石灰與綠肥對連作雪茄煙田土壤理化性質與真菌群落的影響

關鍵詞： 石灰； 綠肥； 連作； 雪茄煙； 真菌； 群落結構； 功能類群

土壤中真菌作為土壤微生物中重要的成員，在有機質分解、物質和能量轉化中發揮著重要的作用[1]。土壤真菌群落多樣性與群落結構受土壤溫濕度、pH 等環境因子變化的影響而極易發生改變。近幾十年，為提高作物產量，減少病蟲害的發生，農業生態系統中投入大量的化肥與農藥，對土壤質量和生態環境產生較大的負面影響，而農作物連作種植模式下農田更需要不間斷地施用各種肥料與農藥，加劇了其負面效應。長期施用化肥在造成土壤酸化、板結等問題的同時，還會降低微生物多樣性、影響微生物群落結構[2?3]。而化學農藥的施用雖然有效減少了病蟲害的發生，但大量農藥殘留在土壤生態環境中，降低了土壤有益微生物的豐度[4] 。有研究表明，施用生物質炭、石灰、有機肥、微生物菌劑等措施[5?7]可改善土壤微生物群落結構，起到改良土壤的目的。其中綠肥還田可提高土壤有機質及土壤微生物量[8?10]。石灰還田可在短時間有效提高土壤pH，緩解土壤酸化現象，降低酸化對土壤根際微生物群落的危害[11]。因此施用石灰與綠肥還田均可從不同方面改良土壤，但二者對真菌群落的影響還有待進一步研究。本試驗以連作雪茄煙田為研究對象，比較了施石灰、施石灰+綠肥還田、綠肥還田3 種土壤改良措施對土壤理化性狀與不同微生物區系生物數量的影響，并借助Illumina NovaSeq 高通量測序技術和FUNGuild 平臺分析了3 種改良措施對真菌群落多樣性、組成結構、營養型組成及功能類群的影響，同時對相應土壤改良措施下雪茄煙的經濟效益進行對比分析，旨在為改善連作煙田土壤微生態環境，提高土壤肥力，增加雪茄煙生產經濟效益提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和材料

試驗于2021—2022 年在湖北省恩施土家族苗族自治州來鳳縣綠水鎮進行。試驗地平均海拔約500 m，雪茄煙連作年限達12 年，土壤較為板結，酸化現象較為嚴重，肥力有所下降，病害發生率呈上升趨勢，煙葉產量較低。土壤pH 4.45，堿解氮 91.7 mg/kg，速效磷 70.3 mg/kg，速效鉀 244.3 mg/kg，有機質18.9 g/kg，全氮 1.3 g/kg。試驗雪茄煙品種CX80 為當地主栽品種之一，還田所用石灰為當地市售生石灰，其主要成分為CaO。綠肥品種為光葉紫花苕子。

1.2 試驗設計

采用隨機區組實驗設計，研究石灰、綠肥還田兩種措施，共設置4 個處理，分別為：1） 對照 （CK），即不施石灰、不種植綠肥；2） 施石灰（L），石灰用量為1500 kg/hm2，施肥前均勻撒施于小區地表后翻耕；3） 綠肥還田（GM），在上一年雪茄煙采收結束（2021 年10 月） 后，均勻撒播綠肥種子37.5 kg/hm2，于次年開春將生長的綠肥就地全量還田；4） 施石灰+綠肥還田（LGM），石灰施用量、綠肥播種量及相應處理方式分別同L 處理與GM 處理。各處理石灰與綠肥還田時間均設置在煙苗移栽前40 天（2022 年3 月） 完成，煙苗移栽時間均為4 月28 日。每個處理3 次重復，60 株雪茄煙為1 個小區（面積18.48 m2），株行距0.40 m×1.10 m。各小區以復合肥、有機肥、過磷酸鈣作為基肥，硝銨磷肥、硫酸鉀作為追肥，且氮磷鉀肥料施用總量、施用時間、施用方式均相同，施肥比例N∶P2O5∶K2O=1∶0.9∶2.5，其他按照當地優質雪茄煙生產技術規范統一管理。

1.3 樣品采集

在2022 年雪茄煙收獲后，按不同處理小區采集耕作層0—20 cm 土壤混合樣品。采集方法為每小區5 個采樣點，每個采樣點先用鐵鍬鏟去表層約3 cm深的土壤，再采集同等質量的耕作層土壤，均勻混合為1 個樣本。去除植物根系等雜質后用于后續土壤理化性狀、微生物量測定及測序分析。

1.4 基因組DNA 的提取、PCR 擴增及測序

使用 Fast DNA Spin Kit for Soil DNA 提取試劑盒（MP Bio-medicals， 美國） 提取樣品中的總 DNA，具體提取方法參照試劑盒說明書。再利用 1% 瓊脂糖凝膠電泳（DDY-6C，北京市六一儀器廠，中國） 檢測 DNA 提取質量，NanoDrop 2000 （Thermo FisherScientific，美國） 檢測DNA 濃度和純度。取適量的樣本DNA 于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，使用引物ITS5-1737F （5'?GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG?3'） 和ITS2-2043R （5'?GCTGCGTTCTTCATCGATGC?3'） 對樣品的ITS1 可變區進行PCR 擴增。擴增程序：95℃ 預變性 1 min；98℃ 變性10 s，50℃退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，30 個循環；72℃ 穩定延伸5 min。PCR 反應總體系為30 μL：2× Phusion MasterMix with GC Buffer 15 μL，上下游引物（2 μmol/L） 各2 μL，gDNA （1 ng/μL） 10 μL，用無菌水補足至 30 μL。將合格的擴增產物送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司，使用 NovaSeq 6000 （Illumina，美國） 進行上機測序。

測序數據經質控處理后，采用U p a r s e 算法（Uparse，Version 7.0.1001） 對樣本的全部有效數據進行聚類，默認以97% 的一致性（identity） 將序列聚類成為OTUs （operational taxonomic units）。使用QIIME 軟件（Version 1.9.1） 將OTUs 代表序列與Unite 數據庫（Version 8.2） 進行比對，得到各樣本在真菌各個分類水平的物種注釋。使用QIIME 軟件（Version 1.9.1） 計算 OTUs、Chao1、Shannon、Simpson、ace、Goods-coverage、PD_whole_tree 指數。使用R 軟件（Version 2.15.3） 繪制PCoA 分析圖。使用LEfSe （LDA Effect Size） 分析工具進行LEfSe 分析（LDA≥4.0）。使用 FUNGuild 軟件 （Version 1.0） 對OTUs 進行功能預測。

1.5 土壤微生物數量、理化性狀測定

微生物數量采用稀釋平板計數法[12]測定，細菌、真菌、放線菌培養基分別用牛肉膏蛋白胨瓊脂、PDA和改良高氏 1 號瓊脂培養基。土壤微生物總量計為細菌、真菌、放線菌三者數量之和。土壤pH、堿解氮、速效鉀、速效磷、有機質、全氮參照鮑士旦[13]的方法測定。

1.6 雪茄煙經濟性狀測定

以小區為單位掛牌采收和晾制，晾制結束后統計各小區雪茄煙產量，并根據湖北省恩施州2022 年雪茄煙收購標準測算均價與產值。

1.7 數據處理與統計分析

利用 Microsoft Excel 2007 軟件對基本數據進行整理并繪圖，使用SPSS 22.0 軟件開展方差分析，并在0.05 水平下采用Duncan’s 新復極差法檢驗處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 土壤基本理化性質分析

表1 顯示，3 種土壤改良措施均可不同程度地提高土壤pH 值，但僅L 和LGM處理顯著高于CK 處理。除L 處理外，LGM 和GM處理全氮、有機質、速效鉀均顯著高于CK 處理，以LGM 處理全氮、有機質含量最高，且均顯著高于L 處理。3 種土壤改良措施均可顯著提高土壤堿解氮含量，但各處理之間差異不顯著。各處理間有效磷均無顯著差異。說明施用石灰的處理均可顯著提高土壤pH 值，改善土壤酸化現狀，而種植綠肥并進行了翻壓的處理則可顯著提高土壤全氮、有機質及速效鉀等養分含量，且以施用石灰與翻壓綠肥相結合的效果更佳。

2.2 土壤微生物區系及數量分析

3 種土壤改良措施對土壤不同微生物區系及數量的影響差異顯著（表2）。L、LGM 和GM 處理均可顯著增加土壤中細菌數量，相比CK 處理分別增加23.22%、68.07%、46.70%，各處理間差異均達到顯著水平。不同于細菌，L 和LGM 處理不同程度降低了土壤中真菌數量，且L 處理中真菌數量顯著低于CK 處理，GM 處理則顯著增加了土壤中真菌數量，相比CK 處理增加12.25%。相比CK 處理，L、LGM和GM 處理均可不同程度顯著增加土壤中放線菌數量，分別增加16.87%、21.19%、10.91%。與細菌相同，L、LGM 和GM 處理均顯著增加土壤中微生物總量，比CK 處理分別增加22.06%、62.12%、42.42%，且處理間均存在顯著差異。說明施用石灰與翻壓綠肥均可增加土壤中細菌、放線菌及微生物總量，且以兩者結合效果最好。施用石灰能有效降低土壤中真菌數量，與翻壓綠肥作用相反。

2.3 真菌群落多樣性比較分析

在97% 相似水平下，各處理土壤樣品真菌OTU豐度和 Alpha 多樣性指數見表3。測序深度指數（Goods_coverage） 越接近于1，說明測序深度已經基本覆蓋到樣本中所有的物種。各樣本測序深度指數均在0.994～0.995，說明測序結果合理。

LGM 和GM 處理的OTU 數均高于CK 處理，但僅GM 與CK 處理之間差異達到顯著水平，高出CK處理15.01%。Shannon 和Simpson 指數為微生物群落多樣性指數，Shannon 指數值越大群落多樣性越高，Simpson 值越大群落多樣性越低。Shannon 和Simpson指數在各處理之間無顯著差異。Chao1 和ACE 指數反映樣本真菌群落豐富度，指數值越大豐富度越高。4 個處理的ACE 指數之間均無顯著差異，Chao1指數僅GM 處理顯著高于CK 處理，說明綠肥還田能顯著增加真菌群落豐富度。譜系多樣性指數（PD_whole_tree） 反映群落內物種的親緣關系，指數值越大說明物種譜系演化差異越大。GM 和LGM 處理譜系多樣性指數顯著高于CK 處理，說明綠肥還田與施石灰+綠肥還田處理能顯著影響土壤中真菌群落的親緣關系，但施石灰的影響不顯著。

2.4 真菌群落主坐標（PCoA） 分析

基于 Weight Unifrac 距離矩陣，在OTU 水平下進行 PCoA （主坐標） 分析（圖1）。其中，PC1 代表能最大程度區分所有樣本的第一主坐標軸，可以解釋樣本中所有差異的 74.67%；PC2 代表能最大區分所有樣本的第二主坐標軸，可以解釋樣本中所有差異的 6.57%。如果樣本的群落組成越相似，則它們在PCoA 圖中的距離越接近。由圖1 可知，各處理的子樣本均與CK 處理的子樣本有較大的距離，同一處理的子樣本之間表現出明顯的組內聚集，表明同一處理的真菌群落結構相似性較高。L 處理與CK 處理樣本之間距離較近，LGM、GM 處理均與CK 處理樣本之間距離相對較遠。說明綠肥還田與施石灰+綠肥還田處理對土壤中真菌群落結構的影響較大，施石灰的影響相對較小。

2.5 不同處理真菌門、屬水平群落結構的組成及顯著差異真菌種群分布

由物種注釋分析結果生成各處理土壤真菌在門、屬水平上的物種相對豐度堆積圖（圖2）。由圖2 可知，子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、捕蟲霉門（Zoopagomycota）、單毛壺菌門（Monoblepharomycota）、Aphelidiomycota為各處理中土壤真菌 TOP 10 的菌門。其中子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、羅茲菌門（Rozellomycota） 為土壤中的優勢菌門，其相對豐度之和占到了各組總測序豐度的67.87%～84.74%。相比CK 處理，L、LGM 和GM 3 個處理均不同程度地增加了子囊菌門（Ascomycota）、降低了被孢霉門（Mortierellomycota） 的相對豐度，子囊菌門（Ascomycota）分別增加了24.43%、68.24%、121.94%，被孢霉門（Mortierellomycota） 分別降低了3.70%、23.04%、58.25%。L 處理增加了毛霉門（Mucoromycota） 與擔子菌門（Basidiomycota） 在土壤中的相對豐度，LGM與GM 處理則不同程度降低了上述兩個菌門的相對豐度。

由圖2 可知，腐質霉屬（Humicola）、被孢霉屬（Mortierella）、鐮刀菌屬（Fusarium）、短梗蠕孢屬（Trichocladium）、Apodus、木霉屬（Trichoderma）、毛霉屬（Mucor） 為土壤中的優勢菌屬，其相對豐度之和占到了各組總測序豐度的55.23%～72.01%。相比CK 處理，L、LGM 和GM 3 個處理均不同程度降低了被孢霉屬（Mortierella）、鐮刀菌屬（Fusarium） 在土壤中的相對豐度，被孢霉屬（Mortierella） 的降幅分別為3.70%、23.71%、59.37%，鐮刀菌屬（Fusarium）的降幅分別為19.32%、13.78%、9.71%。L、LGM和GM 3 個處理均大幅增加了腐質霉屬（Humicola）、短梗蠕孢屬（Trichocladium） 在土壤中的相對豐度，經過不同土壤改良措施處理后腐質霉屬（Humicola）在3 個處理中相對豐度分別是CK 處理的1.58、3.66、5.39 倍，短梗蠕孢屬（Trichocladium） 在3 個處理中相對豐度分別是CK 處理的5.39、2.73、4.85 倍。另外，GM 處理能增加土壤中木霉屬（Trichoderma） 的相對豐度，相比CK 處理可增加81.03%，L 處理則能增加毛霉屬（Mucor） 的相對豐度，相比CK 處理可增加76.94%。

使用 LEfSe 分析工具在不同處理樣品之間尋找各真菌分類水平上與CK 處理具有統計學差異的Biomarker，生成LDA 值分布柱狀圖（圖3）。由圖3可知，相比CK 處理，L、LGM 和GM 3 個處理均能顯著提高土壤中子囊菌門（Ascomycota）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、糞殼菌目（Sordariales）、毛殼菌科（Chaetomiaceae） 的相對豐度。不同于GM 處理，L和LGM 處理顯著提高短梗蠕孢屬（Trichocladium）與該菌屬中griseum 的相對豐度。不同于L 處理，GM和LGM 處理顯著提高腐質霉屬（Humicola） 與該菌屬中phialophoroides 的相對豐度。L 處理即施石灰能顯著降低被孢霉屬中chlamydospora 的相對豐度，GM處理即綠肥還田能顯著降低擔子菌門（Basidiomycota）的相對豐度，顯著增加Apodus 與該菌屬中oryzae 的豐度，LGM 處理即施石灰+綠肥還田能顯著降低被孢霉屬中indohii 菌種的相對豐度。

2.6 不同處理對真菌群落營養型結構與真菌功能群的影響

根據FUNGuild 數據庫的比對結果，對不同處理煙田土壤中真菌的營養型（trophic mode） 進行分類統計（圖4）。各處理土壤中真菌的營養型均以腐生營養型（saprotroph） 為主，占比為48.12%～65.60%，病理營養型（pathotroph） 次之，占比為12.79%～13.61%。L、LGM 和GM 3 個處理中腐生營養型真菌占比均高于CK 處理，分別高出CK 處理10.81%、13.24%、17.48%。L、LGM 和GM 3 個處理中病理營養型真菌占比則分別低出CK 處理5.98%、6.03%、5.12%。共生營養型真菌在所有處理中占比均較低，低于3.00%。此外，各處理中均有大量真菌營養型尚未被鑒別。

由圖5 可以看出，對土壤中的真菌按其功能進行劃分，相對豐度在1% 以上的有未定義腐生真菌、未定義真菌、植物病原真菌、寄生蟲真菌、糞便腐生真菌，其相對豐度之和占土壤中真菌總和的96.45%～98.92%。L、LGM 和GM 3 個處理均能降低植物病原真菌的相對豐度，經相應土壤改良處理后，CK 處理中植物病原真菌的相對豐度分別為L、LGM、GM 的1.06、1.08、1.13 倍。LGM、GM 處理能大幅提高未定義腐生真菌的相對豐度，相比CK處理分別高出28.57%、35.50%。L 和GM 處理則均能提高土壤中寄生蟲真菌與糞便腐生真菌的相對豐度，相比CK 處理分別提高寄生蟲真菌22.72%、43.98%，提高糞便腐生真菌112.70%、44.27%。

2.7 不同處理對雪茄煙經濟效益的影響

3 種土壤改良措施對雪茄煙經濟效益均有較大影響 （表4）。相比CK 處理均可提高雪茄煙均價、產量及產值，其中均價提高5.62%～5.91%，產量提高8.44%～20.68%，L、LGM 和GM 處理產值分別提高14.56%、27.45% 和21.47%。LGM 處理增產率、增值率分別略高于GM 處理5.93、5.98 個百分點，GM 處理均價增長率略高于LGM 處理0.22 個百分點。綜合來看，LGM 和GM 處理提升雪茄煙經濟效益的效果要優于L 處理。

3 討論

對長期連作雪茄煙田施石灰、施石灰+綠肥還田、綠肥還田均能不同程度提高土壤速效養分含量，增加土壤微生物總量，改善土壤中真菌群落結構，從而促進雪茄煙健康生長，增加雪茄煙經濟效益。3 種土壤改良措施均能不同程度增加土壤全氮、有機質、堿解氮及速效鉀養分含量，且以施石灰+綠肥還田效果最佳，但提高土壤pH 值，改善土壤酸化現象則以施石灰效果最佳。可能原因是綠肥腐解過程中產生了一定量有機酸，降低了土壤pH 值，而石灰屬于堿性物質，本身不僅能顯著提高土壤的pH值，還能加速綠肥的腐爛與氮素的釋放，提高還田效果[14]。3 種土壤改良措施均可增加土壤中細菌、放線菌及微生物總量，且以施石灰+綠肥還田效果最好。但3 種改良措施中僅綠肥還田能增加土壤中真菌數量，施石灰、施石灰+綠肥還田反而會降低真菌數量。3 種土壤改良措施對土壤中真菌群落結構影響較大并存在顯著差異，且綠肥還田、施石灰+綠肥還田的影響要大于施石灰。綠肥還田處理真菌Shannon指數、Chao1 指數最高，即該處理真菌多樣性與真菌豐富度高于施石灰、施石灰+綠肥還田，可能原因是施石灰提高了土壤pH 值，真菌生長環境酸性減弱堿性增強，不利于真菌的繁殖[15]，因此施石灰處理真菌多樣性相比對照有所降低。其次綠肥在田間腐爛后，增加了碳、氮源的投入，為土壤中真菌等微生物的生長、繁殖提供了大量的營養物質[16]，因而能顯著增加真菌數量，提高群落的多樣性及豐富度。施石灰+綠肥還田處理因為增加了石灰，因而真菌多樣性與豐富度要低于綠肥還田處理。上述部分研究結論與Ryota 等[17]將野豌豆作為綠肥翻壓可提高土壤的真菌生物量，提高真菌豐富度的研究結果相同，但與楊思等[18]在麥后復種苜蓿壓青還田降低土壤真菌豐富度的研究結論不同。

物種注釋分析結果顯示，3 種土壤改良措施對土壤中真菌門、屬水平上組成結構的影響存在較大差異。施石灰處理可增加毛霉屬（Mucor） 的相對豐度，綠肥還田處理可增加木霉屬（Trichoderma） 的相對豐度。木霉屬（Trichoderma） 真菌大量分布于土壤、植物殘體、植物根際等環境中，對多種細菌和病原真菌具有拮抗作用[19]。此外，3 種土壤改良措施均能不同程度降低病原菌鐮刀菌屬（Fusarium） 的相對豐度，該菌屬于煙草致病菌，可引發煙草的鐮刀菌根腐病[ 2 0 ]，在施石灰處理中的相對豐度最低，低于CK 處理19.32%。可能原因是石灰本身具有一定的干燥和殺菌功能[21]，而綠肥還田能增加有益菌木霉屬的相對豐度，抑制病原菌的產生。因此，3 種土壤改良措施均能從不同方面改善土壤真菌群落結構，為雪茄煙生長發育提供良好的土壤微生態環境，從而不同程度增加雪茄煙產量與產值。

LEfSe 分析結果顯示，3 種土壤改良措施均能顯著提高土壤中子囊菌門—糞殼菌綱—糞殼菌目—毛殼菌科的相對豐度。毛殼菌科真菌除與纖維素降解相關外，還可產生抑菌活性物質，并誘導植物產生抗性[22?23]。這也解釋了3 種土壤改良措施處理中病原菌鐮刀菌屬相對豐度均低于對照的原因。施石灰+綠肥還田、綠肥還田二者能顯著提高腐質霉屬（Humicola）的相對豐度。這與趙竟茹等[24]向紅壤旱地添加毛葉苕子可顯著增加土壤中腐質霉屬相對豐度的研究結果一致。腐質霉屬真菌分解植物殘體能力較強，具有較高的木聚糖酶、纖維二糖水解酶和纖維素酶活性[25]，對植物的健康生長有利。另外，腐質霉屬真菌具有緩解土壤砷毒害和促進植物生長的功能[26]。

FUNGuild 分析表明，3 種土壤改良措施均能不同程度降低植物病原真菌的相對豐度，優化真菌的營養型組成結構，提高腐生營養型真菌占比，降低病理營養型真菌占比，且以綠肥還田處理改良效果最佳。這與趙竟茹等[24]向紅壤旱地添加毛葉苕子可顯著增加土壤腐生營養型真菌相對豐度的研究結論相同。

施石灰改善土壤真菌群落結構的效果不如綠肥還田的原因可能是，石灰雖能有效緩解土壤的酸化現象，但由于提高了土壤的pH 值，而高 pH 有利于細菌的生長，低 pH 值有利于真菌的生長[15]，石灰施入土壤中在殺死病原菌的同時，也殺死了部分其它真菌。另外，綠肥還田能顯著提高土壤中真菌生物量，增加真菌群落的豐富度，特別是有益菌木霉屬、腐質霉屬等有益菌屬的相對豐度，在提高植物抗逆性的同時與土壤中的病原菌進行生態位和營養物質的競爭，從而抑制病原菌在土壤中生長繁殖，促進土壤真菌群落結構和功能類群向健康有益方向發展。

4 結論

在恩施雪茄煙生產中，采用施石灰、施石灰+綠肥還田、綠肥還田3 種土壤改良措施均可不同程度改善長期連作煙田土壤理化性狀，增加土壤微生物總量，改善土壤真菌群落組成和結構，從而促進雪茄煙健康生長，增加雪茄煙生產經濟效益。3 種土壤改良措施均能增加有益菌毛殼菌科的相對豐度，降低病原菌鐮刀菌屬的相對豐度。此外，3 種土壤改良措施還能改善真菌群落功能組成，優化真菌的營養型組成結構，在提高腐生營養型真菌占比的同時降低病理營養型真菌占比，達到改良土壤、提高雪茄煙生產經濟效益的目的。3 種土壤改良措施中以綠肥還田處理改善連作煙田土壤真菌群落結構效果最佳，且施石灰+綠肥還田、綠肥還田提高土壤肥力、增加雪茄煙經濟性狀效果要優于單施石灰。