PEG的分散性及結(jié)構(gòu)對(duì)PEG化膠束在BSA溶液中穩(wěn)定性的影響

摘 要： 聚乙二醇（Polyethylene glycol， PEG）化膠束在體外的穩(wěn)定性是其作為納米藥物載體的重要參考指標(biāo)。將不同分散性和結(jié)構(gòu)的PEG，與十八烷酸、十四烷酸、1，2-二硬脂酸-3-磷脂酰乙醇、膽固醇、維生素E琥珀酸酯、N，N-雙十四烷基胺和抗癌藥物紫杉醇等合成一系列兩親性聚合物；分析在相同疏水段的條件下，PEG的分散性和結(jié)構(gòu)對(duì)其膠束臨界膠束濃度（Critical micelle concentration， CMC）、粒徑以及在牛血清白蛋白（BSA）溶液中的穩(wěn)定性的影響。結(jié)果顯示：PEG的分散性對(duì)線(xiàn)形PEG化膠束的CMC和粒徑影響不明顯，分支結(jié)構(gòu)的PEG化膠束在CMC和粒徑上均顯著小于線(xiàn)形PEG化膠束；在BSA溶液中，分支結(jié)構(gòu)的PEG化膠束的穩(wěn)定性顯著優(yōu)于線(xiàn)形單分散的，多分散PEG化膠束的穩(wěn)定性最差，PEG結(jié)構(gòu)和分散性影響膠束的體外穩(wěn)定性。該文結(jié)果為開(kāi)發(fā)單分散PEG化膠束的藥物遞送系統(tǒng)提供了重要的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 單分散PEG；膠束；分支結(jié)構(gòu)；牛血清白蛋白；體外穩(wěn)定性

中圖分類(lèi)號(hào)： TQ432.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)： 1673-3851 （2024）11-0743-10

引文格式：林超，袁于民. PEG的分散性及結(jié)構(gòu)對(duì)PEG化膠束在BSA溶液中穩(wěn)定性的影響［J］. 浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2024，51（6）：743-752.

Reference Format：" LIN" Chao，YUAN" Yumin. Effect of PEG dispersity and structure on the stability of PEG micelles in BSA solutions［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2024，51（6）：743-752.

Effect of PEG dispersity and structure on the stability of PEG micelles in BSA solutions

LIN Chao1，2， YUAN Yumin2

（1a.School of Materials Science amp; Engineering; 1b.Institute of Smart Biomedical Materials， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China; 2.Biomatrik Inc.， Jiaxing 314001， China）

Abstract： The in vitro stability of polyethylene glycol （PEG）-modified micelles is a crucial factor for their application as nanocarriers for drug delivery. A series of amphiphilic polymers were synthesized by using PEGs with different dispersities and structures， combined with octadecanoic acid， tetradecanoic acid， 1， 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine， cholesterol， vitamin E succinate， N， N-ditetradecylamine， and the anticancer drug paclitaxel. The study investigated the effects of PEG′s dispersity and structure on the critical micelle concentration （CMC）， particle size， and stability in bovine serum albumin （BSA） solutions under the same hydrophobic segment conditions. The results show that the dispersion of PEG has little effect on the CMC and particle size of linear PEGylated micelles， while the branched PEGylated micelles are significantly smaller in CMC and particle size than linear PEGylated micelles; the stability of branched PEGylated micelles in BSA solutions is superior to that of their linear monodisperse counterparts， while the stability of polydisperse PEGylated micelles is unsatisfactory. PEG structure and dispersity affect the in vitro stability of micelles. The results of this paper provide important reference for the development of drug delivery systems with monodisperse PEG micelles.

Key words： monodisperse PEG; micelles; branch structure; bovine serum albumin; in vitro stability

0 引 言

利用兩親性分子在水溶液中自組裝以形成由疏水核和親水冠組成的膠束，是藥物遞送中的常用載體。疏水核通常為可生物降解的聚合物或小分子藥物，如聚丙交酯（PLA）［1］、小分子脂肪酸［2-3］、膽固醇（Chol）［4］、維生素E（VE）［5-6］、N，N-雙十四烷基胺［7］和抗癌藥物紫杉醇（PTX）［8］等，并通過(guò)親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)的相互作用來(lái)穩(wěn)定膠束結(jié)構(gòu)、促進(jìn)疏水性藥物的溶解，且親水鏈段在外層形成電暈，提供水環(huán)境中的穩(wěn)定性。聚乙二醇（Polyethylene glycol， PEG）作為比較常用的親水性聚合物，在體內(nèi)具備“隱形”特性，在膠束藥物遞送系統(tǒng)中占據(jù)主導(dǎo)地位。在體內(nèi)環(huán)境中，膠束的PEG冠可以減少血液中的蛋白質(zhì)吸附［9］，從而避免被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（Mononuclear phagocyte system， MPS）和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（Reticuloendothelial system， RES）快速清除，增加循環(huán)時(shí)間，并通過(guò)增強(qiáng)滲透性和保留效應(yīng)促進(jìn)膠束在腫瘤部位的積累［10-11］。因此，PEG化膠束在疏水藥物的靶向遞送領(lǐng)域被廣泛研究，封裝疏水性PTX的PEG化膠束（mPEG-PLA）制劑已在亞洲上市［12］。

通過(guò)對(duì)PEG化膠束的臨界膠束濃度（Critical micelle concentration，CMC）和蛋白吸附實(shí)驗(yàn)來(lái)研究膠束在體外的穩(wěn)定性，從而為PEG化膠束在體內(nèi)穩(wěn)定性研究提供參考依據(jù)。CMC是膠束形成能力和保持完整性的主要關(guān)鍵指標(biāo)，與兩親性分子的結(jié)構(gòu)和親水親油平衡值密切相關(guān)。一方面隨著PEG鏈長(zhǎng)的增加，其親水親油平衡值增加，CMC增加，膠束的尺寸也隨之增加［13-15］；另一方面隨著PEG鏈長(zhǎng)的增加，其抵御蛋白吸附的能力增強(qiáng)，使膠束在蛋白溶液中的穩(wěn)定性增加［12］。目前多分散PEG是納米藥物（脂質(zhì)納米顆粒、脂質(zhì)體、膠束和其他形式的納米顆粒）中使用最廣泛的親水性材料，它為不同鏈長(zhǎng)的PEG所組成的同系混合物，而單分散則是由相同鏈長(zhǎng)的PEG組成。迄今為止關(guān)于PEG的分散性對(duì)膠束穩(wěn)定性影響研究的報(bào)道較少。郝祖杭等［13］通過(guò)對(duì)比多分散與單分散甲氧基聚乙二醇-四苯乙烯（mPEG-TPE）膠束在牛血清白蛋白（BSA）溶液中穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，單分散mPEG-TPE膠束比多分散膠束具有更好的穩(wěn)定性。此外，PEG結(jié)構(gòu)的變化也會(huì)對(duì)其膠束的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，分支結(jié)構(gòu)的PEG化膠束比線(xiàn)形的PEG化膠束具有更小的膠束粒徑和更好的屏蔽非特異性蛋白的吸附［16-18］，在體內(nèi)有更好的“隱身效果”、更長(zhǎng)的半衰期和更好的生物利用度［19-21］。

本文選擇十八烷酸、十四烷酸、硬脂酸、Chol、VES、N，N-雙十四烷基胺和抗癌藥物PTX疏水性化合物，研究其與線(xiàn)形PEG鍵合后的具有相同疏水核但分散性不同的衍生物，測(cè)定PEG化膠束粒徑在BSA溶液中的變化來(lái)判斷膠束的穩(wěn)定性；并合成以賴(lài)氨酸為節(jié)點(diǎn)的分支PEG，分別與N，N-雙十四烷基胺和PTX合成分支結(jié)構(gòu)的PEG衍生物，將其與對(duì)應(yīng)的線(xiàn)形PEG化膠束進(jìn)行比較。本文結(jié)果為開(kāi)發(fā)單分散PEG膠束在藥物遞送領(lǐng)域應(yīng)用提供了重要的參考意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 材 料

線(xiàn)形多分散（MW=2000 Da）與單分散（n=45）的甲氧基聚乙二醇-雙琥珀酰亞胺戊二酸酯（mPEG-DSG）、甲氧基聚乙二醇-二肉豆蔻?；?外消旋-甘油（mPEG-DMG）、甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（mPEG-DSPE）、甲氧基聚乙二醇-膽固醇（mPEG-Chol）、甲氧基聚乙二醇-維生素E琥珀酸酯（TPGS）、甲氧基聚乙二醇-雙十四烷基乙酰胺（ALC-0159）、甲氧基聚乙二醇-紫杉醇（mPEG-PTX）以及分支（mPEG23）2-Lys-COOH和（mPEG23）2-Lys-COONHS由浙江博美生物技術(shù)有限公司提供，N，N-雙十四烷基胺、PTX、磷酸鹽緩沖液（PBS）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）和二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）購(gòu)自上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司，二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EA）、鹽酸（HCl）、四氫呋喃（THF）、氘代氯仿（CDCl3）、乙腈（ACN）、無(wú)水硫酸鎂（MgSO4）和氫氧化鈉（NaOH）購(gòu)自湖州雙林化學(xué)科技有限公司，BSA購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 儀 器

納米粒度電位分析儀（BeNano 180 Zeta Pro，丹東百特）；透射電子顯微鏡（TEM，Hitachi ht7800，日本）；基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF/TOF，德國(guó)布魯克）；核磁共振氫譜儀（1H NMR，600 MHz，德國(guó)布魯克）；表面張力儀（OT-60，寧波新邊界）；高效液相色譜-電噴霧檢測(cè)器（HPLC，UltiMate3000，美國(guó)賽默飛世爾）。

1.2 樣品的制備

1.2.1 兩親性化合物的合成

a）分支ALC-0159的合成。分支ALC-0159的合成路線(xiàn)如圖1所示，具體如下：將（mPEG23）2-Lys-COONHS（1.00 g，0.414 mmol）、N，N-雙十四烷基胺（0.34 g，0.829 mmol）加入到DCM（20 mL）溶液中，常溫狀態(tài)下攪拌6 h，通過(guò)層析硅膠板監(jiān)測(cè)反應(yīng)液中原料反應(yīng)完后，使用清水（20 mL）對(duì)反應(yīng)進(jìn)行淬滅。對(duì)有機(jī)相用0.1 mol/L的HCl溶液（25 mL×3）萃洗雜質(zhì)，無(wú)水MgSO4干燥有機(jī)相，減壓蒸干有機(jī)溶劑得到ALC-0159（mPEG23×2）的粗產(chǎn)物，再經(jīng)柱層析純化，最后用EA（10 mL）重結(jié)晶，減壓蒸干有機(jī)溶劑得白色粉末狀A(yù)LC-0159（mPEG23×2）（0.86 g，產(chǎn)率77%，HPLC：94.17%）。1H NMR （600 MHz， Chloroform-d） δ 7.36 （d， J=8.7 Hz， 1H）， 6.92 （t， J=6.0 Hz， 1H）， 4.89 （td， J=8.5， 4.8 Hz， 1H）， 4.07-3.94 （m， 4H）， 3.64 （s， 180H）， 3.55 （t， J=4.7 Hz， 4H）， 3.38 （s， 6H）， 3.33-3.19 （m， 4H）， 3.05 （dt， J=14.0， 7.6 Hz， 1H）， 1.76-1.69 （m， 1H）， 1.59 （m， J=29.4， 15.0， 7.2 Hz， 4H）， 1.50 （p， J=7.4 Hz， 3H）， 1.36 （q， J=8.1 Hz， 2H）， 1.32-1.22 （m， 44H）， 0.88 （t， J=6.9 Hz， 6H）。

b）分支mPEG-PTX的合成。分支mPEG-PTX的制備方法如圖2所示，具體如下：將（mPEG23）2-Lys-COOH（1.00 g，0.432 mmol）、PTX（0.55 g，0.647 mmol）、DCC（0.25 g，1.197 mmol）和DMAP（3.00 mg，0.025 mmol）加入DCM（20 mL）的溶液中，常溫狀態(tài)下攪拌6 h，層析硅膠板監(jiān)測(cè)反應(yīng)液中原料反應(yīng)完后，使用清水（20 mL）對(duì)反應(yīng)進(jìn)行淬滅。對(duì)有機(jī)相用0.1 mol/L的NaOH水溶液（25 mL×3）萃洗雜質(zhì)，無(wú)水MgSO4干燥有機(jī)相，減壓蒸干有機(jī)溶劑得到（mPEG23）2-Lys-PTX的粗產(chǎn)物，再經(jīng)柱層析純化，最后用EA（10 mL）重結(jié)晶，減壓蒸干有機(jī)溶劑得白色粉末狀（1.13 g，產(chǎn)率83%，HPLC：93.51%）。1H NMR （600 MHz， Chloroform-d） δ 8.17-8.12 （m， 2H）， 7.90-7.82 （m， 2H）， 7.65-7.60 （m， 1H）， 7.53 （t， J=7.6 Hz， 2H）， 7.49-7.45 （m， 3H）， 7.40 （td， J=7.5， 5.8 Hz， 3H）， 7.30 （d， J=7.4 Hz， 1H）， 7.05 （t， J=6.2 Hz， 1H）， 6.30 （d， J=9.8 Hz， 1H）， 6.18 （t， J=9.1 Hz， 1H）， 5.98 （dd， J=9.0， 4.4 Hz， 1H）， 5.67 （d， J=7.1 Hz， 1H）， 5.47 （d， J=4.4 Hz， 1H）， 5.00-4.96 （m， 1H）， 4.68 （td， J=8.1， 5.5 Hz， 1H）， 4.44 （m， J=10.9， 6.5， 4.1 Hz， 1H）， 4.31 （d， J=8.5 Hz， 1H）， 4.20 （d， J=8.6 Hz， 1H）， 3.95 （d， J=15.7 Hz， 2H）， 3.87 （d， J=15.5 Hz， 1H）， 3.82-3.73 （m， 3H）， 3.64 （d， J=3.5 Hz， 180H）， 3.56-3.54 （m， 4H）， 3.38 （s， 6H）， 3.14 （dt， J=11.5， 5.4 Hz， 2H）， 2.61-2.52 （m， 2H）， 2.49 （s， 3H）， 2.23 （s， 3H）， 1.91 （d， J=1.5 Hz， 4H）， 1.83 （d， J=5.0 Hz， 6H）， 1.78 （s， 1H）， 1.69 （s， 3H）， 1.62-1.54 （m， 1H）， 1.43 （t， J=7.5 Hz， 2H）， 1.28-1.24 （m， 1H）， 1.22 （d， J=11.0 Hz， 3H）， 1.13 （d， J=9.2 Hz， 3H）。

1.2.2 膠束溶液的制備

對(duì)于mPEG-DSG、mPEG-DMG、mPEG-DSPE、mPEG-Chol、TPGS和ALC-0159兩親性聚合物采用直接水溶法制備膠束溶液；對(duì)于mPEG-PTX兩親性聚合物，由于其通過(guò)直接水溶法制備的膠束粒徑分布為雙峰，為了保證膠束粒徑分布為單峰，采用溶劑旋干法制備膠束溶液。

直接水溶法：將3 mg樣品加入到1.5 mL的PBS溶液中，通過(guò)超聲波處理20 min，使之在PBS緩沖中形成均勻的膠束溶液。

溶劑旋干法：將3 mg樣品溶解在300 μL的THF中，再將其緩慢滴入1.5 mL的PBS溶液中，磁力攪拌1 h，減壓濃縮去除溶液中的THF，獲得聚合物樣品的膠束溶液。

1.3 測(cè)試與表征

1.3.1 兩親性聚合物MALDI-TOF和1H NMR的表征

采用MALDI-TOF 對(duì)單分散分支ALC-0159（mPEG23×2）和（mPEG23）2-Lys-PTX進(jìn)行表征。以ACN作為流動(dòng)相，反式-2-［3-（4-叔丁基苯基）-2-甲基-2-丙烯］丙二腈為檢測(cè)基質(zhì)，掃描的范圍為m/z=1000～3000。分支ALC-0159和mPEG-PTX的1H NMR使用溶劑均采用CDCl3。

1.3.2 高效液相色譜測(cè)試

分別稱(chēng)取ALC-0159（mPEG23×2）和（mPEG23）2-Lys-PTX樣品10 mg，加入1 mL的色譜級(jí)ACN，搖晃使其充分溶解，用孔徑為0.45 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾灰塵，用高效液相色譜儀自動(dòng)吸取10 μL進(jìn)行HPLC分析。

1.3.3 兩親性聚合物的CMC測(cè)試

兩親性聚合物的CMC是通過(guò)聚合物溶液的表面張力-濃度對(duì)數(shù)圖確定，超純水配制一系列該聚合物不同濃度的溶液（1000.0、500.0、100.0、50.0、10.0、5.0、2.5、1.0 μmol/L和0.5 μmol/L），使用表面張力儀測(cè)量聚合物在不同濃度下對(duì)應(yīng)的表面張力。制作表面張力與濃度對(duì)數(shù)的曲線(xiàn)圖，將曲線(xiàn)圖轉(zhuǎn)折點(diǎn)兩側(cè)的線(xiàn)段部分進(jìn)行延長(zhǎng)，延長(zhǎng)線(xiàn)的交點(diǎn)濃度即為此聚合物的CMC。

1.3.4 兩親性聚合物的粒徑分布和TEM測(cè)試

膠束粒徑和粒徑分布指數(shù)（Polymer dispersity index，PDI）由納米粒度電位分析儀測(cè)定，納米粒度電位儀采用173°光路，測(cè)試溫度為25 ℃，激光的波長(zhǎng)長(zhǎng)度為671 nm。樣品測(cè)試前進(jìn)行超聲處理20 min，用水系0.45 μm的濾頭對(duì)膠束溶液進(jìn)行過(guò)濾去除雜質(zhì)，每個(gè)樣品平衡時(shí)間為120 s，單次測(cè)試的子測(cè)試時(shí)間為2.1 s，子測(cè)試數(shù)量為60次，重復(fù)測(cè)試3次。配制各種兩親性聚合物水溶液（1 mmol/L），超聲波處理5 min使樣品充分溶解，吸取樣品10 μL滴加于銅網(wǎng)上，放于37 ℃恒溫箱中干燥6 h，吸取磷鎢酸染色液10 μL滴加于銅網(wǎng)上，干燥6 h，于80 kV下進(jìn)行透射電鏡成像。

1.3.5 兩親性聚合物膠束在BSA溶液中穩(wěn)定性測(cè)試

配制質(zhì)量濃度為4 mg/mL的兩親性聚合物膠束溶液，配制BSA溶液（4、20 mg/mL和40 mg/mL），超聲波處理5 min混合均勻；取等體積的膠束溶液與BSA溶液混合（mPEG-DSG、mPEG-DMG、mPEG-DSPE和mPEG-Chol的BSA質(zhì)量濃度為40 mg/mL；TPGS和ALC-0159的BSA質(zhì)量濃度為20 mg/mL；mPEG-PTX的BSA質(zhì)量濃度為4 mg/mL），通過(guò)0.45 μm的濾頭對(duì)膠束溶液進(jìn)行過(guò)濾去除雜質(zhì)，每個(gè)樣品制備3組，放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，在不同時(shí)間段測(cè)試其粒徑，并繪制粒徑-時(shí)間曲線(xiàn)圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 分支ALC-0159（mPEG23×2）和（mPEG23）2-Lys-PTX的質(zhì)譜

賴(lài)氨酸（Lys）具有3個(gè)官能團(tuán)，常用來(lái)構(gòu)建分支結(jié)構(gòu)的PEG衍生物［21］，多分散PEG2000相當(dāng)于45個(gè)PEG重復(fù)單元，因此，選用mPEG23-CH2COOH與賴(lài)氨酸的2個(gè)氨基反應(yīng)來(lái)構(gòu)建分支狀（mPEG23）2-Lys-COOH以消除分子量不同帶來(lái)的影響。利用（mPEG23）2-Lys-COOH或其活化酯分別與N，N-雙十四烷基胺和PTX反應(yīng)得到分支狀的ALC-0159（mPEG23×2）和（mPEG23）2-Lys-PTX，并對(duì)其分子量進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3所示。圖3顯示：分支結(jié)構(gòu)ALC-0159（mPEG23×2）和（mPEG23）2-Lys-PTX分子離子峰［M+Na］+的質(zhì)荷比分別為2730.6和3174.6，與理論［M+Na］+分子質(zhì)量2729.9和3174.7相一致，表明成功制備目標(biāo)化合物ALC-0159（mPEG23×2）和（mPEG23）2-Lys-PTX，且都為單一分子量分布。

2.2 臨界膠束濃度、粒徑和TEM

具有較小CMC和粒徑的膠束，其疏水內(nèi)核通過(guò)相互作用使膠束更加穩(wěn)定［22］，而較小的粒徑有利于通過(guò) EPR效應(yīng)增加藥物在腫瘤組織的積累［23］。為此，通過(guò)表面張力儀、動(dòng)態(tài)光散射法（Dynamic light scattering， DLS）和TEM考察了PEG的分散性與結(jié)構(gòu)對(duì)PEG化膠束的CMC和粒徑影響。

2.2.1 線(xiàn)形單分散與多分散mPEG-DSG、mPEG-DMG、mPEG-DSPE、mPEG-Chol和TPGS膠束的CMC、粒徑與TEM的分析

線(xiàn)形mPEG-DSG、mPEG-DMG、mPEG-DSPE、mPEG-Chol和TPGS膠束的CMC與粒徑數(shù)值見(jiàn)表1。表1顯示：mPEG2000-DSPE和mPEG2000-Chol膠束的CMC值與文獻(xiàn)報(bào)道值［15，24-25］接近，對(duì)各自單分散與多分散PEG化膠束的CMC進(jìn)行對(duì)比，兩者之間相差不明顯，但大部分單分散PEG化膠束的CMC要小于多分散的，單分散與多分散PEG化膠束的粒徑與PDI也相差甚小。因此，PEG的分散性對(duì)其CMC、粒徑及PDI影響較小。

圖4為mPEG-DSG、mPEG-DMG、mPEG-DSPE、mPEG-Chol和TPGS膠束的TEM圖。由圖4可知：聚合物膠束大小較均勻，分散性較好，膠束顆粒之間基本無(wú)黏連，平均粒徑約為10 nm；同時(shí)也可以看出，膠束疏水基團(tuán)相同時(shí)，單分散膠束粒徑與多分散膠束大小無(wú)太大差異。

2.2.2 線(xiàn)形及分支狀A(yù)LC-0159和mPEG-PTX膠束的CMC、粒徑與TEM的分析

線(xiàn)形及分支狀A(yù)LC-0159和mPEG-PTX膠束的CMC與粒徑數(shù)值見(jiàn)表2。由表2可知：線(xiàn)形單分散ALC-0159的CMC比多分散的略小，粒徑均為15.2 nm；分支狀A(yù)LC-0159（mPEG23×2）的CMC與膠束粒徑則明顯小于線(xiàn)形狀；在mPEG-PTX膠束的CMC與粒徑數(shù)據(jù)中觀察到，分支狀（mPEG23）2-Lys-PTX膠束的CMC與粒徑也明顯小于線(xiàn)形的，主要是由于PEG的分支結(jié)構(gòu)可通過(guò)PEG鏈的相互纏結(jié)［26］，使得膠束的穩(wěn)定性增強(qiáng)，所以膠束的CMC和粒徑都比線(xiàn)形膠束明顯要小，與Hsu等［18］所報(bào)道的兩組樹(shù)突分支狀PEG化膠束的CMC與粒徑均小于對(duì)應(yīng)線(xiàn)形膠束的結(jié)果相一致。

圖5為ALC-0159和mPEG-PTX膠束的TEM圖。圖5（a）—（c）顯示：ALC-0159膠束大小較均勻，分散性較好，膠束顆粒之間基本無(wú)黏連，平均粒徑約為10 nm。由圖5（d）—（f）可知：膠束大小較均勻，分散性較好，顆粒之間無(wú)黏連，其中mPEG2000-PTX和mPEG44-PTX粒徑大小約為100 nm，（mPEG23）2-Lys-PTX粒徑大小約為70 nm，分支狀膠束大的粒徑小于線(xiàn)形膠束粒徑，與通過(guò)DLS法測(cè)定的結(jié)論相一致。

2.3 PEG化膠束在BSA溶液中的穩(wěn)定性研究分析

PEG化膠束在體內(nèi)穩(wěn)定性還受到血液中蛋白質(zhì)的影響［22，27-28］，蛋白質(zhì)吸附在膠束的表面時(shí)，導(dǎo)致膠束的粒徑增大，而吸附了蛋白質(zhì)的膠束之間還會(huì)融合，致使其粒徑進(jìn)一步的增大，以至于被免疫細(xì)胞識(shí)別而遭清除［29］。對(duì)上述7種線(xiàn)形和2種分支狀PEG化膠束分別在BSA的PBS緩沖溶液進(jìn)行混合孵育，利用DLS法監(jiān)測(cè)膠束粒徑的變化情況，通過(guò)膠束粒徑隨時(shí)間的變化來(lái)評(píng)估PEG的分散性和結(jié)構(gòu)對(duì)膠束體外穩(wěn)定性的影響。

2.3.1 線(xiàn)形單分散與多分散mPEG-DSG、mPEG-DMG、mPEG-DSPE、mPEG-Chol和TPGS膠束在BSA溶液中穩(wěn)定性

在BSA溶液中，線(xiàn)形單分散與多分散mPEG- ""DSG、mPEG-DMG、mPEG-DSPE、mPEG-Chol和TPGS的5種膠束粒徑隨時(shí)間變化結(jié)果如圖6所示。由圖6（a）可知：mPEG2000-DSG粒徑在第3天的時(shí)候略微變大，第9天時(shí)，mPEG2000-DSG的粒徑增加到～100 nm，與初始對(duì)比變化較大，而對(duì)于mPEG45-DSG，從開(kāi)始至第9天，其粒徑基本不變。圖6（b）的mPEG-DMG膠束粒徑變化趨勢(shì)與mPEG-DSG相類(lèi)似。圖6（c）的mPEG2000-DSPE和mPEG45-DSPE膠束溶液的粒徑的變化分別由第3天和第4天開(kāi)始逐漸增加，mPEG45-DSPE初始穩(wěn)定時(shí)間較長(zhǎng)，mPEG45-DSPE的粒徑變化幅度明顯小于mPEG2000-DSPE。圖6（d）的mPEG2000-Chol和mPEG45-Chol膠束溶液的粒徑的變化分別由第4天和第6天開(kāi)始逐漸增加，mPEG45-Chol初始穩(wěn)定時(shí)間較長(zhǎng)，且粒徑變化幅度小于mPEG2000-Chol。從圖6（e）觀察TPGS與mPEG-DSPE膠束粒徑變化有相同趨勢(shì)，TPGS（mPEG45）的膠束穩(wěn)定性?xún)?yōu)于TPGS（mPEG2000）。以上結(jié)果表明：在BSA溶液中，當(dāng)PEG鏈長(zhǎng)相同時(shí)，單分散的膠束的穩(wěn)定性?xún)?yōu)于多分散膠束，是由于多分散PEG的膠束表面的PEG分布不均，短鏈PEG抵御BSA吸附的能力較差，對(duì)膠束表面不能起到足夠的保護(hù)作用，是BSA吸附的薄弱環(huán)節(jié)；單分散膠束的PEG長(zhǎng)度都是均一的，穩(wěn)定性較好，與Teramura等［8］研究的PEG5000聚合物比PEG1000聚合物有更好的抵抗蛋白質(zhì)吸附結(jié)論相一致。

2.3.2 線(xiàn)形及分支狀A(yù)LC-0159和mPEG-PTX膠束在BSA溶液中穩(wěn)定性

在BSA溶液中，線(xiàn)形單分散、多分散及分支狀的ALC-0159和mPEG-PTX膠束粒徑隨時(shí)間變化結(jié)果如圖7所示。圖7（a）顯示：線(xiàn)形多分散ALC-0159（mPEG2000）的粒徑在第2天就開(kāi)始顯著增大，線(xiàn)形單分散ALC-0159（mPEG44）的膠束粒徑則在第3天起開(kāi)始緩慢增加，而分支狀單分散ALC-0159（mPEG23×2）在測(cè)試的第10天內(nèi)粒徑幾乎沒(méi)有變化，穩(wěn)定性好。圖7（b）表明：線(xiàn)形多分散mPEG2000-PTX在BSA溶液中，4 h出現(xiàn)膠束粒徑增大的現(xiàn)象，10 h后粒徑急劇增大到～450 nm，線(xiàn)形單分散mPEG44-PTX在6 h后粒徑開(kāi)始緩慢增加，這種緩慢增加的趨勢(shì)延續(xù)到14 h；（mPEG23）2-Lys-PTX在10 h內(nèi)膠束粒徑幾乎沒(méi)有變化，之后其粒徑則隨時(shí)間緩慢增加。ALC-0159的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于mPEG-PTX，這是由于mPEG-PTX在BSA的PBS緩沖液中，其酯基可快速水解，導(dǎo)致膠束解離。分支狀的膠束在BSA溶液中的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于線(xiàn)形單分散的，線(xiàn)形單分散膠束的穩(wěn)定性又大于其線(xiàn)形多分散的，這主要是由于分支狀的PEG在膠束表面具有更高的PEG密度，且相互纏結(jié)［28］，抵御BSA吸附的能力增強(qiáng)，從而分支狀的PEG化膠束在BSA溶液中有更好的穩(wěn)定性。因此，使用單分散PEG化膠束尤其是分支結(jié)構(gòu)PEG化膠束作為藥物納米載體時(shí)，具有更好的體外穩(wěn)定性。這有利于提高膠束在體內(nèi)的穩(wěn)定性并延長(zhǎng)藥物的體內(nèi)循環(huán)半衰期，以獲得更好的治療效果。

3 結(jié) 論

本文通過(guò)7種不同疏水基團(tuán)的兩親性PEG化膠束，研究了PEG分散性和結(jié)構(gòu)對(duì)PEG化膠束的理化特性的影響，主要結(jié)論如下：

a）線(xiàn)形單分散和多分散PEG化膠束的CMC及粒徑之間的差異可忽略，但線(xiàn)形單分散PEG化膠束在BSA溶液中展現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。

b）對(duì)于分子量相近但結(jié)構(gòu)不同的ALC-0159和mPEG-PTX，分支狀的PEG化膠束比對(duì)應(yīng)的線(xiàn)形膠束均具有更低的CMC和更小的粒徑，并且在BSA溶液中展現(xiàn)出更強(qiáng)的穩(wěn)定性。

目前，納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究均采用多分散PEG化膠束，依據(jù)本文研究顯示，線(xiàn)形及分支單分散PEG化膠束在BSA溶液中穩(wěn)定性更好，為開(kāi)發(fā)單分散PEG化膠束藥物遞送系統(tǒng)提供重要的指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn)：

［1］Mundel R， Thakur T， Chatterjee M. Emerging uses of PLA-PEG copolymer in cancer drug delivery［J］. 3 Biotech， 2022， 12（2）：41-52.

［2］Feng Y， Wang J， Zhang S， et al. Preparation of amentoflavone-loaded DSPE-PEG2000 micelles with improved bioavailability and in vitro antitumor efficacy［J］. Biomedical Chromatography： BMC， 2023， 37（9）： 5690-5699.

［3］Hattori Y， Tamaki K， Sakasai S， et al. Effects of PEG anchors in PEGylated siRNA lipoplexes on in vitro gene-silencing effects and siRNA biodistribution in mice［J］. Molecular Medicine Reports， 2020， 22（5）： 4183-4196.

［4］Sugiyama I， Sonobe T， Sadzuka Y. Effect of hybridized liposome by novel modification with some polyethyleneglycol-lipids［J］. International Journal of Pharmaceutics， 2009， 372（1）： 177-183.

［5］Mu L， Feng S S. A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel （Taxol）： PLGA nanoparticles containing vitamin E TPGS［J］. Journal of Controlled Release， 2003， 86（1）： 33-48.

［6］Zhao Y， Neuzil J， Wu K. Vitamin E analogues as mitochondria-targeting compounds： from the bench to the bedside？［J］. Molecular Nutrition amp; Food Research， 2009， 53（1）： 129-139.

［7］Fortner A， Schumacher D. First COVID-19 vaccines receiving the US FDA and EMA emergency use authorization［J］. Discoveries （Craiova， Romania）， 2021， 9（1）： 122-130.

［8］Lu J， Chuan X， Zhang H， et al. Free paclitaxel loaded PEGylated-paclitaxel nanoparticles： Preparation and comparison with other paclitaxel systems in vitro and in vivo［J］. International Journal of Pharmaceutics， 2014， 471（1）： 525-535.

［9］Teramura Y， Kuroyama K， Takai M. Influence of molecular weight of PEG chain on interaction between streptavidin and biotin-PEG-conjugated phospholipids studied with QCM-D［J］. Acta Biomaterialia， 2016， 30： 135-143.

［10］Chaudhari K R， Ukawala M， Manjappa A S， et al. Opsonization， biodistribution， cellular uptake and apoptosis study of PEGylated PBCA nanoparticle as potential drug delivery carrier［J］. Pharmaceutical Research， 2012， 29（1）： 53-68.

［11］Caprifico A E， Foot P J S， Polycarpou E， et al. Overcoming the protein corona in chitosan-based nanoparticles［J］. Drug Discovery Today， 2021， 26（8）： 1825-1840.

［12］Sofias A M， Dunne M， Storm G， et al. The battle of \"nano\" paclitaxel［J］. Advanced Drug Delivery Reviews， 2017， 122： 20-30.

［13］郝祖杭， 袁于民. mPEG鏈長(zhǎng)及分散性對(duì)mPEG-TPE膠束行為影響［J］. 浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)）， 2023， 49（3）： 365-373.

［14］戴江東， 李會(huì)鵬， 孫敏捷. 不同鏈長(zhǎng)聚乙二醇修飾的香豆素6脂質(zhì)納米粒對(duì)口服吸收的影響［J］. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2021， 52（3）： 293-300.

［15］Su Y， Liu M， Xiong Y， et al. Effects of stability of PEGylated micelles on the accelerated blood clearance phenomenon［J］. Drug Delivery Translational Research， 2019， 9（1）： 66-75.

［16］Xu Z， Li Q， Huang Y， et al. Blocking nonspecific interactions using Y-shape poly（ethylene glycol）［J］. International Joournal of Molecular Sciences， 2023， 24（15）： 12414-12426.

［17］Wang J， Rosario L S， Demirdirek B， et al. Comparison of PEG chain length and density on amphiphilic macromolecular nanocarriers： self-assembled and unimolecular micelles［J］. Acta Biomaterialia， 2009， 5（3）： 883-892.

［18］Hsu H J， Han Y， Cheong M， et al. Dendritic PEG outer shells enhance serum stability of polymeric micelles［J］. Nanomedicine， 2018， 14（6）： 1879-1889.

［19］Sim S L， He T， Tscheliessnig A， et al. Branched polyethylene glycol for protein precipitation［J］. Biotechnology and Bioengineering， 2012， 109（3）： 736-746.

［20］Vugmeyster Y， Entrican C A， Joyce A P， et al. Pharmacokinetic， biodistribution， and biophysical profiles of TNF nanobodies conjugated to linear or branched poly（ethylene glycol）［J］. Bioconjugate Chemistry， 2012， 23（7）： 1452-1462.

［21］Li X Q， Lei J D， Su Z G， et al. Comparison of bioactivities of monopegylated rhG-CSF with branched and linear mPEG［J］. Process Biochemistry， 2007， 42（12）： 1625-1631.

［22］Garg S M， Vakili M R， Lavasanifar A. Polymeric micelles based on poly（ethylene oxide） and α-carbon substituted poly（？-caprolactone）： An in vitro study on the effect of core forming block on polymeric micellar stability， biocompatibility， and immunogenicity［J］. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces， 2015， 132： 161-170.

［23］McNelles S A， Knight S D， Janzen N， et al. Synthesis， radiolabeling， and in vivo imaging of PEGylated high-generation polyester dendrimers［J］. Biomacromolecules， 2015， 16（9）： 3033-3041.

［24］Lukyanov A N， Torchilin V P. Micelles from lipid derivatives of water-soluble polymers as delivery systems for poorly soluble drugs［J］. Advanced Drug Delivery Reviews， 2004， 56（9）： 1273-1289.

［25］He Z Y， Chu B Y， Wei X W， et al. Recent development of poly（ethylene glycol）-cholesterol conjugates as drug delivery systems［J］. International Journal of Pharmaceutics， 2014， 469（1）： 168-178.

［26］Orienti I， Zuccari G， Falconi M， et al. Novel micelles based on amphiphilic branched PEG as carriers for fenretinide［J］. Nanomedicine： Nanotechnology， Biology， and Medicine， 2012， 8（6）： 880-890.

［27］Li S， Garreau H， Pauvert B， et al. Enzymatic degradation of block copolymers prepared from epsilon-caprolactone and poly（ethylene glycol）［J］. Biomacromolecules， 2002， 3（3）： 525-530.

［28］Chen H， Kim S， He W， et al. Fast release of lipophilic agents from circulating PEG-PDLLA micelles revealed by in vivo forster resonance energy transfer imaging［J］. Langmuir， 2008， 24（10）： 5213-5217.

［29］Lin W J， Juang L W， Lin C C. Stability and release performance of a series of pegylated copolymeric micelles［J］. Pharmaceutical Research， 2003， 20（4）： 668-673.

（責(zé)任編輯：廖乾生）