滇水金鳳耐銅相關基因CAX3和CCS的克隆及表達分析

摘要：植物CAX（Ca2+/H+反向轉運蛋白）和CCS（銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶蛋白）分別是重要的液泡膜轉運蛋白和銅伴侶蛋白，通過不同機制在緩解重金屬脅迫中發揮著重要作用。本課題組前期研究發現滇水金鳳（Impatiens uligino.sa）對銅脅迫具有很好的耐受性，并通過轉錄組測序篩選出耐銅相關基因。在此基礎上，本研究以野生滇水金鳳為材料，通過RT-PCR技術克隆獲得耐銅相關基因CAX3和CCS，分別命名為丸CAX3和IuCCS，其cDNA序列長度分別為1 320 bp和975 bp，分別編碼439個和324個氨基酸。生物信息學分析結果表明，IuCAX3為不穩定蛋白，具有。aca2超家族的保守結構域，定位在質膜、液泡上：luCCS為穩定蛋白，具有PLN02957超家族的保守結構域，定位在葉綠體上。系統進化分析結果顯示，IuCAX3和IuCCS均與喜馬拉雅鳳仙花的相應基因聚為一支，相似性分別為98.18%和89.81%。通過設置不同的銅處理濃度（0、5、10、15、20、25 mg·L-L）研究了IuCAX3和IuCCS基因在滇水金鳳葉片中的表達情況，qRT-PCR分析結果表明，銅處理能誘導兩個基因大幅上調表達，且銅濃度為15 mg·L-1時的上調幅度最大，并均在處理12 d達到最高水平；隨處理時間延長，IuCAX3的表達量先升高后降低，IuCCS的表達量在銅濃度不高于15 mg·L-1時呈先升后降再升的趨勢，但當銅濃度高于15 mg·L-1后則呈先升后降的趨勢，而且銅處理下IuCCS的表達水平明顯高于Iu-CAX3，因此推測IuCAX3基因主要在銅脅迫前期起作用，而IuCCS基因在銅脅迫后期仍發揮重要作用。本研究結果可為深入研究滇水金鳳耐銅分子機制提供一定的參考依據。

關鍵詞：滇水金鳳：CAX3基因：CCS基因：銅脅迫：基因克??；生物信息學分析：表達分析

中圖分類號：S681.1： Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024） 10-0010-08

銅是植物生長發育所必需的微量元素之一，在葉綠素形成、光合作用、呼吸作用中的電子傳遞、氧化脅迫保護以及蛋白質、碳水化合物代謝等過程中起著關鍵作用。然而，吸收過多的銅也會影響植物的生長發育，超過一定閾值甚至會導致植株死亡。研究發現，部分植物在長期適應銅脅迫的過程中形成了規避或耐受銅離子毒害的防御機制，包括利用液泡的隔離和區室化作用以及啟動抗氧化系統等途徑來緩解銅離子毒害。植物細胞通過將細胞質中過量的離子區域化至液泡中來維持其正常的膨壓，從而提高植物的抗逆性，液泡膜上的Ca2+/H+反向轉運蛋白（Ca2+/H+exchanger，CAX）即在此過程中發揮作用，能夠將胞質中的Ca2+區域化至液泡內，從而調控細胞內的Ca2+濃度，以維持植物體內Ca2+的穩態平衡。另外，CAX對植物抵御重金屬脅迫也是至關重要的。研究表明，鎘（Cd）處理下，水稻6個CAX基因在葉和莖中均強烈表達，且在根中的表達量隨Cd濃度的增加而增加，其中，OsCAXla和Os-CAXlc促進而OsCAX4抑制酵母中Cd的積累，推測這三個基因很可能參與了水稻對Cd的吸收和轉運。另一種有效應對銅離子毒害的策略是啟動抗氧化系統來清除多余的活性氧（ROS）以抵御氧化脅迫。擬南芥的AtCAX3通過提高Ca離子濃度來降低ROS，從而提高對Cd的耐受性。銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）是一個包含Cu/Zn二聚體的蛋白質，在結合銅離子時催化O-2·發生歧化反應生成O2和H2O2，在清除ROS抵御重金屬脅迫過程中起著非常重要的作用。銅對Cu/Zn-SOD的作用發揮是不可或缺的，但在正常生理條件下植物需要通過銅伴侶蛋白獲得銅。銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶蛋白（copper chaperone for Cu/Zn - SOD，CCS）是一類可溶性金屬結合蛋白，其功能是將銅傳遞給脫輔基的Cu/Zn-SOD并激活此酶。研究表明，銅濃度超過一定值時擬南芥莖和根中AtCCS的表達量升高，推測CCS蛋白在調控植物體內銅離子平衡過程中發揮作用。

滇水金鳳（Impatiens uliginosa）是鳳仙花科鳳仙花屬一年生或多年生草本植物，生長于云南、貴州和廣西等地的潮濕林下、水溝邊及溪流旁，具有花色鮮艷、花期長、生物量大、根系發達且抗逆性強等特點，是集觀賞和生態價值于一體的重要花卉材料。滇池是我國典型的淺水型高原湖泊，水體中的銅平均濃度遠超非污染自然水體中的銅平均濃度。本課題組前期研究發現，作為滇池流域的鄉土植物，滇水金鳳對銅有很好的耐性，并通過轉錄組測序篩選到其耐銅相關基因。鑒于目前國內外尚未見有關滇水金鳳耐銅基因研究的相關報道，本研究基于前期研究，克隆出滇水金鳳CAX3和CCS基因，并利用生物信息學方法對其序列結構、系統發育等進行分析，同時采用qRT-PCR技術分析其在不同濃度銅脅迫下的滇水金鳳葉片中的表達模式，以探討兩基因在滇水金鳳響應銅脅迫中的功能，從而為深入探究滇水金鳳耐銅分子機制奠定基礎，并為利用鄉土植物修復銅污染水體提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料及銅脅迫試驗設計

野生滇水金鳳采自云南省昆明市撈魚河濕地公園。2022年6月在西南林業大學樹木園大棚對滇水金鳳進行扦插擴繁，60 d后挑選生長一致的植株，清水培養7d后轉入1/2 Hoagland營養液再培養7d，然后對其進行銅脅迫處理，即在1/2 Hoagland營養液中分別添加0、5、10、15、20、25mg·L-1

CuSO4·SH2O，并分別在處理第0、6、12、18、24天采集葉片，于-80℃保存備用。

1.2 滇水金鳳總RNA的提取與CAX3、CCS基因的克隆

利用植物總RNA提取試劑盒（Omega）提取滇水金鳳葉片的總RNA，然后用逆轉錄試劑盒（TransGen）合成cDNA第一鏈，于-20℃保存備用。

基于前期轉錄組測序篩選的滇水金鳳耐銅基因CAX3和CCS的CDS序列設計正、反向引物（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，然后以滇水金鳳的cDNA為模板進行擴增。擴增體系：10 μmol/L正向和反向引物各0.4 μL，2x Taq PCR StarMix（Dye） 10 μL， cDNA模板lμL，ddHCO補足至20 μL。擴增反應程序：預變性95℃5 min;變性95℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃ 1 min 30 s，35個循環：72℃10 min，4℃保存。擴增產物經1 .5%瓊脂糖凝膠電泳后純化回收目的條帶，連接pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，最后挑選陽性菌液送生工生物下程（上海）股份有限公司測序。

1.3 滇水金鳳CAX3和CCS基因的生物信息學分析

運用ExPASy在線軟件對CAX3和CCS蛋白的理化性質進行分析：運用SMART在線工具預測其結構域：采用TMHMM 2.0在線軟件進行跨膜區預測：采用WoLF PSORT在線軟件進行亞細胞定位預測：利用SOPMA軟件進行二級結構預測：借助SWISS-MODEL預測其三維空間結構：利用BLAST、DNAMAN 9.0軟件進行序列比對分析，并用MEGA軟件進行系統進化分析。

1.4 銅脅迫下滇水金鳳CAX3和CCS基因的表達分析

利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法檢測滇水金鳳CAX3和CCS基因在不同濃度銅脅迫處理下的表達情況。根據CAX3、CCS和內參基因Actin的cDNA序列，設計熒光定量PCR引物（表2），利用Light Cycler 480Ⅱ（Roche）進行基因表達分析。反應體系：10 μmol/L正、反向引物各0.4 μL， Hieff@ qPCR SYBR Green Master Mix（NoRox） 10 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補足至20μL。反應程序：預變性95℃5 min；變性95℃10 s，退火60℃30 s，延伸72℃20 s，40個循環。每個樣本進行3次技術重復。利用2-ΔΔCt法計算基因表達量，采用Microsoft Excel 2019和SPSS27.0軟件進行數據分析，用Origin 26.0軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 滇水金鳳CAX3和CCS基因的克隆

經過PCR擴增，獲得滇水金鳳CAX3和CCS基因的全長cDNA序列，分別為1 320 bp和975bp（圖1），分別編碼439 aa和324 aa。將兩個基因分別命名為IuCAX3和IuCCS。

2.2 IuCAX和IuCCS蛋白的理化性質及序列分析

由表3可見，IuCAX3蛋白分子量為48 503.55Da，屬于不穩定的酸性蛋白，定位在質膜和液泡上：IuCCS蛋白的分子量為34 536.12 Da，屬于穩定的偏酸性蛋白，定位在葉綠體上。TMHMM 2.0分析結果表明，IuCAX3蛋白序列具有11個跨膜結構域，而IuCCS蛋白序列無跨膜結構域（圖2）。運用NCBI CDD對其保守結構域進行分析，結果（圖3）顯示，IuCAX3具有caca2超家族的保守結構域，IuCCS具有PLN02957超家族的保守結構域。兩蛋白二級結構均由α-螺旋、β-轉角、延伸鏈、無規則卷曲組成，在IuCAX3中的占比分別為53 .99%、2.73%、13.67%、29.61%，在IuCCS中的占比分別為32.72%、6.17%、20.06%、41.05%（圖4）。運用SWISS-MODEL對IuCAX3和IuCCS蛋白的三級結構進行預測，結果見圖5。

2.3 IuCAX3和IuCCS蛋白的系統發育分析

對來自不同物種的CAX3和CCS蛋白分別進行同源性比對，發現IuCAX3和IuCCS分別與喜馬拉雅鳳仙花（I.glandulifera）的CAX3和CCS同源性最高，相似性分別為98.18%和89.81%。通過MECA構建系統進化樹（圖6），分析表明Iu-CAX3和IuCCS均分別與喜馬拉雅鳳仙花的相應蛋白聚為一支，親緣關系最近：同時還發現滇水金鳳兩個蛋白均與杜鵑花科杜鵑花屬和越橘屬部分植物的相應蛋白親緣關系較近，如IuCAX3與圓葉杜鵑（Rhododendron williamszanum）、朱紅大杜鵑（R．griersonianum）、杜鵑（R．simsii）、常綠越橘（Vaccinium darrowii）、高叢越橘（V.corymbosum）等的CAX3蛋白親緣關系較近，IuCCS與羊躑躅（R．molle）、圓葉杜鵑、常綠越橘等的CCS蛋白親緣關系較近。

2.4 銅脅迫下IuCAX3和IuCCS基因的表達分析

qRT-PCR分析結果（圖7）顯示，銅處理能大幅上調滇水金鳳葉片中IuCAX3和IuCCS基因的表達，且均以15mg·L-1處理的表達水平顯著高于其他濃度處理：兩基因間比較，IuCCS的表達水平明顯高于IuCAX3。隨著處理時間的延長，IuCAX3的表達量先升高后降低，當銅濃度不高于15 mg·L-1時在處理第12天達到峰值，而當銅濃度超過15mg·L-1時則推遲至第18天達到峰值，處理第24天的表達量均明顯下降：而IuCCS的表達量在不高于15 mg·L-1的銅處理下呈先升后降再升的變化趨勢，在高于15 mg·L-1的銅處理下則先升后降，但各處理第24天的表達量均較高。綜上推測，兩基因在滇水金鳳抵御銅脅迫過程中均發揮著重要作用，但IuCAX3主要在銅脅迫前期發揮作用，而Iu-CCS則在銅脅迫后期發揮的作用更為顯著。序列號前字母組合代表物種。RW：圓葉杜鵑（Rhododendron wil-liamsianum）；RC：朱紅大杜鵑（Rhododendron griersonianum）；RS：杜鵑（Rhododendron simsii）；VD：常綠越橘（Vaccinium darrowii）；vc：高叢越橘（Vaccinium corymbosum）；IG：腺柄鳳仙花（Impatierzsglandulifera）；AC：變色耬斗菜（Aquilegia coerulea）；CC：黃連（Cop-tis chinensis）；AO：石刁柏（Asparagus officinalis）；EG：油棕（Elaeisguineensis）；AS：深圳擬蘭（卻ostasia shenzhenica）；DC：黃石斛（Dendrobium catenatum）；PE：小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis eques-tris）；PM：稷（Panicum miliaceum）；ZP：沼生菰（Zizania palustris）；JE：燈芯草（Juncus effusus）；CL：康藏嵩草（Carex littledalei）；RP：刺子莞屬植物Rhynchospora pubera；AF：卷毛馬兜鈴（Aristolochiafimbriata）；RM：羊躑躅（Rhododendron molle）；JR：胡桃（Juglarzs re-gia）；QS：歐洲栓皮櫟（Quercus suber）；QR：夏櫟（Quercus robur）；DA：參薯（Dioscorea alata）；DZ：盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis）：PD：海棗（Phoenix dactylifera）；PH：黍屬植物（Panicum halllii）；PV：柳枝稷（Panicum virgatum）；SB：高粱（Sorghum bicolor）；LP：黑麥草（Lolium perenne）；TD：野生二粒小麥（Triticum dicoccoides）；PP：小立碗蘚（Physcomitrium patens）；SM：江南卷柏（Selaginella moellendorffii）；NC：蜂猴（Nycticebus coucang）。

3 討論與結論

CAX和CCS基因在植物非生物脅迫如重金屬脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫等方面發揮著重要作用。本研究從野生滇水金鳳中克隆得到IuCAX3和IuCCS基因，cDNA序列長度分別為1 320 bp和975 bp，分別編碼439 aa和324 aa。IuCAX3屬于不穩定蛋白，這與張國香等在紫花苜宿中的研究結果一致：IuCCS屬于穩定蛋白，這與唐欣等在牡丹中的研究結果一致。IuCAX3蛋白序列具有11個跨膜結構域，與紫花苜蓿和甘藍型油菜的部分CAXs -致，而IuCCS蛋白序列中無跨膜結構域。IuCAX3定位在質膜、液泡上，這可能與其通過水解ATP供能可將細胞質中的金屬離子轉運到液泡中的功能相關：而IuCCS與結縷草ZjCCS、水稻OsCCS等一樣，均定位在葉綠體上，推測CCS是葉綠體的靶向蛋白。

系統發育分析發現，滇水金鳳的IuCAX3和IuCCS均與同屬植物喜馬拉雅鳳仙花的相應蛋白聚為一支，相似性分別為98. 18%和89. 81%。除此之外，杜鵑花科杜鵑花屬植物的CAX3和CCS也分別與IuCAX3和IuCCS聚在同一個大支上，親緣關系也較近，這可能與滇水金鳳所屬的鳳仙花科與杜鵑花科同屬于杜鵑花目有關。

CCS和CAX3基因在不同植物中的表達特征具有較大差異，大部分與重金屬脅迫誘導相關，參與了植物抗重金屬脅迫的應答機制。CAX家族基因在不同植物如小花南芥、長夜紅砂、越橘等中都參與鎘脅迫響應。CCS基因在模式植物擬南芥中的研究較深入，表明在受銅脅迫后其表達量有增加趨勢：芭蕉MaCCS啟動子區存在大量非生物脅迫響應元件，且其在Cu處理下上調表達，表明MaCCS參與Cu脅迫響應。本研究發現，滇水金鳳的丸CAX3和Iu-CCS基因在銅處理下均大幅上調表達，且IuCCS的表達量明顯高于IuCAX3：隨著銅濃度的增加，兩基因的表達量均先顯著升高后顯著降低，15mg·L-1銅處理下的表達量顯著高于其他濃度處理。液泡吸收重金屬離子是植物緩解重金屬脅迫的主要機制，質膜上含有較多CAXs有助于提高植物在高濃度重金屬脅迫下的存活率。本研究中銅處理下丸CAX3上調表達，可使滇水金鳳更好地抵御銅脅迫。據報道，滇水金鳳在銅脅迫下的SOD活性隨銅濃度的增加呈現低促高抑的現象，這與本研究中IuCCS的表達趨勢一致。但隨著銅處理時間的延長，IuCAX3和丸CCS表達水平的變化趨勢存在差異，IuCAX3的表達量均先升高后降低，第24天的表達量明顯降低：而Iu-CCS的表達量在銅濃度不高于15 mg·L-1時呈先升后降再升的變化趨勢，在銅濃度超過15 mg·L-1時則先升高后降低，但處理第24天的表達量仍較高。推測IuCAX3主要在銅脅迫前期起作用，Iu-CCS則在銅脅迫后期發揮主要作用。

綜上，本研究從滇水金鳳中克隆了耐銅基因IuCAX3和丸CCS基因，并對其進行了生物信息學分析和銅脅迫下的表達分析，初步證明了兩者在滇水金鳳耐銅過程中發揮著重要作用，但其具體的作用機制以及調控網絡還有待深入研究。本研究結果可為探究滇水金鳳耐銅分子機制奠定基礎，并為利用鄉土植物修復銅污染水體提供新的理論依據。

基金項目：云南省農業聯合專項重點項目（202IOIBD070001-018）；國家自然科學基金項目（32060364，32060366）；云南省園林 植物遺傳改良與高效繁育博士生導師團隊項目（503210103）