HPLC法測定雪地茶中鱗片衣酸和羊角衣酸的含量

【摘 要】 目的：建立高效液相色譜法（HPLC）同時測定雪地茶中2種縮酚酸（鱗片衣酸、羊角衣酸）含量的方法。方法：采用Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）色譜柱，乙腈（A）-0.075%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～40 min， 35% A→55% A；40～41 min， 55% A→100% A；41～49 min， 100% A；49～60 min， 100% A→35% A），流速為1.0 mL·min-1，檢測波長213 nm，柱溫40℃，進樣量10 μL。結(jié)果：鱗片衣酸在0.15～0.55 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=1），方法的平均回收率為94.15%，RSD為0.21%（n=6）。羊角衣酸在0.05～0.55 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.9997），方法的平均回收率為97.83%，RSD為0.16%（n=6）。結(jié)論：建立的該含量測定方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性和分離度好，可用于同時測定雪地茶中兩種縮酚酸的含量，為雪地茶藥材的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)，對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立具有一定的參考意義。

【關(guān)鍵詞】 雪地茶；高效液相色譜法；鱗片衣酸；羊角衣酸；含量測定

【中圖分類號】R284.2

【文獻標(biāo)志碼】 A""" 【文章編號】1007-8517（2024）14-0028-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.14.zgmzmjyyzz202414006

Quantitative Determination of Squamatic Acid and Baeomycesic Acid in Thamnolia subuliformis by HPLC

YUAN Yirong* Minjae Kim Joonho Lee Yoojae Maeng

Shanghai R amp; D Center， LG Household amp; Health Care， Ltd.， Shanghai 200233， China

Abstract：Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of two depsides in Thamnolia subuliformis （Ehrh.） W.L.Culb..Methods With squamatic acid （SA） and baeomycesic acid （BA） as the reference compounds， HPLC method was performed on an Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） column.Acetonitrile （A）-0.075% phosphoric acid in water （B） was used as gradient mobile phase （elution： 0～40 min， 35% A→55% A; 40～41 min， 55% A→100% A; 41～49 min， 100% A; 49～60 min， 100% A→35% A）.The flow rate was 1.0 mL·min-1， the detected wavelength was 213 nm， the column temperature was 40℃， and the injection volume was 10 μL.Results The linear range of SA was 0.15～0.55 mg·mL-1 （R2=1）， the average recovery rate of the method was 94.15%， and the RSD was 0.21% （n=6）.The linear range of BA was 0.05～0.55 mg·mL-1（R2=0.9997）， the average recovery rate of the method was 97.83%， and the RSD was 0.16% （n=6）.Conclusion The established method was accurate， repeatable and had good resolution.It could be used for the simultaneous determination of SA and BA in T.subuliformis， which can be the scientific basis for better quality control of T.subuliformis.

Key words：Thamnolia subuliformis（Ehrh.） W.L.Culb.; HPLC; Squamatic Acid; Baeomycesic Acid; Quantitative Determination

雪地茶為地茶科Thamnoliaceae地茶屬Thamnolia雪地茶T.subuliforms的干燥葉狀體，為藏藥雪茶的來源之一［1-3］。產(chǎn)于云南、西藏、陜西、四川等省高寒山地，味苦、涼，具清熱解毒、安神醒腦等功效，民間常以水煎服或泡茶飲，治療咽喉疼痛、肺熱咳嗽、神經(jīng)衰弱、高血壓等癥［4-6］。現(xiàn)代藥理研究［3， 7-10］表明其藥理活性主要包括抗氧化、抗衰老、抗炎、抑菌、減肥等。文獻［11-14］報道雪地茶主要化學(xué)成分為鱗片衣酸、羊角衣酸、多糖等，但迄今為止，國內(nèi)未見對雪地茶中的縮酚酸類成分進行含量測定方法的研究報道，也未見市場上有其特征成分鱗片衣酸和羊角衣酸的商業(yè)化對照品出售。因此，通過自制鱗片衣酸和羊角衣酸對照品，建立高效液相色譜法對雪地茶藥材進行測定，對雪地茶的質(zhì)量控制和合理用藥十分必要。采用HPLC進行含量測定具有操作簡便快速、穩(wěn)定可靠、專屬性強、易于普及的特點，可為雪地茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供相關(guān)參考，也為其后續(xù)開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity II型高效液相色譜儀［安捷倫（中國）科技有限公司］；UC-22.5H型加熱超聲波清洗器（上海泰坦科技股份有限公司）；CHT210型離心機（長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司）；ME104型電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；JP-300C高速多功能粉碎機（永康市久品工貿(mào)有限公司）。

1.2 藥品與試劑 鱗片衣酸和羊角衣酸對照品（自制，經(jīng)NMR、MS、UV、X-ray數(shù)據(jù)分析進行結(jié)構(gòu)鑒定，純度分別為98%和93%）；甲醇、乙腈均為色譜純；磷酸、甲酸、水、NaHCO3均為分析純；4個批次的雪地茶藥材購買市場、產(chǎn)地信息見表1。經(jīng)鑒定均為地茶科Thamnoliaceae地茶屬Thamnolia雪地茶T.subuliforms的干燥葉狀體。將雪地茶藥材粉碎，過4號篩，粉末密封于自封袋中，備用。采用中國藥典（四部）水分測定法第二法烘干法［15］測定水分，測定結(jié)果見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 取雪地茶藥材粉末約0.30 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入30 mL飽和碳酸氫鈉水溶液，稱定重量，于40℃超聲提取30 min，取出，補足損失的重量。離心，取上清液，重復(fù)提取2次，合并上清液，加入甲酸調(diào)pH至2～3之間，離心得沉淀，用DMSO溶解轉(zhuǎn)移至5 mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度線，搖勻，靜置。取溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱定干燥至恒定質(zhì)量的鱗片衣酸、羊角衣酸對照品2.5 mg，以DMSO溶解，甲醇定容至5 mL容量瓶中，制成每1 mL中含0.5 mg的對照品儲備溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱：Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）色譜柱及Eclipse XDB-C18（4.6 mm×12.5 mm， 5 μm）保護柱；柱溫：40℃；流動相：乙腈（A）-磷酸水溶液（B）（梯度洗脫：0～40 min， 35% A→55% A; 40～41 min， 55% A→100% A; 41～49 min， 100% A; 49～60 min， 100% A→35% A）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：213 nm；進樣量：10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取5.0 mg的干燥對照品置于5 mL的容量瓶中，加入少量DMSO溶解樣品，加甲醇定容至刻度線，搖勻即得到1 mg·mL-1的對照品溶液，精確吸取對照品溶液，用甲醇稀釋，依次得到0.55 mg·mL-1、0.35 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1的一系列對照品溶液。每份樣品分別進樣10 μL，以對照品溶液的質(zhì)量濃度（X， μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸，測得線性回歸方程Y=44805X-694.61 （R2=0.9997）。結(jié)果表明羊角衣酸質(zhì)量濃度在0.05～0.55 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。同理，鱗片衣酸依次得到0.55 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1、0.35 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1的一系列對照品溶液，測得線性回歸方程Y=59103X-1145.2 （R2=1）。結(jié)果表明鱗片衣酸質(zhì)量濃度在0.15～0.55 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度 取同一份對照品溶液，按“2.2”項下方法制備對照品溶液，在“2.3”項條件下進行峰面積測定，1 d內(nèi)連續(xù)進樣6次測定日內(nèi)精密度，計算日內(nèi)RSD為0.14%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性 稱取同一批次雪地茶藥材6份，每份約0.30 g，按“2.1”項下方法，分別制備6份供試品溶液，以鱗片衣酸、羊角衣酸的峰面積作為考察指標(biāo)進樣測定，結(jié)果鱗片衣酸峰面積的RSD為1.80%、羊角衣酸峰面積的RSD為0.92%，表明所建立的測定方法，其重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性 按“2.1”項下方法制備供試品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20和24 h按“2.3”項下條件進樣測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各成分的濃度及其RSD，鱗片衣酸的RSD為1.09%，羊角衣酸的RSD為0.92%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率 取同一批次已知含量的雪地茶藥材粉末6份，每份約0.15 g，進行精密稱定，按照100%目標(biāo)質(zhì)量依次精密加入鱗片衣酸、羊角衣酸對照品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項下條件進樣測定，計算回收率及RSD，測定結(jié)果見表2、表3，待測成分的回收率在93.14%～98.02%，RSD均小于3.0%，符合藥典規(guī)定。計算結(jié)果表明所建立的方法，其回收率良好。

2.4.6 含量測定 分別取4批不同產(chǎn)地的雪地茶藥材粉末約0.30 g，精密稱定3份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行HPLC分析，記錄主成分的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中2個主成分的含量。對照品溶液和樣品溶液的色譜圖如圖1，含量測定結(jié)果見表4，鱗片衣酸平均含量范圍為4.41%～6.17%，羊角衣酸平均含量范圍為2.20%～5.33%。

3 討論

3.1 提取時間、次數(shù)的選定 設(shè)置不同超聲提取時間（5 min、10 min、30 min、60 min、120 min），每份樣品分別提取1次、2次、3次，通過計算提取率發(fā)現(xiàn)超聲提取時間為30 min時，提取率最高。提取2次與3次的含量基本保持不變，且提取到第3次的時候，基本沒有提取物產(chǎn)生。同時，考察了不同料液比（1∶[KG-*3/5]30 g·mL-1，1∶[KG-*3/5]100 g·mL-1）對待測成分峰面積的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)料液比為1∶[KG-*3/5]100時，待測成分峰面積最大，故最終選擇超聲提取時間為30 min，提取次數(shù)為2次，料液比為1∶[KG-*3/5]100。

3.2 提取溶劑的選擇 鑒于化合物鱗片衣酸及羊角衣酸的溶解性，重點考察了乙醇、飽和碳酸氫鈉水溶液做提取溶劑，發(fā)現(xiàn)乙醇的溶解度并不理想，因此最終選定飽和碳酸氫鈉水溶液做提取溶劑。所選用的方法提取效率較高，且操作簡便、毒性小。

3.3 檢測波長的選定 進行DAD全波長（190～400 nm）掃描，鱗片衣酸、羊角衣酸對照品分別在214 nm、212 nm處有最大吸收，經(jīng)試驗確定采用213 nm作為檢測波長。

綜上，實驗結(jié)果表明，不同產(chǎn)地雪地茶藥材均含有鱗片衣酸和羊角衣酸這兩種成分，以鱗片衣酸、羊角衣酸作為雪地茶藥材標(biāo)識性成分有其合理性。通過HPLC進行含量測定的方法，能夠準(zhǔn)確定性和定量分析雪地茶藥材中的鱗片衣酸和羊角衣酸。方法學(xué)驗證實驗結(jié)果表明，所建立的雪地茶中鱗片衣酸和羊角衣酸的含量測定方法結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性和分離度好，可用于同時測定雪地茶中兩種縮酚酸的含量，為雪地茶藥材的質(zhì)量控制和可靠提供了科學(xué)依據(jù)。填補了以往雪地茶含量測定的空白，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考，也為其后續(xù)開發(fā)提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2023-10-23 編輯：劉 斌）