苗藥艾納香揮發油提取工藝優化及不同產地的品質評價

【摘 要】 目的：優化艾納香揮發油提取工藝并對5個不同產地10個采集點的栽培及野生艾納香揮發油主要品質指標進行初步評價。方法：采用超聲輔助水蒸氣蒸餾法，通過正交實驗提取艾納香揮發油，以提取溫度、提取時間、藥材粉碎度、浸泡時間、料液比、超聲時間為考察指標，揮發油提取率為評價指標；采用氣相色譜法（GC）對艾納香揮發油進行含量測定及成分分析。結果：揮發油最佳提取溫度為115℃、提取時間為3 h、藥材粉碎度為3號篩（50目）、浸泡時間為1 h、料液比為1∶[KG-*3/5]16（g∶[KG-*3/5]mL）、超聲為20 min；野生和栽培艾納香在揮發油含量上無顯著差異，栽培藥材提取的艾納香揮發油中L-龍腦、β-蒎烯、芳樟醇、β-石竹烯的含量均高于野生艾納香揮發油中的含量。結論：所建立的揮發油提取工藝穩定可行，人工種植艾納香揮發油質量優于野生艾納香揮發油。

【關鍵詞】 艾納香；水蒸氣蒸餾法；超聲輔助；正交試驗；品質

【中圖分類號】R927.2

【文獻標志碼】 A""" 【文章編號】1007-8517（2024）14-0014-08

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.14.zgmzmjyyzz202414004

Optimization of Extraction Process of Volatile Oil from Miao Medicine Blumea balsamifera and

Quality Evaluation of Different Producing Areas

WANG Mingshu1 WANG Keke1 ZHANG Wenlong1* LONG Youlin2

DU Fuqiang3 MAO Chunmao1 LI Hongfeng1 WU Xiangli1

1.College of Pharmacy， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China；

2.Guizhou Fengtai Agricultural Development Co Ltd.，Ceheng 552204，China；

3. Guizhou Weimen Pharmaceutical Co Ltd.， Guiyang 550014，China

Abstract：Objective To optimize the extraction process of volatile oil from Blumeabalsamifera and preliminarily evaluate the main quality indexes of volatile oil from cultivated and wild Blumea balsamifera in 10 collection points from 5 different producing areas.Methods Ultrasonic-assisted steam distillation was used to extract the volatile oil from Blumea balsamifera by orthogonal experiment. The extraction temperature， extraction time， grinding degree of medicinal materials， soaking time， solid-liquid ratio and ultrasonic time were used as the indexes， and the extraction rate of volatile oil was used as the evaluation index. The content and composition of volatile oil from Blumea balsamifera were determined by gas chromatography （GC）.Results The optimum extraction temperature of volatile oil was 115°C， the extraction time was 3 h， The crushing degree of medicinal materials was No.3 sieve （50 mesh ）.The soaking time was 1 h， the ratio of material to liquid was 1∶[KG-*3/5]16 （g∶[KG-*3/5]mL ）， and the ultrasonic time was 20 min. There was no significant difference in the content of volatile oil between wild and cultivated Blumea balsamifera. The contents of L-borneol， β-pinene， linalool and β-caryophyllene in the volatile oil extracted from cultivated Blumea balsamifera were higher than those in the wild Blumea balsamifera. Conclusion The established extraction process of volatile oil is stable and feasible， and the quality of volatile oil from cultivated Blumea balsamifera is better than that of wild Blumea balsamifera.

Key words：Blumea balsamifera;Steam Distillation;Ultrasonic Assisted;Orthogonal Test;quality

艾納香Blumea balsamifera （L.）DC.又名大風艾、冰片艾、馬耳艾，為菊科艾納香屬多年生草本或灌木植物［1］，首載于《開寶本草》，是貴州省少數民族地區知名藥材［2］。我國主產于貴州、廣東、云南、廣西等低海拔河谷地區［3］。貴州的黔南州羅甸及黔西南州冊亨、望謨等地廣泛分布有野生及栽培艾納香，品種豐富多樣，是艾納香的道地產區。艾納香的品質指標主要是艾片和艾納香揮發油［4］，艾片是艾納香提取加工的主要產物，開發應用較為成熟；艾納香揮發油是艾片提取時經壓榨分離而得到的副產物，由《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》（2019版）收錄。研究［5-7］表明艾納香揮發油是艾納香的重要藥效部位，具有抑菌、抗癌、抗氧化、促進傷口愈合等多方面的藥理活性，在醫藥、化妝及保健行業具有廣闊的應用前景。

目前艾納香揮發油的提取方法主要有頂空固相微萃取法、超臨界CO2萃取法、水蒸氣蒸餾法等，不同方法所提取出的艾納香揮發油收率、化學成分的種類及含量有一定的差異［8］。頂空固相微萃取法、超臨界CO2萃取法等新技術能顯著提高艾納香揮發油的提取率，攻破傳統方法提取率低的難題，但因成本高、設備昂貴、操作復雜及工藝化生產程度低等原因具有較大局限性而無法廣泛應用。水蒸氣蒸餾法具備操作簡單、成本低、管理方便等優點，但提取率相對較低，耗時較長，故選擇適合的工藝提取艾納香揮發油至關重要。實驗將采用超聲輔助水蒸氣蒸餾法進一步優化艾納香揮發油提取工藝，對人工種植基地及野生艾納香揮發油進行多成分多指標的初步評價，以期為工業化提取艾納香揮發油、資源合理評價、高油品種的選育以及推動民族藥納入藥典提供參考依據。

1 材料與儀器

1.1 藥材 艾納香藥材由課題組人員于2022年10月下旬前往主產區冊亨、望謨、羅甸采集獲得（見表1），每個產地均采集有野生和栽培艾納香，所有藥材均經過貴州中醫藥大學藥學院張文龍教授鑒定為菊科植物艾納香［Blumea balsamifera （L.） DC.］。

1.2 儀器 Agilent 7890b氣相色譜儀（HP-5毛細管柱30 m×0.25 mm，0.25 μm），ZG-TP203電子天平（武義珠恒電子有限公司）；SXKW數顯控溫電熱套（北京市永光明醫療儀器有限公司）；GB/T 30385-2013揮發油提取器（天長市慶宇實驗設備有限公司）；DLH-500A粉碎機（武義祺騰電器有限公司）；Agilent 7890b 氣相色譜儀、G4513A自動進樣器、溫度計、3000 mL三頸圓底燒瓶、1500 mL燒杯、編織篩、3 m長水管等。

1.3 材料 β-石竹烯（純度95%），北京索萊寶科技有限公司；樟腦、水楊酸甲酯、花椒油素（純度98%），北京索萊寶科技有限公司；L-龍腦、β-蒎烯、芳樟醇（純度98%），四川萃益潤生物科技有限公司；高純氮氣（純度99.999%），重慶瑞信氣體有限公司；乙酸乙酯，色譜純。

2 實驗方法

2.1 艾納香揮發油提取 參照2020年版《中華人民共和國藥典》（4部）通則“2204”項下揮發油測定法并輔助超聲提取艾納香揮發油，以料液比（A）、浸泡時間（B）、提取時間（C）、加熱裝置提取溫度（D）、粉碎度（E）、超聲時間（F）作為考察因素，以艾納香揮發油提取率為指標，采用L25（56）正交實驗對艾納香揮發油提取工藝進行優化。計算艾納香揮發油提取率，每個艾納香樣品平行提取3次后取平均值。

2.2 艾納香揮發油品質指標的測定

2.2.1 內標溶液制備 精密稱取水楊酸甲酯適量，置于100 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度為10.0012 mg/mL的內標溶液。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取β-蒎烯、芳樟醇、樟腦、L-龍腦、β-石竹烯、花椒油素對照品適量，分別加于10 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，制成質量濃度分別為1.665 mg/mg、1.0065 mg/mL、1.0565 mg/mL、0.9865 mg/mL、2.0390 mg/mL、1.0105 mg/mL 的溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取艾納香揮發油100 mg，置于20 mL容量瓶中，精密加入上述內標溶液2 mL，加乙酸乙酯定容至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.4 色譜條件 進樣量1 μL，程序升溫：初始溫度100℃，以100℃/min升溫至150℃，保持1 min，以200℃/min升溫至240℃，保持6 min；檢測器：氫火焰離子檢測器；檢測器溫度：240℃；進樣口溫度：240℃；載氣：高純氮氣。流速：0.5 mL/min；進樣量1 μL；進樣分流比：30∶[KG-*3/5]1。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 分別取“2.2.1、2.2.2、2.2.3”項下內標溶液、對照品溶液、供試品溶液、空白溶液，按“2.2.4”項下色譜條件進行測定。試驗條件下β-蒎烯、芳樟醇、樟腦、L-龍腦、β-石竹烯、花椒油素與內標物（水楊酸甲酯）分離度良好，分離度大于1.5，空白對照溶液對測定無干擾。

2.3.2 線性關系考察 精密量取“2.2.2”項下對照品儲備液0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.25 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL，分別置20 mL量瓶中，再加2 mL內標溶液，加乙酸乙酯稀釋并定容取適量，按“2.2.4”項下色譜條件進項測定，記錄峰面積。以各對照品與內標物的濃度比為橫坐標（x），峰面積比為縱坐標（y），進行線性回歸，詳見表3。

2.3.3 精密度考察 取“2.2.2”項下對照品適量，用乙酸乙酯稀釋后，按“2.2.4”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。計算對照品β-蒎烯、芳樟醇、樟腦、L-龍腦、β-石竹烯、花椒油素峰面積與內標物的峰面積比的RSD分別為0.61%、1.43%、0.50%、1.03%、0.57%、1.13%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性考察 取同一批艾納香揮發油樣品6份，每份100 mg，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定。記錄峰面積并計算各成分含量，計算β-蒎烯、芳樟醇、樟腦、L-龍腦、β-石竹烯、花椒油素含量的RSD分別為1.97%、1.70%、1.78%、1.62%、1.84%、2.25%，表明本方法重復性良好。

2.3.5 穩定性考察 取“2.2.3”項下供試品溶液適量，分別在0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h按 “2.2.4”項下條件進樣測定，記錄峰面積，計算β-蒎烯、芳樟醇、樟腦、L-龍腦、β-石竹烯、花椒油素與內標物的峰面積比的 RSD分別為1.56%、1.05%、0.99%、1.03%、2.47%、1.12%，表明儀器穩定良好。

2.3.6 加樣回收率考察 取已知含量的艾納香揮發油，精密稱定艾納香揮發油50 mg，6份，分別置10 mL量瓶中，每組分別精密加入一定量的對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。β-蒎烯、芳樟醇、樟腦、L-龍腦、β-石竹烯、花椒油素RSD分別為0.88%、1.22%、0.85%、0.68%、0.75%、1.70%，表明該方法準確度良好。

2.4 樣品的測定 精密稱定各批次艾納香油100 mg，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，每批次平行測定3份。

2.5 數據處理 采用Excel 2010、Origin 21.0等軟件對實驗數據進行整理和作圖，采用SPSS26.0進行方差分析。

3 結果與分析

3.1 艾納香揮發油提取工藝 優化結果由表4可知，艾納香揮發油提取率的影響因素大小依次為提取溫度＞藥材粉碎度＞浸泡時間＞超聲時間＞料液比＞提取時間；溫度對艾納香揮發油的提取率影響最大，提取時間的影響最小。提取溫度和藥材粉碎度對揮發油提取率的影響極為顯著（P＜0.01），浸泡時間和超聲時間對揮發油提取率有顯著性影響（P＜0.05），料液比、提取時間對揮發油提取率無顯著性影響（P＞0.05）。艾納香揮發油最優提取工藝為A4B1C3D5E5F3，即料液比為1∶[KG-*3/5]16（g∶mL）、浸泡時間為1 h、提取時間為3 h、提取溫度為115℃、超聲時間20 min、藥材粉碎度過3號篩（50目）。

3.2 驗證性實驗 精密稱定3份粉碎過三號篩的艾納香藥材100 g，按上述最優提取工藝提取艾納香揮發油。結果顯示，揮發油提取率分別為0.415%、0.396%、0.399%，平均提取率為0.403%（RSD=2.53%，n=3），數據表明優化所得的艾納香揮發油提取工藝穩定、可行，具有實際應用意義。

3.3 5產地10個采集點艾納香揮發油品質指標評價

3.3.1 不同采集點艾納香揮發油的提取率比較 從圖1可以看出，5個人工栽培地中，望謨縣和亭村栽培基地的提取率最低，為0.32%，望謨縣從丈村栽培基地艾納香揮發油提取率最高，為0.51%；望謨縣從丈村與冊亨縣平華村、望謨縣和亭村、羅甸縣交朝村三個基地艾納香揮發油含量存在明顯差異（P＜0.05）。從圖2可以看出，5個野生采集點中，以望謨縣從丈村野生艾納香揮發油提取率最高，為0.42%，羅甸縣交朝村野生艾納香提取率最低，為0.27%；望謨縣從丈村與冊亨縣平華村野生艾納香揮發油提取率無顯著差異，與望謨縣和亭村、望謨縣芭蕉坪、羅甸縣交朝村存在顯著差異（P＜0.05）。從每個產地野生和栽培品的對比發現，平華村、和亭村野生艾納香提取率均高于栽培品，兩村的野生與栽培品艾納香揮發油提取率不存在顯著性差異（P＞0.05）；從丈村、芭蕉坪、交朝村栽培品揮發油提取率均高于野生艾納香，其中從丈村、芭蕉坪野生與栽培品艾納香揮發油提取率不存在顯著性差異（P＞0.05），交朝村野生與栽培品艾納香揮發油提取率差異較為顯著（P＜0.05）。

3.3.2 不同采集點艾納香揮發油活性成分比較 表6的測定結果表明，5個產地艾納香揮發油中均含有L-龍腦、β-蒎烯、芳樟醇、樟腦、花椒油素、β-石竹烯6種成分，各成分含量存在較大的差異。6種成分中以花椒油素的含量最高，β-蒎烯含量最低。L-龍腦含量介于1.59%～33.91%，變異系數為64.04%，以A7采集點的L-龍腦含量最高為33.91%，A1采集點的L-龍腦含量最低為1.59%，A1、A3、A5、A7之間均存在顯著差異（P＜0.05），A2、A3、A4、A10之間無顯著差異（P＞0.05），且A1、A7與之間A2、A3、A4、A10之間存在顯著差異；β-蒎烯含量介于0.03%～0.15%之間，變異系數為77.36%，A7采集點的β-蒎烯含量最高為0.15%，A1、A2、A6采集點β-蒎烯含量最低為0.03%，A6、A7采集點與其他采集點存在顯著差異（P＜0.05）；芳樟醇含量介于0.09%～0.21%之間，變異系數為37.84%，A5采集點芳樟醇含量最高為0.21%，A1采集點最低為0.09%，A3、A5、A9之間差異不明顯，A5與A1、A2、A4、A6、A8、A10之間存在顯著性差異（P＜0.05）；樟腦含量介于0.04%～1.35%之間，變異系數為196.88%，A2采集點樟腦含量最高為1.35%，A1采集點含量最低為0.04%， A2采集點與其他采集點均存在顯著性差異（P＜0.05）；花椒油素含量介于9.01%～43.41%之間，變異系數為56.95%，A1采集點的花椒油素含量最高為43.41%，A7采集點的含量最低為9.01%，其中A1、A7、A9與其他采集點之間存在顯著性差異（P＜0.05），A1、A6、A8采集點之間，A2、A4、A10采集點之間差異不顯著；β-石竹烯含量介于5.32%～13.32%之間，變異系數為36.06%，A10采集點β-石竹烯含量最高為13.32%，A3采集點最低為5.32%，其含量在11個采集點中有一定差異，但未達到顯著水平（P＞0.05）。

4 討論

4.1 艾納香揮發油提取工藝優化 水蒸氣蒸餾法為揮發油類藥材常用的提取方法，使用較為廣泛［9］。賈盟盟、郝文鳳等［10-11］采用水蒸氣蒸餾法提取藥材艾納香中的揮發油，提取率分別為0.28%、0.13%，王遠輝［12］通過水蒸氣蒸餾法-擠壓法提取艾納香揮發油得率為0.19%，高月［13］采用水蒸氣蒸餾法并考察料液比、提取溫度等4個因素對艾納香揮發油提取率的影響，其提取率為0.184%。近幾年，超聲輔助水蒸氣蒸餾法逐漸用于揮發油的提取。超聲輔助法以化學效應、熱效應等為主，促進目標分子快速從載體上分離［14］。該法能顯著提高揮發油的得率和質量，同時縮短提取時間［15］。華燕青［15］、潘紅亮等［16］對超聲輔助蒸餾法和直接水蒸氣蒸餾法提取植物揮發油進行比較，發現超聲輔助提取法所得揮發油提取率高于水蒸氣蒸餾法；魏姜勉［17］對花椒籽揮發油進行工藝優化，發現超聲輔助能顯著提高花椒籽揮發油提取率，且在提取過程中提取物的結構未被破壞。上述研究表明，超聲輔助法明顯優于直接水蒸氣蒸餾法。本實驗采用超聲輔助水蒸氣蒸餾法對艾納香揮發油進行提取，經正交試驗優化后艾納香揮發油提取率達到0.403%（n=3，RSD=2.53%），同上述直接水蒸氣蒸餾法相比，揮發油得率有了顯著提高。實驗發現，提取溫度和藥材粉碎度對揮發油提取率的影響極顯著（P＜0.01），當提取溫度為95℃時，因提取溶劑在此溫度下并未達到其沸點，幾乎無艾納香揮發油隨水蒸氣揮發出，提示在工業大批量生產過程中可適當提高其提取溫度，建議可保持在115℃左右；最佳的藥材粉碎度是藥材粉末過三號篩（50目），粉碎至此的艾納香藥材明顯比粗剪后葉片的揮發油提取率要高，在工業生產中多將艾納香葉片直接切碎成小片很難能達到此細度［18］，不能完全的提取艾納香揮發油，提示在工業大生產中盡可能地粉碎藥材。

本實驗在前人的基礎上增加了超聲輔助提取并進行6因素考察，一定程度上有效地提高了艾納香揮發油的提取率，可應用于艾納香揮發油提取的實際工業生產中。其次，本實驗采用蒸餾水作為提取溶劑，避免有機溶劑對艾納香揮發油產生污染，很大程度上確保了實驗操作的安全性和環保性。本法具備成本低、操作簡單、安全可靠等特點，可以廣泛地投入到提取艾納香揮發油的工業大生產中。

4.2 不同提取方式和來源的艾納香揮發油的品質比較 艾納香揮發油化學成分復雜多樣，各成分含量差異也較大［19］；本實驗提取后的艾納香揮發油中主要成分含量由高到低依次為花椒油素＞L-龍腦＞β-石竹烯＞樟腦＞芳樟醇＞β-蒎烯，花椒油素平均含量為25.32%，L-龍腦平均含量為17.71%，β-蒎烯的含量最低為0.06%。多項研究認為［20-22］，采用超臨界CO2萃取艾納香揮發油中L-龍腦作為主要活性成分，其含量高于其他活性成分，這與本實驗所得結果有一定的偏差，可能是超聲使植物細胞壁破裂導致花椒油素的溶出增加有關，說明提取方式和工藝不同對艾納香揮發油活性成分的種類及含量有一定的影響。同時，鑒于艾納香揮發油中花椒素油的含量較為豐富，后期可對該類成分開展進一步的研究，探討是否可將花椒油素作為艾納香揮發油質量評價的指標成分之一，對于進一步完善地標具有較大的意義。

關于栽培和野生艾納香艾片提取率及成分比較已有相關研究，但對于栽培和野生艾納香揮發油的比較研究鮮有報道。本次研究發現，栽培和野生艾納香揮發油平均提取率分別為0.39%、0.36%，數值較為接近，似乎表明艾納香揮發油并不像提取艾片那樣，栽培與野生品有較大的差距，今后研究中需要采集更多的產地樣品開展論證。從艾納香揮發油的主要活性成分來看，栽培和野生品的L-龍腦平均含量分別為21.53%、13.93%，β-蒎烯含量分別為0.08%、0.05%，芳樟醇含量分別為0.16%、0.12%，樟腦含量分別為0.24%、0.35%，β-石竹烯含量分別為10.94%、10.27%，花椒油素含量為21.97%、30.40%。栽培品中揮發油中的L-龍腦、β-蒎烯、芳樟醇、β-石竹烯含量均高于野生品揮發油中的含量，這或許與規范化種植過程增施底肥和中耕除草有一定關聯，有待于進一步研究。

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（收稿日期：2023-10-28 編輯：劉 斌）