基于轉錄組學解析苗期高粱對干旱脅迫的生理代謝響應

關鍵詞： 高粱； 干旱脅迫； 生理代謝； 轉錄組分析

干旱是限制作物生產力的重要非生物因素之一[1]，嚴重制約農業可持續發展。干旱脅迫可以使植物葉片干枯萎縮、降低相對含水量、增加活性氧自由基和丙二醛含量，進而發生膜脂過氧化，導致植物氧化損傷甚至死亡[2]；同時也會改變植物對營養物質的利用，對植物體內養分含量產生影響[3]。為了應對干旱，作物會對基因表達進行重新編程，進而調節許多生理生化過程，這些變化不僅發生得快，而且根據組織類型、發育階段和應激條件而具有特異性[4]。高粱是我國北方干旱和半干旱地區的主要農作物之一[ 5 ]，具有較高的水分利用效率和較強的抗旱性，其生長易受干旱影響，且不同品種間的抗旱性差異較大[6]。以往研究顯示，苗期是作物群體建成的關鍵時期[7]，苗期的干旱脅迫對高粱的產量和成熟度都會產生影響。目前，高粱抗旱相關研究多集中在干旱脅迫處理前后其形態結構及生理指標的變化[8]，其抗旱分子機制研究起步較晚[9]。探究干旱條件下高粱的基因表達模式，分析抗旱代謝途徑，對加快高粱抗旱品種選育、促進干旱地區高粱生產具有重要作用。

轉錄組測序在研究作物不同環境條件下、不同生長發育階段的基因表達模式方面具有明顯優勢[10]，利用其解釋抗旱過程內在基因變化規律和機制已經成為作物抗旱機制研究的有效手段，在玉米[11?12]、小麥[13?15]、水稻[16?19]、谷子[20?24]等作物的抗旱性研究中得到廣泛應用，大量與干旱響應相關的基因和代謝途徑被發現。玉米幼苗耐旱性較強的主要原因是滲透調節和細胞壁相關基因的差異表達[25]，光合作用―天線蛋白、光合生物的固碳作用、卟啉和葉綠素代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、脂肪酸降解、磷酸肌醇信號等途徑可能是其抵御干旱脅迫的主要代謝途徑[26]；谷子干旱脅迫后的差異表達基因主要富集在氨基酸生物合成、蔗糖代謝和光合作用等代謝通路中[27]，編碼蛋白激酶、磷酸酶、信號轉導組分、轉錄因子、功能蛋白等基因的表達發生了較明顯的變化[24]，SiSLC、SiFBA5 和 SiBT4 對谷子的抗旱性可能起到負調控作用[26]；水稻抗旱的主要轉錄因子[28]為堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）、NAC、DREB/CBFs、Znf （Zincfinger） 蛋白、MYB 和 HSP 轉錄因子等；小麥的主要抗旱基因[29]包括轉錄因子類基因、LEA 蛋白基因、信號轉導相關基因、代謝調節相關基因、氧化調控相關基因等。近年來，為了更好地理解高粱干旱脅迫響應的分子機理，提高高粱的耐旱性，利用轉錄組測序技術對高粱抗旱的分子機制也進行了初步探討。Abdelghany 等[30]選擇了4 個抗旱性不同的高粱材料開展轉錄組分析，發現在干旱脅迫前期，敏感性和耐旱性材料的脅迫響應差異基因以及不同材料之間耐旱差異基因中，上調基因數目均大于下調基因數目。王玉斌等[4]對2 個抗旱性不同的高粱材料在24 h 內的6 個時間點進行了轉錄組分析，表明次生代謝物生物合成中的苯丙素生物合成和滲透保護中的氰基氨基酸代謝可能是高粱耐旱性的主要代謝通路。何歡[31]對PEG 處理6 h 后的高粱幼根和幼葉進行轉錄組分析，在根和葉中分別得到8256 和4214個差異表達基因，基于KEGG 的富集分析表明，高粱根和葉對干旱脅迫的敏感度不同，差異基因富集的通路也不相同，根中差異表達基因富集的通路為谷胱甘肽代謝和類固醇激素生物合成，葉中富集的通路為植物激素轉導和MARK 植物信號。此外，在對甜高粱的研究中發現，植物激素信號轉導（planthormone signal transduction）、氨基糖和核苷酸糖代謝（amino sugar and nucleotide sugar metabolism）、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism） 與甜高粱響應干旱脅迫具有良好的相關性[32]；可溶性糖在甜高粱幼苗抵御干旱脅迫中發揮重要作用，甜高粱通過激活與干旱脅迫相關的蛋白表達和與碳水化合物相關的基因表達而增強滲透調節能力來響應干旱脅迫[33]。轉錄組測序技術雖然在篩選抗旱性不同高粱材料的差異表達基因、分析抗旱代謝通路、鑒定高粱響應干旱脅迫應答基因及特性方面有一定的研究基礎，但是關于高粱干旱脅迫后生理代謝與轉錄組的相關性分析較少。本研究以高粱為試驗材料，結合不同高粱材料苗期干旱—復水后的生存情況，選擇存活率高的材料進行生理指標檢測、氮磷鉀含量測定及轉錄組測序分析，通過基因的差異表達分析、GO 功能注釋和Pathway 分析等，挖掘抗旱相關基因，分析差異表達基因參與的代謝途徑，解析高粱在干旱條件下的分子應答機制，為高粱抗旱育種提供理論指導與技術支撐，為高產栽培提供更多的遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及抗旱材料鑒選

前期采用反復干旱法對50 份苗期抗旱性不同的高粱材料進行抗旱性鑒定，以全部存活為篩選標準，獲得苗期抗旱性強的高粱材料1 份（TX-625B），對其開展生理指標檢測、養分含量及轉錄組測序研究。

1.2 抗旱生理指標檢測

1.2.1 脅迫處理和樣品采集 試驗采用水培方式，種子消毒后擺放在培養皿中，加蒸餾水，在晝/夜溫度為28℃/20℃、光照14 h 條件下培養；待長至三葉一心，用濾紙吸干培養皿中水分，根據前期預試驗，加入20 mL 濃度為25% 的PEG-6000 溶液對其進行干旱脅迫處理；分別剪取脅迫處理0、12、24 h的幼苗葉片進行生理指標檢測和氮磷鉀含量的測定，每個處理3 次重復。

1.2.2 抗氧化物酶活性和丙二醛活性的測定 采用南京建成生物試劑盒測定樣品的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶活性（CAT）和丙二醛的含量（MDA）。

1.2.3 氮、磷、鉀含量測定 將葉片105℃ 殺青，70℃ 烘至恒重稱取生物量。用全自動凱氏蒸氮儀測定植株N 含量；用1∶3 濃HClO4 和濃HNO3 消煮，釩鉬黃法紫外分光光度計測定全P，火焰光度計測定全K。

1.3 抗旱轉錄組測序

1.3.1 轉錄組樣品 分別取25% 的PEG-6000 溶液脅迫處理0、12、24 h 的植株葉片進行轉錄組測序。

為保證試驗的準確性，每個處理多植株混合取樣，分別提取RNA，每個樣品設3 次生物學重復，轉錄組樣品設3 個比較組，分別為0 h vs 12 h、0 h vs 24 h、12 h vs 24 h。

1.3.2 總RNA 的提取及測序數據分析 采用Trizol（Invitroge） 試劑提取樣品的總RNA。利用瓊脂糖凝膠電泳、Nano Drop N、Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA 樣品的降解度、純度、濃度以及樣品的完整度。轉錄組測序由派森諾生物科技有限公司完成。測序后數據經過過濾、比對后，以FPKM （fragmentsper kilobase of transcriptper million fragments mapped）≥1 為標準篩選有效表達基因。根據基因在不同脅迫時間下的表達量進行差異表達分析、差異表達基因功能注釋和功能富集分析，挖掘參與高粱干旱脅迫的關鍵基因及其調控途徑。

1.3.3 差異表達基因的篩選 通過將樣品數據進行兩兩比較從而篩選差異表達基因，采用D E S e q對基因表達進行差異分析， 在分析過程中將foldchange≥2 且FDRgt;0.01 作為篩選標準。差異倍數（fold change） 表示兩個樣品間表達量的比值。錯誤發現率（1 discovery rate，FDR） 是通過對差異顯著性P 值（P-value） 進行校正得到的。采用了公認的Benjamini Hochberg 校正方法對原有假設檢驗得到的顯著性P 值（P-value） 進行校正，最終以FDR 作為差異表達基因篩選的關鍵指標。

1.3.4 差異表達基因GO 和KEGG 富集分析 將差異表達基因GO （Gene Ontology，http：//www.geneontologyorg/，基因本體論） 數據庫進行比對，進行基因功能富集分析。分析時利用GO term 注釋的差異基因對每個term 的基因列表和基因數目進行計算，通過超幾何分布方法計算P-value，Plt;0.05 被認為是顯著富集，找出與整個基因組背景相比，差異基因顯著富集的GO term，從而確定差異基因行使的主要生物學功能。

將差異表達基因與KEGG （kyoto encyclopedia ofgenes and genomes，http：//www.genome.jp/kegg/，京都基因和基因組百科全書） 數據庫進行比對，以KEGG數據庫中Pathway 為單位進行顯著性富集分析。應用超幾何檢驗，找出與參考基因組背景相比，在差異表達基因中顯著性富集的Pathway。以P-value 為篩選標準，Plt;0.05 表示差異基因在該Pathway 中富集顯著，找出與DEGs 顯著相關的代謝通路。

1.3.5 實時熒光定量PCR 驗證 為了驗證轉錄組測序差異表達基因表達趨勢的準確性，從測序獲得的差異表達基因中隨機選取8 個進行qRT-PCR 分析，對測序結果的可靠性進行驗證。qRT-PCR 驗證由南京派諾森科技有限公司完成，運用Primer 5.0 軟件設計引物（表1） 并合成，以β-Actin 為內參基因，每次試驗設置3 次生物學重復和3 次技術重復。采用2?△△ct 方法分析數據，計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 不同脅迫時間對高粱幼苗葉片抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

不同干旱脅迫時長對高粱幼苗的生理指標產生了影響，葉片的抗氧化酶活性和丙二醛含量均有不同程度的改變（表2）。干旱脅迫24 h 之內，隨著脅迫時間的延長，CAT 和POD 的活性呈現逐漸升高的趨勢，SOD 活性呈現先降低再升高的趨勢，最終均保持了較高的SOD、POD 和CAT 活性；MDA 含量隨著脅迫時間的延長逐漸升高，但其升高幅度較小。過氧化物酶和過氧化氫酶均具有較強的清除自由基能力，可以及時清除體內過量的活性氧和過氧化氫，降低外界脅迫對植物造成的損傷，其含量的迅速增加與材料本身的抗旱性正相關，抗旱材料可以通過調節葉片的保護性酶活性來抵御干旱；活性氧代謝產物MDA 在葉片中的積累量較小，該材料具有較強的抗旱性。

2.2 不同脅迫時間對高粱幼苗葉片氮、磷、鉀含量的影響

干旱脅迫降低了高粱幼苗葉片氮、磷、鉀的含量（表3），但3 種元素含量降低的程度不同。與對照（0 h） 相比，脅迫12 h 時葉片內氮、磷、鉀含量均未發生顯著變化，脅迫24 h 時，氮含量顯著低于對照0 h，磷、鉀含量變化不顯著。說明短期的干旱脅迫會影響葉片氮、磷和鉀含量， 其中對氮含量影響較為明顯。

2.3 轉錄組測序數據質量分析及與參考基因組比對結果統計

通過轉錄組測序， 0、12、24 h 3 個不同脅迫時間9 個樣本共得到54G 的數據量，每個樣本的數據量均為6G。運用數據質量控制程序對轉錄組測序結果進行分析（表4），把過濾后的數據映射到參考基因組數據中，得到41769964～50602438 條cleanreads 數據，Q30 堿基的分布比例為91.35%～91.94%，G、C （鳥嘌呤和胞嘧啶） 含量在55.08%～56.42%，樣本的各項指標數據說明高粱葉片測序數據質量良好，準確率較高，有利于后續的數據分析。

2.4 高粱葉片干旱脅迫的差異表達基因篩選

對0、12、24 h 3 個脅迫時間的轉錄樣本信息分別進行兩兩對比分析，共得到17396 個差異表達基因（圖1、圖2 ）， 包括8 2 5 3 個上調表達基因和9143 個下調表達基因（表5）。3 個比較組0 h vs12 h、0 h vs 24 h、12 h vs 24 h 分別得到6322、7935、3139 個差異表達基因，其中上調表達的基因數量分別為3595、4258、1290 個；下調表達的基因數量分別為2727、3677、1849 個。干旱脅迫24 h 內差異表達基因數目迅速增加，且上調表達的基因數目較多，表明持續的干旱脅迫引起了高粱葉片基因表達的變化，脅迫時間越長調控過程越復雜，更多特定的信號傳導機制被激活，更多特異性差異表達基因參與到表達調控中來；在高粱抵御干旱脅迫的過程中上調表達基因和下調表達基因均發揮了重要作用。

2.5 抗旱相關差異表達基因的功能分析

干旱脅迫條件下，高粱的耐旱性強弱在很大程度上取決于抗旱材料自身的差異表達基因。分析不同干旱脅迫時段幼苗的基因表達變化（圖3） 發現，3 個比較組中有985 個基因是不同干旱脅迫時間下所共有的，這些基因可以作為高粱響應干旱脅迫的核心差異表達基因。對985 個差異表達基因進行聚類分析，從中選擇152 個差異表達最顯著的重疊基因，結合對苗期高粱抗旱基因功能的綜合分析，篩選到在高粱苗期抗旱分子應答中起著關鍵作用的幾類基因：過氧化物酶基因4 個，葉綠素a-b 結合蛋白基因8 個，光系統蛋白基因7 個，與葉綠體相關的其他酶和蛋白基因19 個（表6、圖4）。

2.6 干旱脅迫下與氮、磷、鉀相關差異表達基因分析

干旱脅迫會影響植物體內氮、磷、鉀含量，對不同干旱脅迫時間幼苗的基因表達變化進行分析發現，0 h vs 12 h、0 h vs 24 h、12 h vs 24 h 與氮相關的差異表達基因分別為981、984、418 個，其中上調表達的基因數分別為666、670、154 個，下調表達的基因數分別為315、314、264 個；與磷相關的差異表達基因分別為395、497、211 個，其中上調表達的基因數分別為240、294、87 個，下調表達的基因數分別為155、203、124 個；與鉀相關的差異表達基因分別為44、44、30 個，其中上調表達的基因數分別為21、25、10 個，下調表達的基因數分別為23、19、20 個（表7）。脅迫24 h 與脅迫12 h 相比，3 種元素的差異表達基因數目均減少，且上調表達基因數目減少，下調表達基因數目增加，說明在沒有外部營養物質攝入的情況下，持續的干旱脅迫引起葉片氮、磷、鉀基因表達的變化。

2.7 差異表達基因的GO 分析

對差異表達基因進行GO 分析，3 個比較組共獲得12185 個GO 注釋條目，注釋到的差異表達基因分為生物過程（BP）、分子功能（MF） 和細胞組分（CC） 3 個方面（圖5）。與對照相比，不同脅迫時間節點在這3 個方面均存在較大差異，其中注釋到生物過程（占比60%） 和分子功能（占比29%） 中的差異表達基因較多，注釋到細胞組分中（占比11%） 的最少。注釋到生物過程中的差異表達基因主要富集在物質的轉運、細胞過程、代謝過程等途徑中；與分子功能相關的差異表達基因主要富集在結合、催化活性等方面，包括結構分子活性和核糖體活性等；注釋到細胞組分中的以細胞器（包括葉綠體、質體、類囊體等）、細胞成分等富集的差異表達基因數目較多。

對每個比較組富集最顯著的前10 個GO 條目進行分析（表8），隨著脅迫時間的延長，3 個比較組在細胞組分中富集的差異表達基因越來越多。0 h vs12 h 和0 h vs 24 h 富集前10 的條目包括細胞組分和分子功能兩個方面，0 h vs 12 h 富集前10 的途徑主要包括3 類：1） 胞質核糖體，包括核糖體的結構組成、核糖體大小亞基；2） 結構分子活性；3） 細胞內核糖核蛋白復合物。0 h vs 24 h 富集前10 的途徑主要包括：1） 胞質核糖體，包括核糖體的結構組成、核糖體大小亞基；2） 結構分子活性；3） 葉綠體、質體、類囊體。12 h vs 24 h 富集最顯著的途徑均為細胞組分，其中較多的差異基因富集到葉綠體、類囊體和光合作用途徑中，可分為兩類：1） 葉綠體、質體、類囊體；2） 光合作用膜。將3 個比較組富集前10 的條目進行比較發現，隨著脅迫時間的深入，其富集的主要途徑由核糖體和結構分子活性轉變為葉綠體和光合作用膜，干旱脅迫下光合作用途徑可能是調節植物耐旱性的重要原因。

對與氮、磷、鉀相關的差異表達基因進行GO分析（表9） 顯示，與氮相關的差異表達基因共注釋到33 個GO 條目中，分別注釋到生物過程（21 條） 和分子功能（12 條） 兩個方面，注釋到生物過程中的差異基因數目較多，主要富集在有機氮化合物的生物合成過程、細胞氮復合代謝過程、有機氮復合代謝過程、氮復合代謝過程、細胞氮化合物的生物合成工藝等途徑中，與分子功能相關的差異表達基因數目很少，主要富集在酶活方面，包括磷酸轉移酶活性、水解酶活性等；與磷相關的差異表達基因富集到8 條GO 途徑中，分別注釋到生物過程（4 條）、分子功能（3 條） 和細胞組分（1 條） 3 個方面，注釋到生物過程中的差異表達基因主要富集在磷代謝過程途徑中，與分子功能相關的差異表達基因主要富集在轉移酶活性（轉移含磷集團）、作用于酸酐的水解酶活性方面，注釋到細胞組分的主要富集在轉移酶復合物方面；與鉀相關的差異表達基因注釋到包括生物過程（7 條） 和分子功能（6 條） 在內的13 條GO 途徑中，但每條途徑中注釋到的差異表達基因數目很少，注釋到生物過程的主要為鉀離子轉運，注釋到分子功能的主要為鉀離子結合和鉀離子跨膜轉運體活性。

2.8 KEGG 通路富集分析

通過KEGG 富集分析（圖6） 發現，3 個比較組0 h vs 12 h、0 h vs 24 h、12 h vs 24 h 分別鑒定到122、126 和115 條代謝通路，主要以氨基酸代謝（amino acid metabolism）、光合作用（photosynthesis）、磷酸戊糖途徑（pentose phosphatepathway）、糖酵解/糖異生（glycolysis /gluconeogenesis） 為主。干旱脅迫對高粱的氨基酸代謝、次生代謝產物生物合成、糖類和脂類代謝均有較大的影響。對每個比較組富集最顯著的前20 代謝通路進行分析發現，3 個比較組均在氨基酸和肽代謝（amino acid metabolism）、光合作用（photosynthesis） 和糖代謝（glycometabolism） 途徑具有顯著富集。3 個比較組中均富集最顯著的氨基酸和肽代謝途徑有3 條：甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，丙酮酸代謝，谷胱甘肽代謝；光合作用途徑有3 條：光合作用，光合作用―天線蛋白，光合生物中的碳固定；糖代謝途徑有兩條：糖酵解/糖異生，磷酸戊糖途徑。12 h vs 24 h 和0 h vs 12 h 相比，隨著脅迫時間的延長，光合作用途徑中增加了卟啉和葉綠素代謝途徑；氨基酸代謝富集途徑逐漸減少：0 h vs 12 h 氨基酸代謝途徑為甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，丙酮酸代謝，苯丙氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸的代謝，氰氨基酸代謝，脅迫12 hvs 24 h 其氨基酸代謝途徑為甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，丙酮酸代謝；谷胱甘肽代謝的富集顯著性隨著干旱時間的延長逐漸增強；糖代謝途徑逐漸增多，增加了半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝途徑。這些代謝通路的富集變化與高粱葉片干旱脅迫相關：干旱脅迫早期主要以光合作用和氨基酸代謝為主，干旱脅迫后期主要以糖代謝和光合作用為主。這些相同的代謝途徑表明，干旱脅迫下氨基酸代謝途徑、光合作用途徑和糖代謝途徑等可能是抗旱品種具有較強抗旱調節能力的重要原因，作物可以靠調節這些代謝途徑的富集顯著性來增加自身的抗旱性，提高在干旱脅迫下的存活幾率。

2.9 實時熒光定量PCR 驗證

隨機挑選8 個差異表達基因對轉錄組數據進行qRT-PCR 驗證，通過轉錄組測序結果和 qRT-PCR 分析結果比較可以看出，這些基因的相對表達量和轉錄數據的基因表達模式基本一致（圖7），說明轉錄組數據較為可靠。

3 討論

3.1 干旱脅迫對苗期高粱生理指標的影響

在逆境脅迫下，植物體內會產生對自身有害的活性氧，一些抗氧化物酶及抗氧化物質具有清除活性氧的功能，使活性氧的產生與清除達到平衡狀態，使植物抵抗逆境脅迫，維持正常生長[34]。在植物體的保護酶系統中，SOD 通過催化活性氧發生歧化反應產生無毒分子氧和過氧化氫[35]，POD 和CAT 可清除植物體內多余的H2O2、降低植物逆境脅迫中細胞膜脂過氧化的程度。以往研究表明， 高粱以CAT 為主要抗氧化酶，同時具有較高的SOD 和POD 活性[9]。本研究中，在12 和24 h 的干旱脅迫下，幼苗葉片的抗氧化酶活性與對照（干旱脅迫0h） 相比均發生不同程度的改變，SOD 呈先下降再升高的趨勢，POD 和CAT 的活性則呈持續升高的趨勢，SOD 與CAT的活性在各個時段均發生了顯著變化，而POD 的活性則在脅迫12 h 之后發生顯著變化，24 h 時各抗氧化酶活性均保持了較高的水平，與以往研究結果相符。丙二醛含量的高低通常反映細胞膜過氧化損傷的程度和植物對逆境條件的抵抗能力[36]。谷胱甘肽是一種非酶促活性氧清除劑，其作用類似于抗氧化酶，可以清除干旱脅迫誘導的自由基和過氧化物。轉錄組結果顯示，干旱脅迫24 h 之內，編碼F8、U17、GSTF 和 GSTU 的差異表達基因均有上調表達，基因的表達調控谷胱甘肽的代謝，對于清除細胞代謝過程中累積的自由基，減輕細胞所受的干旱脅迫損傷具有重要作用。本研究中，因植株自身保持了較高的保護酶活性和谷胱甘肽活性，使丙二醛的積累量維持在一個相對較低的水平，因此降低了葉片的膜脂過氧化程度，減少了逆境條件給植物本身帶來的傷害。由此可見，抗氧化物的積累是植物應對干旱脅迫的重要途徑，對于植物抵抗干旱逆境帶來的不利影響具有積極的效應。

3.2 干旱脅迫對苗期高粱氮、磷、鉀含量的影響

氮、磷、鉀均與植物的抗旱能力具有相關性。氮參與植物葉綠體、蛋白質和核酸等物質的構成，影響植物核酸和蛋白降解、酶活性、細胞代謝及光合性能等[37]；磷素是葉綠體的主要組成成分，植物光合作用過程主要依賴磷和含磷化合物[38]；鉀離子作為最主要的滲透物質移動性強、再利用率高，能夠促進葉綠素的合成和穩定，維持和調節干旱條件下的許多生理生化過程與代謝平衡之間的關系[ 3 9 ]。氮、磷、鉀等可移動元素可以被植物體循環利用[40]，本研究中，在沒有外界營養物質攝入的情況下，幼苗葉片在經歷12 和24 h 的干旱脅迫后，體內的氮、磷、鉀含量均發生了改變，其中氮含量在脅迫24 h 時發生顯著變化。氮素在植物體內主要以NO3?和 NH4+的形式存在，植物體內的NO3?需還原為NH4+才能被植物利用，NH4+在GS/GOGAT 途徑分別被同化成谷氨酰胺和谷氨酸[ 4 1 ] ， 這兩種氨基酸可以為其他的氨基酸、核酸和其他含氮化合物（如葉綠素） 的生物合成提供氮素。本研究中，幼苗感受到干旱脅迫后，包括甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，苯丙氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸的代謝，氰氨基酸代謝，酪氨酸代謝和丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的生物合成途徑在內的氨基酸代謝途徑發生了顯著富集，認為干旱脅迫可能提高了NO3?還原為NH4+的速率，促進了谷氨酰胺和谷氨酸的合成，為氨基酸代謝提供氮素。谷氨酰胺和谷氨酸還可用于形成天冬氨酸和天冬酰胺，這4 種氨基酸共同完成有機氮的輸送和轉化[42]。本研究中與氮素相關的差異表達基因在有機氮化合物的生物合成過程、細胞氮復合代謝過程、有機氮復合代謝過程、氮復合代謝過程、細胞氮化合物的生物合成等途徑中顯著富集，認為幼苗在干旱脅迫下，可能通過調控有機氮的代謝和生物合成的基因表達來促進氨基酸的代謝，從而調節植物的抗旱性。磷和鉀均與葉綠體的合成和光合作用有關，GO 分析顯示，干旱脅迫下，與磷相關的差異表達基因在磷代謝過程、轉移酶活性（轉移含磷集團） 有顯著富集；與鉀相關的差異表達基因主要富集在鉀離子轉運、鉀離子跨膜轉運體活性等途徑中，兩種元素均在0 到12 h 富集的差異表達基因數目較多，12到24 h 富集的較少，這可能與光系統蛋白、與葉綠體相關的其他酶和蛋白在干旱脅迫的0 到12 h 上調表達，12 到24 h 下調表達有關，以此調節幼苗對干旱脅迫的適應性。

3.3 干旱脅迫對苗期高粱基因表達的影響

植物對干旱脅迫的響應是一個復雜的過程，包括生長狀態、生理生化和分子水平的調節。植物通過這些調節機制來應對干旱造成的損害，以保證自身的正常生長發育，植物對干旱脅迫在生理水平上的響應，其機制在于干旱信號誘導下相應基因的表達及調控。不同干旱脅迫時間下，高粱幼葉差異表達基因共有17396 個，0 到24 h 差異表達的基因數目逐漸增加，對不同時段共表達的差異基因分析顯示，其生物學功能主要富集過氧化物酶、葉綠素a-b結合蛋白、光系統蛋白、與葉綠體相關的其他酶和蛋白上。本研究中，過氧化物酶調控基因作為共表達基因在3 個比較組中的表達均具有顯著差異性，與0 h 相比，12、24 h 均呈現上調表達，其表達促進了抗氧化酶及相關物質的產生，使過氧化物酶活性升高，從而抵抗引起活性氧生成的響應基因，提高活性氧清除能力，降低干旱脅迫對植物細胞的損傷。葉綠素是植物吸收太陽光能進行光合作用，將光能轉變為化學能的主要色素[43]。本研究中，葉綠素a-b 結合蛋白1、4、5、M9、CP24 10B、1B-21，葉綠素a-b 結合蛋白LHCII III 型、LHCII I 型在3 個比較組中均為上調表達，葉綠素的生物合成過程需要酶的參與，過氧化物酶基因的上調表達和谷胱甘肽代謝途徑的顯著富集在一定程度上促進了葉綠素相關基因的表達，這可能是葉綠素a-b 蛋白基因上調表達的主要原因。葉綠體是植物細胞光合作用、能量流動和產生活性氧的最為重要的細胞器。光系統蛋白、與葉綠體相關的其他酶和蛋白在干旱脅迫的0 到12 h 上調表達，12 到24 h 呈現下調表達，可能是因為隨著干旱迫時間的延長，植物細胞內滲透勢逐漸升高，為了維持細胞內正常的生理活動，葉片中光系統蛋白、與葉綠體相關的其他酶等多個蛋白下調表達以降低光合作用速率，使高粱適應干旱脅迫環境。綜上所述，我們認為過氧化物酶基因的富集和葉綠素相關基因的富集是影響高粱抗旱性的主要原因，而光系統蛋白、與葉綠體相關的其他酶和蛋白的基因表達調控在高粱抗旱性中起到了一定的積極作用。

3.4 干旱脅迫對苗期高粱代謝通路的影響

KEGG 富集分析顯示，干旱脅迫下基因表達在氨基酸代謝、光合生物固碳作用、磷酸戊糖途徑和碳代謝途徑中具有顯著的差異性。本研究中，氨基酸代謝途徑在不同脅迫時間下均產生了顯著富集，0 到12 h，富集顯著的氨基酸代謝途徑有4 條，分別為甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，苯丙氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸的代謝，氰氨基酸代謝。0到24 h，顯著富集的氨基酸代謝途徑為5 條，減少了氰氨基酸代謝，增加了酪氨酸代謝和丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的生物合成途徑。氨基酸作為蛋白質合成的基本單元，在植物逆境脅迫中能夠作為滲透調節物質并維持生物膜穩定[44]，氨基酸代謝途徑和富集顯著性的改變說明干旱脅迫引起了植物體內滲透調節物質的改變，影響了生物膜的穩定性，植物可以通過氨基酸代謝維持細胞的滲透壓，增強抗旱性。碳代謝是植物體內最基本、最重要的生理代謝過程之一[45]，其在作物生育期間的動態變化，直接影響了光合產物的形成、轉化及蛋白質的合成和礦質營養的吸收等過程。可溶性糖在植物體內是重要的碳源，也是重要的滲透調節劑，對植物抗逆有至關重要的促進作用，其含量變化是植物抗旱性強弱的標志之一[46]，有研究[47]表明，只有在重度干旱脅迫下，可溶性糖含量增加。本研究中，干旱脅迫24 h與干旱脅迫12 h 相比，糖代謝途徑富集的條目增加、富集的顯著性增強，說明其滲透調節能力在輕度和中度干旱脅迫下較強，但在重度干旱脅迫下則有所下降，這也是高粱對逆境脅迫的適應性反應。

4 結論

高粱在受到干旱脅迫時通過改變生理代謝途徑進行調節，其調節過程涉及多個生物過程的協同互作，主要包括抗氧化系統對自由基的清除和滲透調節物質積累；過氧化物酶、葉綠素a-b 結合蛋白、光系統蛋白、與葉綠體相關的其他酶和蛋白的基因表達調控，這些調控作用在高粱苗期抗旱分子應答中起著關鍵作用；氨基酸代謝、光合作用和糖代謝過程是高粱抵御干旱脅迫的主要富集通路。