不同類型土壤接種根瘤菌對大豆共生固氮和根際氮轉(zhuǎn)化的影響

關(guān)鍵詞： 根瘤菌； 結(jié)瘤固氮； 硝化； 反硝化； 自生固氮

大豆是人類植物蛋白的重要來源，占世界所有植物蛋白產(chǎn)量的60% 以上[1]。大豆植株內(nèi)氮素除了來自肥料氮和土壤氮外，還有40%～70% 來自其自身根瘤所固定的氮[2]。因此，科研人員試圖通過接種高效根瘤菌來提高大豆的共生固氮能力，從而實現(xiàn)減少肥料氮的投入。在巴西和阿根廷等主要大豆生產(chǎn)國，80% 以上的大豆在種植過程中都會接種根瘤菌[ 3 ? 4 ]。盡管多項研究發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌能促進大豆氮吸收并提高產(chǎn)量[5]，但也有研究表明接種根瘤菌并未對大豆氮利用產(chǎn)生顯著影響，甚至會產(chǎn)生負面影響[6?7]。可見接種根瘤菌對大豆生長和氮利用的影響存在一定差異。有研究發(fā)現(xiàn)，即使同一大豆品種，接種同一根瘤菌種和在同一氣候下，但不同類型土壤中種植的大豆，其生長和氮利用仍然存在顯著差異[4]。這些接種效果的不確定性，給大豆根瘤菌接種的應用和推廣造成了很大挑戰(zhàn)。因此，以不同土壤類型的影響為切入點，研究接種根瘤菌對大豆共生固氮、根際氮轉(zhuǎn)化等氮利用過程的影響機制，對實現(xiàn)根瘤菌的高效接種和更廣泛的應用具有重要意義。

大豆共生固氮能力與根瘤的數(shù)量、鮮重和固氮酶活性密切相關(guān)[8]。大豆能夠與土著根瘤菌建立共生關(guān)系形成根瘤。與土著根瘤菌相比，接種競爭結(jié)瘤和固氮能力更強的根瘤菌能顯著提高大豆的共生固氮能力[9]；反之，接種競爭力弱的根瘤菌無法提高固氮能力甚至會產(chǎn)生抑制效果[10]。不同類型土壤中土著根瘤菌的菌群組成存在差異，因而接種根瘤菌與各類型土壤中土著菌之間的競爭強弱決定著接種效果[11]。此外，土壤理化性狀也會影響根瘤菌接種效果。例如無機氮含量低的土壤能夠有效促進大豆根系生長，進而促進根瘤的形成[12]。但無機氮含量高的土壤往往會抑制根瘤的形成。如高濃度的NO3?會抑制根瘤菌的侵染、根瘤的發(fā)育和固氮酶活性；高濃度NH4+甚至可以導致接種根瘤菌的大豆基本上不結(jié)瘤[13?14]。可見，接種的根瘤菌菌種、土著根瘤菌菌群和土壤理化性狀會綜合影響不同土壤類型中根瘤菌接種效果。但目前將三者綜合在一起的研究較少，相關(guān)信息缺乏。

根際氮素轉(zhuǎn)化對根瘤菌接種效果至關(guān)重要，是決定接種是否成功的另一重要因素。根際氮素轉(zhuǎn)化主要包括硝化、反硝化和自生固氮過程，分別由硝化菌、反硝化菌和自生固氮菌主導。氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細菌（AOB） 主導了硝化過程的限速步驟，受到廣泛關(guān)注。攜帶narG 基因和nifH 基因的微生物，則分別是反硝化菌和自生固氮菌的典型代表。NH4+和NO3?分別是硝化和反硝化的底物，同時也會對自生固氮菌產(chǎn)生深刻影響[15]。接種根瘤菌能夠改變根際土壤中NH4+和NO3?含量。一些研究表明，接種根瘤菌會增強大豆根系活力，促進根系氮素吸收，造成根際土壤NO3?和NH4+含量的降低[16]。但也有研究認為，接種根瘤菌提高了大豆共生固氮能力，滿足了大豆氮素需求，減少了土壤氮吸收，促進了根際NH4+和NO3?積累[17]。此外，接種根瘤菌能夠改變根構(gòu)型，而根構(gòu)型也會影響大豆的氮吸收，進而間接的影響根際土壤NO3?和NH4+濃度[18]。除土壤無機氮外，接種根瘤菌還會影響根際土壤可溶性有機碳和磷鉀濃度，這些也會對硝化、反硝化和自生固氮過程產(chǎn)生影響[18?19]。差異性土壤類型為大豆根際提供了不同的氮素轉(zhuǎn)化微生物菌群和土壤理化性狀，使得接種根瘤菌對硝化、反硝化和自生固氮的影響變得更為復雜，然而，目前尚未有相關(guān)研究明確影響這3 個過程的主導因素。

淮河流域是我國重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)域，其耕地面積占中國總面積的10%，貢獻了國家農(nóng)作物總產(chǎn)量的20%[20]。大豆是該區(qū)域主要種植作物之一，常年種植面積在50 萬hm2 以上。砂姜黑土和黃褐土為該區(qū)典型土壤類型。本研究采用盆栽試驗，選取黃褐土和砂姜黑土兩種類型土壤，并在前期篩選的1株根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum） 基礎上，設置大豆接菌和不接菌處理。通過比較各處理間大豆植株氮積累量、結(jié)瘤固氮能力、根際土壤氮轉(zhuǎn)化關(guān)鍵過程（硝化、反硝化、自生固氮） 及相關(guān)微生物群落組成（AOA、AOB、narG、nifH） 等指標的差異，以期闡釋不同類型土壤中根瘤菌接種效果差異的機制，為根瘤菌的廣泛應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試驗設計

試驗于2021 年在安徽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)萃園試驗基地（31°87′N、117°26′E） 進行。該地區(qū)屬于亞熱帶季風氣候，年平均降水量為998 mm，年平均溫度為15.7℃。供試土壤為黃褐土和砂姜黑土。黃褐土取自安徽農(nóng)業(yè)大學大楊店基地（31°88′N、117°26′E）。砂姜黑土取自安徽農(nóng)業(yè)大學皖北試驗站（33°69'N，117°09'E），這兩種土壤均取自長期冬小麥?夏玉米輪作農(nóng)田。試驗開始前的0—20 cm 耕層土壤理化性質(zhì)見表1。供試大豆品種與供試菌種分別為中黃13 和慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）。

試驗為盆栽試驗（盆高20 cm，內(nèi)徑28 cm），依據(jù)根瘤菌接種與否和土壤類型分為4 個處理：黃褐土+接種根瘤菌（YGL）、黃褐土+不接種根瘤菌（YCK）、砂姜黑土+接種根瘤菌（MGL） 和砂姜黑土+不接種根瘤菌（MCK）。每個處理6 次重復，播種時每盆播種6 粒，間苗時每盆留苗3 株。接種前將活化的菌株接種于酵母甘露醇液體培養(yǎng)基（YMA） 后，放置于28℃、160 r/min 的恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 天得到菌懸液，而后，將菌懸液濃度調(diào)至1.0×108 cfu/mL。播種前將需接種的大豆種子放入該菌懸液浸泡30 min。與此同時，不接種的大豆種子也放入滅菌的菌懸液浸泡30 min，作為對照。氮、磷和鉀肥種類分別為尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀。氮肥施用量為N 35.71mg /kg 鮮土，按照1∶1 的比例分別作為基肥和初花期（R1） 追肥施用。磷（P） 和鉀（K） 施用量均為24.29mg /kg 鮮土，作為基肥一次性施入。

1.2 取樣方法與測定指標

分別于初花期（R1） 和花莢期（R4） 取大豆植株和土壤樣品。將植株樣品在105℃ 下殺青30 min 后，在80℃ 下烘干至恒重并稱重。用毛刷掃下附著于根部1～2 mm 的土壤，收集起來作為根際土壤。過2 mm 篩后一部分放在?80℃ 冰箱儲藏，用于微生物DNA 提取。剩余部分存放于4℃ 冰箱，用于室內(nèi)培養(yǎng)試驗以及土壤理化性狀的測定。將根部放入尼龍網(wǎng)袋中，用清水緩慢清洗干凈后用根系掃描儀WinRhizo Program （Regent Instruments Inc. Canada） 進行掃根，測定總根長、根表面積、根體積和根尖數(shù)。用吸水紙擦干根系表面水分后，取下根瘤并記錄根瘤鮮重與數(shù)量。部分根瘤用于固氮酶活性測定和根瘤內(nèi)生固氮菌的提取。

1.2.1 植株全氮含量與根瘤和土壤固氮酶活性測定

將大豆植株各部分樣品粉碎后，過0.25 mm （60目） 篩。采用H2SO4?H2O2 溶液消煮樣品后，采用凱氏定氮儀（KN520 ALVA 中國） 測定氮含量。

采用乙炔（C2H2） 還原法測定根瘤固氮酶活性。稱取約1 g 根瘤于100 mL 血清瓶中，密封后用無菌注射器抽出10 mL 氣體，再注入等體積乙炔，28℃培養(yǎng)1 h。抽取10 mL 氣體，使用氣相色譜（Agilent7890A，Agilent Technologies，USA） 測定C2H4 濃度。固氮酶活性[mL/（g·h）]=還原乙烯量（C2H4 mL）/根瘤質(zhì)量（g）/反應時間（h）；根瘤固氮潛力[mL/（plant·h）]=根瘤固氮酶活性[mL/（g·h）]×根瘤鮮重（g/plant）。

取相當于10 g 干土的鮮土采用和根瘤相同的方法培養(yǎng)1 天后，依據(jù)上述方法測定土壤固氮酶活性。1.2.2 根際土壤理化性質(zhì)測定用pH 計（ST3100，奧豪斯，中國） 和電導率儀（IS228-Basic） 按照水土比5∶1 測定土壤pH 和土壤電導率（EC）；采用全自動間斷化學分析儀（Germany，CleverChem380plus）測定NO3?和NH4+含量；采用Multi C/N 3100 TOC 分析儀（德國，Analytik Jena） 測定可溶性有機碳（DOC）含量；采用火焰光度計（WGH6431，上海） 測定速效鉀（AK） 含量；采用鉬銻抗比色法測定速效磷（AP）含量[ 2 1 ]；采用凱氏定氮儀（KN520） 測定土壤全氮（TN） 含量；參照Nelson 等[22]的方法測定土壤全碳（TC） 含量。

1.2.3 硝化勢和反硝化能力測定 參照Taylor 等[23]的方法測定根際土壤硝化勢（nitrification potential，NP）。每個處理取相當于10 g 干土的鮮土，放入100 mL的血清瓶中，用無菌注射器注入50 mL 培養(yǎng)液 （1 mol/LNH4+），之后在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（29℃，200 r/min） 中培養(yǎng)48 h。在第 0、6、12、24、36、48 h各取1 次樣。每次吸取4 mL 懸浮液于離心管，離心后取上清液，采用全自動間斷化學分析儀（Germany，CleverChem380plus） 測定土壤NO3?和NO2?的含量，并計算硝化勢。

采用?imek 等[24]的方法測定根際土壤反硝化能力（denitrification capacity，DC）。取相當于10 g 干土的鮮土置于血清瓶中，用無菌注射器加入5 mL KNO3培養(yǎng)液（42.9 mmol/L NO3?），蓋緊瓶塞后對血清瓶進行抽真空。用He 氣反復沖洗血清瓶3 次。用無菌注射器抽出10 mL 氣體，再注入等體積乙炔，平衡大氣壓后將血清瓶放于恒溫培養(yǎng)箱25℃ 培養(yǎng)48 h。分別在第24h 和48 h 時抽取10 mL 瓶內(nèi)氣體（取樣后會補充等量的氦氣）。采用氣相色譜儀（Agilent 7890A，Agilent Technologies，USA） 測定N2O 濃度。依據(jù)24 h 到48 h 的N2O 濃度計算土壤反硝化能力。

1.2.4 Real-time qPCR 分析和高通量測序 稱取0.5 g 土樣，用土壤 DNA 試劑盒（Fast DNA SPIN KitFor Soil， USA） 提取土壤微生物總 DNA。稱取約0.5 g 根瘤放入2 mL 離心管，用全自動樣品快速研磨儀（JXFSTPRP-64L，中國） 粉碎混勻后，準確稱取0.1 g 采用FT Plant DNA Kit 試劑盒（南京建成生物工程研究所） 提取根瘤總DNA。采用實時熒光定量PCR 系統(tǒng)（StrataGene Mx3005P，美國） 測定AOA （ammonia-oxidizing archaea）、AOB （ammoniaoxidizingbacteria）、narG 和nifH 的豐度，所用引物見表2。微生物PCR 的體系都是20 mL，包括：1 μL 目標DNA，10 μL 的2×SG Green qPCR Mix，0.5 μL 的10 μM 上下游引物，8 μL 蒸餾水。qPCR 的反應程序為：95℃ 預變性10 min；95℃ 變性20 s，60℃ 復性30 s，72℃ 延伸30 s，45 個循環(huán)。將含有目標基因片段的質(zhì)粒以10 倍梯度稀釋，生成AOA、AOB、narG 和nifH 功能基因的標準曲線。最終AOA、AOB、narG 和nifH 的擴增效率分別為106%、100%、107% 和97%。

通過高通量測序測定根瘤內(nèi)生固氮菌和根際自生固氮菌。擴增引物和PCR 條件與上述相同。將目標PCR 產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳，用GenElute 凝膠提取試劑盒（Sigma-Aldrich，美國） 純化。用純化后的PCR 產(chǎn)物進行測序（Illumina Novaseq，美國）。

原始序列使用Vsearch 進行質(zhì)量過濾、去嵌合體和聚類等步驟后，用FrameBot （https：//github.com/rdpstaff/Framebot） 進行矯正，最終獲得高質(zhì)量序列。在97%相似度水平對高質(zhì)量序列聚類，并分別輸出代表序列和可操作的分類單元（OTU）。使用NCBI 數(shù)據(jù)庫對nifH 功能基因的OTU 進行注釋后用于后續(xù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

通過高通量測序測定根瘤內(nèi)生固氮菌和根際自生固氮菌。擴增引物和PCR 條件與上述相同。將目標PCR 產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳，用GenElute 凝膠提取試劑盒（Sigma-Aldrich，美國） 純化。用純化后的PCR 產(chǎn)物進行測序（Illumina Novaseq，美國）。原始序列使用Vsearch 進行質(zhì)量過濾、去嵌合體和聚類等步驟后，用FrameBot （https：//github.com/rdpstaff/Framebot） 進行矯正，最終獲得高質(zhì)量序列。在97%相似度水平對高質(zhì)量序列聚類，并分別輸出代表序列和可操作的分類單元（OTU）。使用NCBI 數(shù)據(jù)庫對nifH 功能基因的OTU 進行注釋后用于后續(xù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

使用Excel 2016 和R 軟件進行數(shù)據(jù)整理和作圖。使用SPSS 23 進行相關(guān)性分析和配對樣本t檢驗（Plt;0.05 為差異顯著）。優(yōu)勢OTUs 的相對豐度（相對豐度gt;1%） 通過Circos 柱狀累積圖進行可視化。使用SmartPLS 4.0 構(gòu)建偏最小二乘路徑模型（PLS-PM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型土壤中接種根瘤菌對大豆植株氮積累的影響

由圖1 可知，接種根瘤菌在兩種土壤中對植株氮積累產(chǎn)生的效果相反。在黃褐土中，接種根瘤菌能顯著提高植株氮積累量。相比于YCK 處理，YGL處理下大豆植株氮素積累量在初花期（R1） 和花莢期（R4） 分別提高了33.6% 和24.9%。在砂姜黑土中，接種根瘤菌則導致植株氮積累量顯著降低。與MCK相比，MGL 處理植株氮素積累量在R1 和R4 期分別下降了21.7% 和20.7%。

2.2 不同類型土壤中接種根瘤菌對大豆結(jié)瘤固氮的影響

由表3 可知，接種根瘤菌在兩種土壤中對大豆結(jié)瘤固氮能力的影響不同。在黃褐土中，接種根瘤菌能夠提高大豆結(jié)瘤固氮。與YCK 相比，YGL 處理在R1 和R4 期分別提高了38.5% 和29.6% 的根瘤鮮重、35.8% 和22.2% 的根瘤數(shù)量、14.6% 和13.0%的固氮酶活性、58.6% 和46.5% 的根瘤固氮潛力。在砂姜黑土中，接種根瘤菌則會對大豆結(jié)瘤固氮產(chǎn)生抑制作用。與MCK 相比，MGL 處理在R1 和R 4 期分別降低了3 7 . 2% 和1 5 . 8% 的根瘤鮮重、32.8% 和20.0% 的根瘤數(shù)量、23.9% 和15.6% 的固氮酶活性、51.3% 和28.9% 的根瘤固氮潛力。

2.3 植株氮素積累與結(jié)瘤固氮指標的相關(guān)性與PLS 分析

由表4 可知，在黃褐土中，R1 和R4 期的根瘤鮮重、固氮酶活性和根瘤固氮潛力與植株氮積累均呈顯著正相關(guān)。根瘤數(shù)量僅在R4 期與植株氮積累顯著正相關(guān)。在砂姜黑土中，R1 和R4 期的根瘤鮮重、根瘤數(shù)量、固氮酶活性和根瘤固氮潛力與植株氮積累均呈顯著正相關(guān)。

采用PLS 評估了接種根瘤菌對黃褐土和砂姜黑土中大豆根瘤數(shù)量、單個根瘤平均鮮重、根瘤鮮重、酶活性、固氮潛力和氮積累的影響。在黃褐土中，接種根瘤菌通過增加根瘤數(shù)量促進了根瘤鮮重、固氮潛力和氮積累的提高（圖2A）。在砂姜黑土中，根瘤數(shù)量和酶活性是影響根瘤鮮重、固氮潛力和氮積累的主要因素（圖2B）。

2.4 不同類型土壤中接種根瘤菌對根瘤內(nèi)生固氮菌豐度和結(jié)構(gòu)的影響

由圖3A 可知，接種根瘤菌在兩種土壤中均未顯著改變根瘤內(nèi)生固氮菌（nifH） 豐度。在根瘤內(nèi)生固氮菌結(jié)構(gòu)方面，兩種類型土壤存在顯著差異（圖3B）。在不接菌條件下，黃褐土中Bradyrhizobium 占據(jù)主導地位，在R1 和R4 期其相對占比分別為39.6% 和40.5%，接種根瘤菌能夠顯著提高Bradyrhizobium 相對占比，相比于YCK，YGL 在R1 和R4 期分別增加114.4% 和40.5%。在砂姜黑土中Sinorhizobium 占據(jù)主導地位，不接菌條件下，未發(fā)現(xiàn)Bradyrhizobium的存在，接種根瘤菌后，其結(jié)構(gòu)發(fā)生一定改變，相比于MCK，MGL Sinorhizobium 相對豐度占比在R1和R4 期分別降低6.7% 和10.1%，Bradyrhizobium相對豐度占比在R1 和R4 期分別為6.9% 和9.7%。

2.5 不同類型土壤中接種根瘤菌對大豆根際硝化、反硝化和自生固氮的影響

由圖4 可知，接種根瘤菌在兩種土壤中對硝化勢的作用效果相反。在黃褐土中，接菌會使大豆根際土壤硝化勢顯著降低，相比于YCK，YGL 處理的硝化勢在R1 和R4 期分別降低36.7% 和32.3%。在砂姜黑土中，接種根瘤菌則會導致硝化勢顯著增強，相比于MCK，MGL 處理的硝化勢在R1 和R4期分別增加10.9% 和6.7%。接種根瘤菌在兩種土壤中均能使根際反硝化能力顯著降低。在黃褐土中，相比于YCK，YGL 處理的反硝化能力在R1 和R4期分別降低11.5% 和18.2%。在砂姜黑土中，相比于MCK，MGL 處理的反硝化能力在R1 和R4 期分別降低25.5% 和16.2%。

接種根瘤菌在兩種土壤中對根際固氮酶活性的影響有所不同。在黃褐土中，接種根瘤菌對R1 期根際固氮酶活性未產(chǎn)生顯著影響，但在R4 期卻使其活性顯著增高，相比于YCK，YGL 處理的根際固氮酶活性在R4 期增加38.4%。在砂姜黑土中，接種根瘤菌則會使根際固氮酶活性顯著增高，相比于MCK，MGL 處理的根際固氮酶活性在R1 和R4 期分別增加64.8% 和35.0%。

2.6 不同類型土壤中接種根瘤菌對大豆根際土壤氮轉(zhuǎn)化基因豐度的影響

由圖5 可知，接種根瘤菌對兩種根際土壤中AOA 豐度的影響不同。在黃褐土中，接種根瘤菌能夠顯著降低AOA 豐度，相比于YCK，YGL 處理的AOA 豐度在R1 和R4 期分別降低29.7% 和18.9%。在砂姜黑土中接種根瘤菌并未顯著影響AOA 豐度。接種根瘤菌對兩種土壤中AOB 豐度產(chǎn)生的影響相反。在黃褐土中，接種根瘤菌能夠顯著降低根際AOB 豐度，相比于YCK，YGL 在R1 和R4 期分別降低33.2% 和24.4%。在砂姜黑土中，接種根瘤菌能夠顯著提高AOB 豐度，相比于MCK，MGL 在R1 和R4 期分別提高64.5% 和30.3%。

接種根瘤菌對兩種土壤中narG 豐度的影響不同。在黃褐土中，接種根瘤菌并未顯著影響narG豐度。而在砂姜黑土中接種根瘤菌則會使narG 豐度顯著降低，相比于MCK，MGL 在R1 和R4 期分別降低14.2% 和31.3%。接種根瘤菌對兩種土壤中nifH 豐度的影響也不相同。在黃褐土中，接種根瘤菌對R1 期根際nifH 豐度并未產(chǎn)生顯著影響，但在R4 期卻使其豐度顯著提高，相比于YCK，YGL 處理的nifH 豐度在R4 期提高了32.4%。在砂姜黑土中，接種根瘤菌對兩時期nifH 豐度均未產(chǎn)生顯著影響。

2.7 不同類型土壤中接種根瘤菌對大豆根際土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖6 可知，接種根瘤菌對兩種土壤中褐球固氮菌（Azotobacter） 的相對豐度占比均產(chǎn)生了影響。在黃褐土中，接種根瘤菌對R1 期褐球固氮菌相對豐度占比未產(chǎn)生顯著影響，但顯著提高了R4 期褐球固氮菌相對豐度占比，與YCK 處理相比，YGL 處理在R4 期褐球固氮菌相對豐度占比增加了182.9%。在砂姜黑土中，接種根瘤菌顯著提高R1 和R4 期褐球固氮菌的相對豐度占比，相比于MCK，MGL 處理褐球固氮菌在R1 和R4 期的相對豐度占比分別增加了76.3% 和16.4%。

2.8 不同類型土壤中接種根瘤菌對根際土壤理化性質(zhì)的影響

由表5 可知，接種根瘤菌對兩種土壤中大豆根際土壤理化性質(zhì)的影響不同。在黃褐土中，接種根瘤菌會使AK、AP、DOC 和NO3?顯著降低；相比于YCK，YGL 在R1 和R4 期的AK 分別降低8.6% 和8.3%，AP 分別降低10.6% 和11.1%，DOC 分別降低15.7% 和9.9%，NO3?分別降低9.7% 和13.0%。NH4+和TC 在兩時期同樣均降低，相比于YCK，Y G L 在R 1 和R 4 期的N H 4+分別降低1 8 . 1% 和5.3%，TC 分別降低4.5% 和1.1%。接種根瘤菌對兩時期根際土壤pH 均未產(chǎn)生顯著影響。

在砂姜黑土中，接種根瘤菌會降低AK、DOC和NO3?，但會增加AP 的含量，相比于MCK，MGL在R1 和R4 期的AK 分別降低6.8% 和6.6%，DOC分別降低7.9% 和8.8%，NO3?分別降低21.4% 和10.7%，AP 分別升高27.2% 和31.2%；NH4+在R1 期顯著升高，在R4 期顯著降低，相比于MCK，MGL的NH4+在R1 期增加17.7%，在R4 期減少10.3%。此外，接種根瘤菌對兩時期的pH 和TC 均未產(chǎn)生顯著影響。

2.9 不同類型土壤中接種根瘤菌對大豆根系的影響

由表6 可知，接種根瘤菌在兩種土壤中對根系生長發(fā)育狀況的影響不同。在黃褐土中，接種根瘤菌能夠促進根系生長發(fā)育，相比于YCK，YGL 在R1 和R4 期分別提高了33.0% 和48.7% 的根長、36.3% 和45.0% 的根表面積、45.6% 和44.0% 的根體積和37.7% 和57.6% 的根尖數(shù)。而在砂姜黑土中，接種根瘤菌會抑制根系生長發(fā)育，相比于MCK，MGL 在R1 和R4 期分別降低了16.0% 和33.4% 的根長、17.2% 和33.1% 的根表面積、16.8% 和29.5% 的根體積與3.4% 和29.3% 的根尖數(shù)。

2.10 結(jié)構(gòu)方程模型

用PLS 評估了接種根瘤菌對黃褐土和砂姜黑土中根際土壤理化性質(zhì)、氮轉(zhuǎn)化微生物豐度、氮轉(zhuǎn)化過程和氮積累的影響（圖7）。在黃褐土中，接種根瘤菌對硝化、反硝化和自生固氮過程均產(chǎn)生了顯著影響。其中，硝化過程是決定大豆氮素積累的主要因素。AOA 和AOB 是主導硝化潛勢的主要因子。接種根瘤菌通過影響根際AK 和NH4+調(diào)控AOA 豐度，通過影響NH4+調(diào)控AOB 豐度。對反硝化過程來說，narG 影響了DC，而接種根瘤菌導致DOC 的變化是影響narG 豐度的主要因素。褐球固氮菌（Azotobacter）相對豐度占比與SNP 存在顯著聯(lián)系，而接種根瘤菌導致NO3?的變化是影響褐球固氮菌相對豐度占比的主要因素（圖7A）。

與黃褐土類似，在砂姜黑土中接種根瘤菌也對硝化、反硝化和自生固氮過程均產(chǎn)生一定影響。其中，硝化過程同樣也是決定大豆氮素積累的主要因素。接種根瘤菌分別通過影響根際AP 和AK 調(diào)控AOA 和AOB 豐度。AOB 而非AOA 是影響硝化過程的主導因子。對反硝化過程來說，narG 影響了DC，而接種根瘤菌導致NO3?的變化是影響narG 豐度的主要因素。在自生固氮方面，與黃褐土類似，NO3?也是影響褐球固氮菌相對豐度占比的主要因素（圖7B）。

3 討論

3.1 不同類型土壤中接種根瘤菌對大豆氮積累和結(jié)瘤固氮的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，無論在黃褐土還是砂姜黑土中，接種根瘤菌均能顯著影響大豆植株氮積累，但作用效果相反。在黃褐土中，接種根瘤菌能夠顯著促進大豆植株氮積累，而在砂姜黑土中，則抑制大豆植株氮積累（圖1）。前人也報道在不同土壤類型條件下，接種根瘤菌會促進或抑制大豆的氮積累[25]。一般而言，大豆根瘤固氮潛力是影響大豆植株氮素積累的重要因素。大豆固氮潛力主要受到根瘤鮮重和固氮酶活性的影響[26]。對于根瘤鮮重來說，接種根瘤菌可能會通過增加單個根瘤鮮重或根瘤數(shù)提高根瘤總鮮重（圖2）。我們研究發(fā)現(xiàn)，在兩種土壤類型中接種根瘤菌均沒有提高單個根瘤鮮重，但顯著影響了根瘤數(shù)量。在黃褐土和砂姜黑土中分別表現(xiàn)出促進和抑制作用。可見，接種根瘤菌主要通過影響根瘤數(shù)量而非單個根瘤鮮重來改變根瘤總鮮重，這與前人[27]研究結(jié)果類似。根瘤數(shù)量受到根系與根際土壤根瘤菌的交互影響[28?29]。不接種情況下，根瘤主要由土著優(yōu)勢根瘤菌通過侵染根系形成。接種后，接種根瘤菌會對根際土著根瘤菌結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響。在黃褐土中，接種根瘤菌增加了根際土著優(yōu)勢根瘤菌的相對豐度，因此會增加根系侵染位點，促進根瘤數(shù)量的增加。但在砂姜黑土中，接種根瘤菌減弱了土著優(yōu)勢根瘤菌的相對豐度，可能對其侵染產(chǎn)生了負面影響，降低了侵染位點和根瘤數(shù)[30]。可見，接種菌與土壤土著優(yōu)勢根瘤菌的正向或負向影響是決定侵染位點數(shù)和根瘤數(shù)的關(guān)鍵所在。此外，根系是影響根瘤數(shù)的另一重要因素[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，在黃褐土和砂姜黑土中，接種根瘤菌分別促進和抑制了根系長度和根表面積（表6）。根系長度和根表面積的增加或降低會相應影響根瘤菌的侵染位點數(shù)，進而影響根瘤數(shù)量。

固氮酶活性是影響大豆根瘤固氮潛力的另一重要因素[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌顯著提高了黃褐土中的根瘤固氮酶活性，但卻降低了砂姜黑土的根瘤固氮酶活性（表3）。通過檢測根瘤內(nèi)生固氮菌豐度，發(fā)現(xiàn)在兩種土壤中接種根瘤菌并沒有顯著提高其豐度。由此推測，根瘤菌固氮酶活性可能與其根瘤內(nèi)生固氮菌結(jié)構(gòu)存在一定關(guān)系。通過分析其結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌可顯著影響根瘤中優(yōu)勢固氮菌相對豐度，進而改變其菌群結(jié)構(gòu)。在黃褐土中，接種根瘤菌顯著增加了優(yōu)勢固氮菌的相對豐度。而在砂姜黑土中接種根瘤菌卻降低了其優(yōu)勢固氮菌的相對豐度。這可能與接種的根瘤菌與黃褐土中的固氮菌屬于同一屬，而與砂姜黑土的固氮菌則遺傳距離較遠有關(guān)。有研究表明，微生物菌群中優(yōu)勢微生物是決定功能酶活性的關(guān)鍵因素[32]。因此，接種根瘤菌增強了黃褐土中優(yōu)勢微生物的占比，但減弱了砂姜黑土中優(yōu)勢微生物的占比，進而相應的增強或減弱了根瘤固氮酶活性。

3.2 不同類型土壤中接種根瘤菌對大豆根際氮轉(zhuǎn)化及其相關(guān)微生物的影響

根際氮轉(zhuǎn)化是調(diào)控植物氮積累的另一重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌會顯著影響根際硝化、反硝化和自生固氮過程（圖4）。在這3 個過程中，根際硝化過程與大豆氮素積累密切相關(guān)（圖7）。接種根瘤菌顯著降低了黃褐土根際硝化過程，但卻顯著增加了砂姜黑土的硝化過程。硝化過程的減弱有利于增加根際氮素保持時間，進而有利于植物的氮吸收和積累，相反亦然。因此，接種根瘤菌減弱黃褐土的硝化過程和增強砂姜黑土的硝化過程會分別促進和抑制大豆氮素積累。在黃褐土中，硝化過程主要受到AOA 和AOB 的共同影響。接種根瘤菌會通過顯著影響根際AK 和NH4+調(diào)控AOA 豐度，并會通過影響NH4+調(diào)控AOB 豐度。NH4+作為硝化過程的底物會顯著影響AOA 和AOB 的豐度[ 3 3 ? 3 4 ]。與NH4+相比，AK 并非硝化過程的底物，但卻是氨氧化微生物的主要養(yǎng)分來源。黃褐土為弱酸性土壤，而在這類土壤中硝化過程主要由AOA 主導。因此，AK會通過調(diào)控AOA 影響根際硝化過程，這與Chen 等[35]的研究結(jié)果類似。在砂姜黑土中，硝化過程主要受到AOB 而非AOA 的影響（圖7）。這可能與砂姜黑土的pH 值有關(guān)。與黃褐土不同，砂姜黑土呈弱堿性。研究發(fā)現(xiàn)，弱堿性土壤中AOB 在硝化過程中占據(jù)主導作用[36]。

對反硝化而言，接種根瘤菌也會顯著影響根際反硝化能力。narG 豐度與反硝化能力顯著正相關(guān)（圖7 ）。在黃褐土中接種根瘤菌會通過降低根際DOC 含量影響narG 豐度，而在砂姜黑土中則會通過調(diào)節(jié)NO3?含量影響narG 豐度。DOC 是反硝化的電子供體，控制著反硝化強度。本研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌后均降低了砂姜黑土和黃褐土中根際DOC 含量，但作用機理不同。在黃褐土中，接種根瘤菌促進了結(jié)瘤固氮，可能消耗了大豆植株中大量的碳，因此降低了碳向土壤的輸出，導致根際DOC 的下降[ 3 7 ]。而在砂姜黑土中，接種根瘤菌抑制了結(jié)瘤固氮，可能限制了大豆植株的生長，因此降低了碳向根際的運輸量。由于黃褐土中DOC 含量顯著低于砂姜黑土，接種根瘤菌進一步降低了其DOC 含量，使DOC 成為narG 型反硝化微生物的主要限制因素[ 3 8 ]。在砂姜黑土中narG 型反硝化菌豐度不受電子供體DOC 含量的限制，但卻受電子受體NO3?的顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌后會顯著降低砂姜黑土中大豆根際NO3?含量。主要原因可能是該土壤中接種根瘤菌抑制大豆結(jié)瘤固氮能力，大豆會從土壤中吸收更多的NO3?，導致其含量顯著降低。

在自生固氮方面，接種根瘤菌能夠刺激根際自生固氮酶活性（圖4）。nifH 型固氮菌的結(jié)構(gòu)而非豐度與自生固氮酶活性密切相關(guān)（圖7）。褐球固氮菌是土壤中最具代表性的自生固氮細菌之一[39]。本研究發(fā)現(xiàn)，在砂姜黑土和黃褐土中其相對豐度占比均與自生固氮酶活性呈顯著正相關(guān)（圖7）。在這兩種土壤中接種根瘤菌均可提高褐球固氮菌的相對豐度占比（圖6）。褐球固氮菌相對豐度占比的提高可能與接種根瘤菌后兩種土壤根際NO3?含量的降低有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，褐球固氮菌對NO3?含量極其敏感，較高的NO3?含量會對其產(chǎn)生抑制效果[40]。

4 結(jié)論

接種根瘤菌能顯著影響大豆結(jié)瘤固氮能力、根際土壤自生固氮能力、硝化和反硝化過程。大豆植株氮素積累主要受到大豆結(jié)瘤固氮能力和根際硝化過程的影響，影響效果在黃褐土和砂姜黑土中的表現(xiàn)不同。在黃褐土中，接種根瘤菌通過提高根瘤數(shù)量和降低硝化強度的途徑來分別提高大豆結(jié)瘤固氮能力和根際氮素保持能力，增加大豆植株氮素積累。在砂姜黑土中，接種根瘤菌增加硝化過程強度，降低根瘤數(shù)量和固氮酶活性，減弱結(jié)瘤固氮能力，進而降低大豆氮素積累量。