基于響應面設計優化姬松茸多糖的提取工藝

【摘 要】 目的：運用響應面設計優化姬松茸多糖的提取工藝。方法：以超聲波提取與復合酶酶解法提取姬松茸中的多糖成分，以復合酶添加量、pH值、超聲溫度、提取時間為考察因素，在單因素實驗的基礎上，運用響應面設計優化姬松茸多糖的提取工藝。結果：最佳提取工藝條件為復合酶添加量0.03 g、pH6.5、超聲溫度70 ℃、提取時間20 min，此條件下姬松茸多糖的得率為10.67%，與預測值11.06%接近。結論：優選出的提取工藝穩定可行，有助于姬松茸的合理運用，為姬松茸多糖有效提取和科學開發提供了參考。

【關鍵詞】 姬松茸；超聲波；酶提法；響應面設計；多糖提取

【中圖分類號】R284.2

【文獻標志碼】 A""" 【文章編號】1007-8517（2024）14-0048-08

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.14.zgmzmjyyzz202414009

Optimization of Agaricus Blazei Polysaccharide Extraction Process Based on Response Surface Design

XU Qing1 CHEN" Ronglin1 WU Qianyuan1 WANG Yinghao1 LIN Jianying2*

1.College of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350001，China;

2.Fuzhou Dongxing Biotechnology Co.， Ltd， Fuzhou 350001，China

Abstract：Objectives The aim of this project is to optimise the extraction process of Agaricus blazei polysaccharides by using Box-Benhnken. Methods The polysaccharide components in Agaricus blazei were extracted by ultrasonic wave extraction and complex enzyme hydrolysis， and the complex enzyme addition， pH value， ultrasonic temperature and extraction time were investigated， Box-Benhnken was used to optimize the extraction process of Agaricus blazei polysaccharide. Results The optimum extraction process conditions were 0.03g of complex enzyme addition， pH 6.5， ultrasonic temperature of 70°C and extraction time of 20min. The yield of Agaricus blazei polysaccharide under these conditions was 10.67%， which was close to the predicted value of 11.06%. Conclusion The extraction process is stable and feasible， promoting the rational use of Agaricus blazei， and providing a reference for the effective extraction and scientific development of Agaricus blazei polysaccharides.

Key words：Agaricus Blazei; Ultrasound; Enzymatic Extraction; Box-Benhnken

姬松茸（Agaricus blazei Murill.）又名巴西蘑菇、柏氏蘑菇、小松菇，是一種美味的藥、食用真菌［1］，原產于巴西、秘魯和美國等地。同時姬松茸也是一種中藥材，在我國主要分布于東北、華北、華中、華南和西南地區［2］。姬松茸味甘，性溫，具有補益肝腎、健脾和胃、益精氣、潤燥、安神、益氣等功效，其有效成分有多糖［3］、酚類［4］、氨基酸［5］、脂肪類［6］等，還含有多種微量元素［7］，其中多糖是其主要的活性成分。西醫學中，姬松茸常被廣泛應用于免疫調節［8］、抗腫瘤［9］、降血脂［10］、降血糖［11］等方面的健康保健，因此受到了人們廣泛關注。

響應面法最早起源于20世紀50年代的統計學理論和實踐中，并應用于化學工業中的實驗問題。隨著計算機技術的進步和數據分析方法的發展，逐漸出現多種改進和擴展的響應面方法，如中心組合設計、Box-Behnken設計、混合設計等。其中Box-Behnken是采用二次回歸方程，擬合多個因素與多個響應值之間關系進行建模和分析，再通過回歸方程分析優選出最佳提取工藝參數的方法［12］，已被廣泛用于中藥及其制劑的有效成分提取工藝優化。姬松茸多糖在傳統的提取方法的得率較低，而超聲波技術和酶提法都大大提高了其提取率［13-15］，因此，本實驗以超聲波提取與復合酶酶解法提取姬松茸中的多糖成分，運用響應面設計優化姬松茸多糖的提取工藝，為姬松茸多糖的有效提取和科學開發提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器 木瓜蛋白酶、纖維素酶均購自福州精銳生物技術有限公司；95%乙醇、硫酸均購自西隴科學股份有限公司；苯酚、無水葡萄糖均購自阿拉??；姬松茸子實體購自福州東星生物技術有限公司，粉碎后過40目篩，得姬松茸粉，備用。

OHAUS型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）、FWJ-04型高速萬能粉碎機（浙江省永康市敏業工貿有限公司）、KQ-250DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、SK-1型快速混勻器（國華常州儀器制造有限公司）、5804R型臺式大容量離心機（德國Eppendrof公司）、SHB-Ⅲ型循環多用真空水泵（鄭州長城科工貿有限公司）、LGJ-12型真空冷凍干燥機（北京松源華興科技發展有限公司）、HH-2型數顯電子恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）、DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）、Infinite-200·Pro型酶標儀（瑞士·TECAN公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 姬松茸粗多糖不同干燥方法的對比 自然干燥法精密稱取姬松茸粉末1.0 g，加入5 mL純水，混勻，酶解一定時間后70℃超聲20 min，在恒溫水浴鍋中加熱浸提2 h，離心（4000 r/min）15 min，抽濾，加入所得濾液3倍量的95%乙醇醇沉過夜，離心（4000 r/min）15 min，抽濾，最后置于陽臺通風處自然風干。

熱風干燥法前面步驟同自然風干法，最后置于電熱鼓風干燥箱干燥。

真空冷凍干燥法前面步驟同自然風法，抽濾完將沉淀復溶，離心（4000 r/min）15 min，取上清液于-20℃冰箱冷藏過夜，預凍成固體后再放置到真空冷凍干燥機里干燥。

上述3種方法干燥完成后收集粗多糖成品，稱重后放置到120℃干燥箱干燥至恒重，之后分別計算不同方法的粗多糖得率、含水率以及多糖含量。

粗多糖含水率=（m1-m2）/（m1-m0）×100%

其中m1為干燥前的粗多糖及瓶子的重量；m2為干燥后的粗多糖及重量；m0為瓶子的重量。

1.2.2 單因素分析 在查閱文獻和前期實驗的基礎上，從料液比、超聲溫度、提取時間、復合酶添加量、粉末粒度、超聲功率、pH值等因素中選取復合酶添加量、pH值、超聲溫度、提取時間這4個對提取結果影響較大的因素進行考察。

1.2.3 響應面設計 以粗多糖提取率為響應值，依據單因素分析：包括超聲溫度、超聲時間、pH值、復合酶添加量，以這4個因素為自變量，結合Box-Behnken法，設計分析實驗，表1為各因素水平情況。

1.2.4 姬松茸水溶性粗多糖的提取 量取一定體積的純水于離心管中，吸取一定量的稀鹽酸緩慢加入純水中，邊加邊攪拌，并測定pH，將pH分別調至5.5、6.0、6.5。

精密稱取姬松茸粉末1.0 g于15 mL離心管中，再稱取各水平所需的復合酶加入離心管，隨后根據響應面水平精密量取5 mL各pH水平的純水加入離心管，再于快速混勻器上混勻，酶解一段時間后在超聲清潔器中按各水平的條件超聲，超聲功率為80 W。

超聲結束后加入Sevag試劑（氯仿∶[KG-*3/5]正丁醇為4∶[KG-*3/5]1）1 mL，離心（4000 r/min）15 min，取上清液加入濾液三倍量的95%乙醇醇沉過夜，再離心（4000 r/min），抽濾，待濾紙無醇味后復溶，沉淀完全溶解后離心，取上清液進行真空冷凍干燥，干燥結束所得即為多糖粗品。

粗多糖提取率=粗多糖的質量/藥材粉末的質量×100%

1.2.5 多糖含量的測定 選用苯酚硫酸法測定多糖含量，該方法快速、準確、簡便易行。標準曲線的繪制：精密稱取0.0115 g葡萄糖于50 mL小燒杯中，溶解，轉移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，備用；分別精密量取0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL葡萄糖標準溶液于離心管中，準確補水至2.00 mL，加入苯酚1 mL，搖勻，再加入濃硫酸5 mL，搖勻，置于恒溫水浴鍋中沸水浴加熱15 min，冷卻后使用酶標儀于490 nm測定吸光度；以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標進行線性回歸作圖，以此得到葡萄糖標準曲線以及線性回歸方程。

精密稱取0.0050 g姬松茸粗多糖，精確移取10 mL純水加入使其溶解，溶解后準確移取200 μL至另一離心管中，加入200 μL純水稀釋，加入苯酚0.2 mL，混勻，再加入硫酸1 mL，混勻，于恒溫水浴鍋上沸水浴加熱15 min，加速該反應，冷卻，于490 nm測定吸光度，將吸光度代入葡萄糖標準曲線線性回歸方程得出粗多糖中的多糖濃度，并計算多糖含量。

多糖含量=C×稀釋倍數×Vm×100%

其中C為多糖濃度；V為多糖溶液體積；m為稱取的粗多糖質量。

2 實驗結果

2.1 不同干燥方法的對比 由表2可知，自然風干的粗多糖得率最高，但含量較低；熱風干燥的含水率最低，但多糖得率不高；真空冷凍干燥的含水率最高，但多糖得率最高，所以真空冷凍干燥的方式最優。

2.2 基于響應面優化的姬松茸多糖提取工藝

2.2.1 回歸方程的建立與分析 運用軟件design expert 10.0對表3的數據進行多元擬合分析，可得如下多元擬合方程：Y=9.24-0.21A+0.22B-0.35C-0.54D+1.30AB+0.33AC-0.49AD+0.14BC+0.22BD+0.71CD-1.29A2-0.36B2+0.13C2+0.46D2

由表4的回歸方程分析可知，實驗模型的Probgt;F的值小于0.05即模型顯著，失擬項不顯著，說明實驗模型中的二次項方程符合實際提取情況，能夠較好地反應超聲溫度、pH值、復合酶添加量、提取時間與姬松茸粗多糖提取率之間的關系。殘差分析如圖1至圖4所示。

2.2.2 響應面因素間的交互作用 圖5為在固定超聲溫度為75℃、超聲時間為25 min時，pH值和復合酶添加量間的交互作用對粗多糖提取率的影響。當pH不變時，粗多糖提取率隨復合酶添加量的增加而先增長后減??；當復合酶添加量不變時，粗多糖提取率隨pH的增大而呈現緩慢下降的趨勢。因此，pH與復合酶添加量之間的交互作用顯著。當pH處于低水平而復合酶添加量處于較高水平時，粗多糖的提取率達最大值；當pH處于高水平而復合酶添加量處于低水平時，粗多糖的提取率最低。

圖6為在pH值固定為6、超聲時間固定25 min的情況下，超聲溫度和復合酶添加量的交互作用對粗多糖提取率的影響。當超聲溫度不變時，粗多糖提取率隨復合酶添加量的增加而增大；復合酶添加量不變時，粗多糖提取率隨溫度地上升而緩慢下降，這說明超聲溫度和復合酶添加量的交互作用明顯。當復合酶添加量處于高水平、超聲溫度處于低水平時，粗多糖的提取率最大；當復合酶添加量處于低水平、超聲溫度處于高水平時，粗多糖提取率最低。

圖7為pH值固定為6、超聲溫度固定75℃時，超聲時間和復合酶添加量交互作用對粗多糖提取率的影響。當復合酶添加量不變時，粗多糖提取率隨超聲時間地增加而緩慢上升；當超聲時間不變時，粗多糖提取率隨復合酶添加量地增加顯著提升，這說明超聲時間和復合酶添加量交互作用明顯。當復合酶添加量處于高等水平且超聲時間處于高水平時，粗多糖提取率最高；當復合酶添加量和超聲時間都處于低水平時，粗多糖提取率最低。

圖8為超聲時間固定25 min、復合酶添加量固定0.03 g時pH值和超聲溫度對粗多糖提取率交互作用的影響。由圖8可知，pH值不變時，提取率隨超聲溫度地增大緩慢上升；超聲溫度不變時，提取率隨pH地增大緩慢上升，這說明pH和超聲溫度的交互作用對提取率的影響不顯著。

圖9為超聲溫度固定75℃、復合酶添加量固定0.03 g時pH和超聲時間對粗多糖提取率的交互作用。由圖9知，當pH不變時，粗多糖提取率隨超聲時間的增大而減??；當超聲時間不變時，提取率隨pH的增大先增大后趨于穩定。當pH處于較高水平，超聲時間處于高水平時，粗多糖提取率最大；當兩者都處于低水平時，提取率最低。

圖10為pH固定為7、復合酶添加量固定為0.03 g時，超聲溫度和超聲時間對粗多糖提取率交互作用的影響。當超聲溫度不變時，提取率隨超聲時間的增大而減??；當超聲時間不變時，提取率隨超聲溫度的增大而減小，這說明超聲時間和超聲溫度的交互作用較為顯著。當超聲溫度和超聲時間都處于低水平時，提取率最高。

2.2.3 最佳提取工藝的確定及驗證 運用design expert 10.0處理數據，結合實驗可操作性，分析認為：姬松茸粗多糖最佳提取工藝為復合酶添加量0.03 g、pH值6.5、超聲溫度70℃、提取時間20 min，在此條件下的粗多糖得率預估為11.06%。采用上述最佳提取工藝驗證，平行試驗3次，平均提取率為10.67%，與預測值接近，說明該提取工藝條件的穩定性和準確性。

2.3 多糖含量的測定

2.3.1 標準曲線的繪制 圖11為葡萄糖標準曲線，以葡萄糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標的線性回歸方程：Y=7738.8X+0.1153。

2.3.2 多糖含量的測定 測完粗多糖樣品溶液吸光度后按式多糖含量=C×稀釋倍數×Vm×100%計算。結果見表5。

由表6可知，樣品提取的姬松茸多糖含量在50%以上的有28份，占總數的96.55%；多糖含量在60%以上的有16份，占總數的55.17%；多糖含量在70%以上的有6份，占總數的20.69%；多糖含量在80%以上的有2份，占總數的6.90%，說明該方法下姬松茸多糖的提取率較好。

3 討論

姬松茸是一種珍貴的食藥兼用的真菌，其中多糖含量豐富，具有廣闊的開發利用前景。目前，關于姬松茸提取方式主要有熱水浸提法、溶劑提取法、超聲提取法和復合酶提取法。熱水浸提法成本低、操作簡便、污染小，楊開［16］運用此法提取姬松茸子實體及粉末的多糖，提取率相對較高，但發現浸提溫度過高、時間過久會導致多糖鏈被破壞。溶劑提取法操作簡便、準確度高、提取純度較高，已成為多糖提取的常用方法之一。沈愛英等［17］及張云凌等［18］發現運用不同溶劑提取姬松茸多糖的得率會比傳統水提法高，但酸堿環境下多糖的糖苷鍵及其立體結構和活性易被破壞。超聲提取法是一種利用超聲波作用對樣品實行有效提取的方式，通過超聲波的高頻振動，極大地加速了細胞壁破裂和多糖溶解過程，具有效率高［19］、操作簡潔等優點?；艨▲P等［15］運用超聲波技術優化了姬松茸粗多糖的提取工藝，該方法下多糖得率比單純的水提顯著提升，且純度也較高。復合酶提取法通常使用多種酶的混合物，通過協同作用來提高對特定分子的識別和分解能力，從而提高提取效率，沈愛英等［13］采用此方法提取姬松茸子實體中的多糖，提取率為15.67%，相比于單純熱水浸提，該方法提取效率提升了1倍，與酸堿浸提法對比效率也更高。因此該方法與傳統提取方法相比快速、高效、無殘留物，特別適用于提取具有復雜化學結構的化合物，在許多領域中有著廣泛的應用。

通過實驗前查閱相關文獻，選擇超聲時間［20］、超聲溫度、pH、復合酶添加量［22-23］這些4個對多糖提取率影響較為顯著的因素，運用響應面設計優化姬松茸多糖的提取工藝。未來隨著人類科技的進步以及科研的發展，姬松茸的提取工藝與應用領域也會不斷優化，其發展前景可觀。

姬松茸中多糖含量豐富，具有非常好的食用、保健功能和開發利用前景，因此研究姬松茸多糖的提取工藝和開發其相關產品具有重要意義。本實驗以干燥的姬松茸粉末為原料，以純水為提取溶劑，在單因素試驗基礎上用design expert10.0軟件對多糖成分提取工藝參數進行響應面試驗優化，結果表明最佳的提取工藝條件為：復合酶添加量0.03 g、pH值6.5、超聲溫度70℃、提取時間20 min，此條件下姬松茸多糖的得率為10.67%，與預測值11.06%接近。因此使用響應面設計優化出的姬松茸多糖提取工藝穩定可行，為促進姬松茸的合理運用及姬松茸多糖有效提取和科學開發提供了參考。

參考文獻

［1］李曉，盧學春，李雨鑫，等.姬松茸多糖提取物對高脂血癥大鼠降血脂作用研究［J］.食品科學技術學報，2021，39（2）：56-64.

［2］高章會，華蓉，孫達鋒，等.姬松茸栽培現狀和遺傳育種研究進展［J］.中國食用菌，2022，41（5）：1-4.

［3］程方慧，張瑞溪，付鈺涓，等.姬松茸及其活性多糖藥理作用研究進展［J］.畜禽業，2021，32（1）：5.

［4］黃蕭，陳巧芬.姬松茸飲品的制備工藝研究［J］.現代食品，2022，28（15）：68-72.

［5］種藏文，陳體強，李開本，等.福建產巴西蘑菇的營養成分［J］.食用菌學報，1999（2）：53-56.

［6］張云凌.淺談姬松茸的藥效［J］.中國林副特產，2001（4）：40-41.

［7］林戎斌，林陳強，張慧，等.姬松茸食藥用價值研究進展［J］.食用菌學報，2012，19（2）：117-122.

［8］LIMA CRISTIANE URCINA JOANNA OLIVEIRA，CORDOVA CLUDIO OLAVO DE ALMEIDA，NBREGA OTVIO DE TOLDO，

et al. Does the Agaricus blazei Murill mushroom have properties that affect the immune system An integrative review［J］. Journal of medicinal food，2011，14（1-2）：2-8.

［9］MIZUNO M，MINATO K，ITO H，et al. Anti-tumor polysaccharide from the mycelium of liquid-cultured Agaricus blazei mill［J］. Biochemistry and molecular biology international，1999，47（4）：707-714.

［10］LI Y X，SHENG Y，LU X C，et al. Isolation and purification of acidic polysaccharides from Agaricus blazei Murill and evaluation of their lipid-lowering mechanism［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2020，157（15）：276-287.

［11］陶茹瑩，張輝.地龍蛋白和姬松茸多糖的藥理研究［J］.吉林中醫藥，2017，37（7）：706-708.

［12］王永菲，王成國.響應面法的理論與應用［J］.中央民族大學學報（自然科學版），2005（3）：236-240.

［13］沈愛英，谷文英.復合酶法提取姬松茸子實體多糖的研究［J］.食用菌，2001（3）：7-9.

［14］王艷，聶志勇，賀瑛，等.超聲波協同復合酶法提取姬松茸多糖［J］.天然產物研究與開發，2009，21（5）：866-870.

［15］霍俊鳳，漢麗梅，馬吉飛.超聲波技術優化姬松茸水溶性粗多糖的提取工藝及含量測定［J］.食品科技，2007，194（12）：94-96.

［16］楊開.姬松茸多糖的提取、純化和結構分析［D］.杭州：浙江工業大學，2003.

［17］沈愛英，谷文英.姬松茸子實體水溶性多糖提取工藝的研究［J］.中國食用菌，2002（1）：15-17.

［18］張云凌，王偉明.姬松茸粗多糖提取工藝的研究［J］.中國林副特產，2003（4）：24-25.

［19］HU X T，XU F R，LI J L，et al.Ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from coix seeds： Optimization， purification， and in vitro digestibility［J］. Food Chemistry，2022，374（16）：131636.1-131636.10.

［20］王宏雨，張迪，林衍銓，等.姬松茸多糖超聲波循環提取工藝研究［J］.中國食用菌，2017，36（4）：45-47.

［21］馬春，董秀萍，朱蓓薇.復合酶法提取姬松茸胞內多糖［J］.大連輕工業學院學報，2005（3）：195-198.

［22］楊丹妮，汪振炯，呂勝男.超聲波協同酶法提取姬松茸基質多糖及其抗腫瘤活性研究［J］.食品科技，2017，42（11）：212-217.

（收稿日期：2023-10-27 編輯：陶希睿）