萌發(fā)率差異顯著，且與FOC 相比，F(xiàn)OL產(chǎn)孢量和萌發(fā)率均略高，可能其對紫外脅迫具有一定的耐受性。

2.3 紫外線照射對營養(yǎng)液的殺菌效果及營養(yǎng)成分的影響

紫外線照射對接種到設(shè)施栽培營養(yǎng)液中的尖孢鐮刀菌產(chǎn)生顯著的抑制效果（表3、4）。隨著紫外照射劑量的增加，F(xiàn)OC和FOL的產(chǎn)孢量呈顯著下降趨勢（Plt;0.05），當(dāng)紫外線照射劑量達(dá)到1 140 mJ·cm-2（U3.8×T5）時(shí)，2種病原菌的產(chǎn)孢量最低，抑菌率分別為99.2%、95.5%，顯著抑制孢子生長。在紫外線照射強(qiáng)度和時(shí)間的交互作用下，2 種病原菌的產(chǎn)孢量和抑菌率差異顯著，且與FOC相比，F(xiàn)OL產(chǎn)孢量較高，而抑菌率較低，進(jìn)一步表明不同病原菌對紫外脅迫具有不同的耐受性。

為進(jìn)一步明確紫外線照射對營養(yǎng)液在循環(huán)使用過程中營養(yǎng)組分產(chǎn)生的影響，測定了接種2種病原菌的營養(yǎng)液中全氮、全磷和有機(jī)質(zhì)含量。結(jié)果表明，隨著紫外照射劑量的增加，處理間的全氮、全磷含量無顯著差異（圖3），而有機(jī)質(zhì)含量呈逐漸下降的趨勢，在最高劑量（U3.8×T5）下有機(jī)質(zhì)含量最低，與U1.3×T1相比，F(xiàn)OC和FOL營養(yǎng)液中有機(jī)質(zhì)含量分別降低了92.3%、83.3%。由此表明，紫外線照射可能對營養(yǎng)液中有機(jī)質(zhì)有明顯的降解效果，而對全氮、全磷含量無影響。

3 討論

通過抑制病原菌菌絲生長及改變其菌絲形態(tài)和細(xì)胞膜通透性可實(shí)現(xiàn)侵害的有效防治[22]，紫外線輻射對真菌生長具有顯著抑制效果。張瑋等[21]利用短波紫外線輻照灰葡萄孢發(fā)現(xiàn)，紫外線能增強(qiáng)細(xì)胞膜滲透性，加快孢內(nèi)物滲出，降低菌絲總糖和可溶性蛋白質(zhì)含量，最終通過影響能量代謝相關(guān)酶活性大小來抑制細(xì)胞生長，大幅減小菌落直徑。本試驗(yàn)中，隨著紫外線照射強(qiáng)度和時(shí)間的增加，F(xiàn)OC和FOL病原菌菌落直徑均明顯減小，菌絲生長受到抑制。尖孢鐮刀菌能誘發(fā)真菌類枯萎病，其菌絲生長、孢子萌發(fā)和生殖情況是評價(jià)病害蔓延的重要依據(jù)，通過阻斷病菌任何一個(gè)生長階段都有實(shí)現(xiàn)抑制病害發(fā)生的可能性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，增加紫外線輻照劑量，F(xiàn)OC和FOL的產(chǎn)孢量和萌發(fā)率大大降低，在最高劑量1 140 mJ·cm-2下完全殺滅病菌，這與宗兆鋒等[23]的結(jié)論一致。專化型尖孢鐮刀菌的抑制作用不僅體現(xiàn)在離體試驗(yàn)中，營養(yǎng)液實(shí)際接種試驗(yàn)的結(jié)果也能進(jìn)一步證實(shí)紫外線抑菌效果。本試驗(yàn)中，增加紫外線輻照劑量，營養(yǎng)液中的孢子總量大幅減少，抑菌率明顯增加，在最高劑量1 140 mJ·cm-2下FOC和FOL的殺滅率達(dá)到95%以上，這與劉向輝等[3]、宋衛(wèi)堂等[15]報(bào)道的紫外輻照對無土栽培循環(huán)營養(yǎng)液中的枯萎病菌實(shí)現(xiàn)100%殺滅率的結(jié)論類似。因此，采取紫外線對設(shè)施園藝栽培營養(yǎng)液中菌絲生長、孢子萌發(fā)和生殖進(jìn)行的滅菌方式是行之有效的。

無土栽培循環(huán)營養(yǎng)液為植物生長提供主要的碳源、氮源，而紫外線滅菌技術(shù)利用光催化產(chǎn)生氧化性極強(qiáng)的羥基自由基（·OH），使難分解的大分子有機(jī)質(zhì)氧化成CO2、H2O 及其他小分子物質(zhì)[12]。本研究顯示，紫外線輻射劑量增加，營養(yǎng)液中有機(jī)質(zhì)含量呈逐漸降低的變化趨勢，而全氮、全磷含量無明顯變化。這與Hao等[24]利用15W紫外燈照射高原污水0.5 min達(dá)到最優(yōu)的有機(jī)質(zhì)30.8% 去除率的結(jié)果類似。通過紫外組合工藝，加大輻射強(qiáng)度能增加強(qiáng)氧化基團(tuán)在溶液中的含量，繼而引發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)生，分解廢水中有機(jī)物的速率加快[25-27]。紫外線輻射可降低總氮和NH4+-N 的含量，在一定程度上抑制反硝化菌群，促進(jìn)硝化細(xì)菌的生長繁殖，轉(zhuǎn)化NH4+-N和NO3--N的氮素形態(tài)來實(shí)現(xiàn)脫氮效果[24， 28]。同時(shí)利用紫外輻射也可強(qiáng)化活性污泥除磷性能，去除4%～8%的總磷量，主要通過殺死或抑制除磷菌屬的營養(yǎng)物質(zhì)競爭菌群與非聚磷菌群，優(yōu)化聚磷菌屬的生長環(huán)境，增加有除磷能力的革蘭氏陽性菌和Nessier 染色陽性菌屬，增強(qiáng)活性污泥的除磷效果[24， 28?29]。本試驗(yàn)中，紫外線輻射后營養(yǎng)液的全氮、全磷含量并未發(fā)生變化，可能是相對于污泥廢水，無土栽培營養(yǎng)液成分較單一，其平均碳氮比（C/N）為0.066，僅占尤俊豪等[28] 研究中污水C/N的52%，缺少碳源嚴(yán)重影響微生物菌群活力，弱化脫氮除磷能力。

通過紫外線對設(shè)施園藝無土栽培營養(yǎng)液殺滅效果的研究，病原菌滅活是由其所接受的紫外劑量決定的，通過完全隨機(jī)試驗(yàn)確定了最佳的消毒水平組合，即在一定經(jīng)濟(jì)效益條件下，輻射強(qiáng)度越大滯留時(shí)間越長殺滅效果越好。另外，由于高強(qiáng)度長時(shí)間的持續(xù)消毒會使?fàn)I養(yǎng)液中有機(jī)質(zhì)含量大幅下降，存在碳源不足無法維持植物后續(xù)生長的可能性，因此為確保生長營養(yǎng)需求，在營養(yǎng)液循環(huán)使用中需要補(bǔ)加一定量有機(jī)質(zhì)。

參 考 文 獻(xiàn)

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基金項(xiàng)目：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院都市農(nóng)業(yè)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)所級統(tǒng)籌項(xiàng)目（S2022002）；國家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-36）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（ASTIP-IUA-2022001）。