生物炭對不同黑脛病抗性烤煙品種根際土壤細菌群落結構的影響

摘要：本試驗旨在探究不同品種煙草根際土壤中添加生物炭對細菌群落結構的潛在影響，以期為完善和優化烤煙微環境調節措施以及黑脛病綜合防治策略提供理論支撐。通過盆栽試驗，選用3種對黑脛病抗性不同的烤煙品種凈葉黃（高感），NC82（高抗），K326（中抗），以未種植過煙草的土壤為空白對照，分別設置施生物炭與未施生物炭處理，利用高通量測序技術研究生物炭對烤煙根際土壤細菌群落結構以及黑脛病發病狀況的影響。結果表明：（1）未施用生物炭時，不同品種煙草的發病率表現為凈葉黃顯著高于另外兩個品種；施用生物炭后，各品種的黑脛病發病率顯著降低，凈葉黃的防治效果為56. 52%，NC82及K326的分別為27.00%和31.00%。（2）土壤細菌群落Alpha多樣性分析結果顯示，生物炭與烤煙品種之間存在顯著的交互作用。未施用生物炭時，NC82和凈葉黃的根際土壤細菌多樣性顯著高于K326;施加生物炭后，K326的土壤細菌多樣性明顯提升，而NC82和凈葉黃呈現出不同程度的下降。（3）LEfSe結果顯示，不同品種間根際土壤優勢菌群呈現顯著差異，生物炭的施用使品種間的差異更加明顯。（4）細菌群落結構與組成分析結果表明，未施用生物炭情況下，不同品種烤煙之間土壤細菌群落結構存在顯著差異；除未植煙土壤外，施加生物炭前后不同烤煙品種間土壤細菌群落結構均無顯著變化。綜合來看，施加生物炭可以有效遏制烤煙黑脛病的滋生蔓延，不同品種烤煙土壤細菌結構對生物炭施入的反應有所差異，在運用生物炭改善土壤質量以及煙草微觀生態環境的過程中，必須充分考慮到品種因素的影響。

關鍵詞：生物炭；黑脛病；烤煙；根系土壤；細菌群落結構

中圖分類號：S572：S154.3 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）10-0102-12

土壤微生物的組成和分布直接影響土壤質量及肥料的分解、植物對微量元素的吸收和對土傳病害的防治。適量施肥可以改善土壤的結構、透氣性和保水性，增加有機質含量，使得植物更容易吸收營養。施用生物炭是改良土壤微生態的方式之一。生物炭是指各種生物質在高溫低氧環境中碳化成的富碳混合物，且具有明顯芬芳氣味。多項研究顯示，生物炭在優化土壤理化特性、減緩病原體繁衍、促進作物生長及改善土壤微生物生態平衡等方面表現出顯著而獨特的效力。張廣雨等發現，在煙草青枯病發生嚴重地塊施用生物炭，可提高該地塊土壤的pH值和養分含量，同時降低煙草青枯病的發病率與病情指數。劉卉等研究表明，在煙株移栽前的土壤中施加生物炭可顯著緩解烤煙黑脛病的發生并提高烤煙產質量。Shen等的研究結果顯示，向感染青枯病的烤煙施用生物炭可顯著提升土壤微生物多樣性，并能減少青枯病相關病原菌的數量，最終降低烤煙植株青枯病發病程度。Wang等研究發現，利用生物炭對種植辣椒土壤進行改良處理后，土壤中致病性極強的疫霉菌的數量和密度明顯降低，進而達到有效控制辣椒疫霉病的目的。在實際農業生產過程中，不同農作物對生物炭的響應程度因作物品種差異而有所區別。董朝霞等通過對不同青枯病抗性桑葚品種施加生物炭后發現，易感青枯病桑樹的根際放線菌數量迅速增加，但與抗病桑樹相比，根際微生物在利用多種碳源方面的效率要低得多。Fornes等對2個番茄品種土壤中施加由橄欖磨坊的廢料所制成的生物炭發現，高劑量生物炭對品種Gransol RZ地上部和根部均有負面影響，而對品種Cuarenteno的地上部無影響。Zhu等研究發現，遼豆13比鐵豐3號更有效地受益于生物炭，與對照相比，遼豆13的籽粒產量在10%生物炭施用量下增加51.0%，而鐵豐3號增加40.4%。

煙草黑脛病是由疫霉菌引起的一種危害性極大的根部真菌病害，俗稱“黑稈瘋”或“烏頭病”，在我國大部分植煙區均有發生，給全世界煙草生產帶來了嚴重的經濟損失。土壤是煙草黑脛病傳播的重要途徑之一，且病原菌會與土壤中其他微生物共同存在于煙草根部周圍進而改變植煙土壤微生態環境，這不利于我國煙草行業可持續發展。目前，關于生物炭對多種農作物的多種病害（如番茄青枯病與枯萎病、大豆根腐病、小麥赤霉病以及甘蔗紅腐病等）產生影響的研究已有報道。然而，關于生物炭對不同烤煙品種根際土壤中微生物群落結構及影響機制的研究較少。因此，本研究通過高通量測序數據分析，探討生物炭對黑脛病不同抗性烤煙品種根際土壤細菌多樣性的響應機制，以期為運用生物炭調節煙草微生態環境并實現烤煙黑脛病的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集煙田0-40 cm土層土壤。該煙田土壤類型為褐土，其基本肥力參數如下：有機質含量為11.65 g/kg，速效磷、速效氮、速效鉀分別為10.09、81.59、134.57 mg/kg。

供試生物炭為花生殼生物炭，由花生殼經持續高溫（450℃）和低氧氣含量環境封閉式炭化處理而成。其基本理化特性：pH值8.34，總碳、總氮、碳氮比分別為414.75 g/kg、14.29 g/kg、28.98，比表面積為22.97 m2/g。

參試烤煙品種為中抗黑脛病品種K326、高抗品種NC82和高感品種凈葉黃。

1.2 試驗設計

試驗于2020年4-9月在河南農業大學許昌校區溫室內進行。采用室內盆栽方式，每個品種分別設置施生物炭與未施生物炭兩種處理，以未栽植煙草為空白對照，總共8個處理（表1），每處理重復5次。所用盆體口部直徑為35.0 cm，底部直徑為25.5 cm，高33.5 cm。每盆施用2.5 g氮素（N）作為基肥，氮（N）：磷（P2O5）：鉀（K2O）的比例保持在1：1.5：3。每盆添加100 g生物炭。移栽后灌溉充足的定根水，使煙株能夠迅速恢復生長活力。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑脛病病原體接種

煙苗移栽后30天，使用精密注射器針頭在煙株莖基部輕輕劃出傷口，隨后采用灌根法注射濃度為1×106 cfu/mL的煙草疫霉孢子溶液15 mL。

1.3.2 黑脛病發病情況調查

依據《煙草病蟲害分級及調查方法》（GB/T23222-2008），對移栽后45天的煙株進行黑脛病發病狀況調查。煙草黑脛病分級標準見表2。

1.3.3 土壤樣品采集

煙苗移栽后45天，拔出整株煙根，去除石礫以及動植物殘體，用刷子輕輕刷落煙根表面土壤，裝于無菌塑料自封袋中，-80℃超低溫冰箱保存，用于高通量測序。

1.3.4 土壤細菌群落結構高通量測序

按照E．Z.N.A.⑩soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U．S．）試劑盒說明書提取土壤總DNA，然后設計通用引物NT-F（5＇- CTTGGSOCATTTAGAG-GAAGTAA -3＇）、NT-R（5＇- GCTGCGTSOCTSO-CASOCGATGC-3＇）進行PCR擴增。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送上海美吉生物醫藥科技有限公司，利用Illumina公司的MiseqPE300平臺進行測序，并將原始數據上傳至NCBI數據庫。

1.4 數據處理與分析

使用Microsoft Excel 2019以及DPS 7.0軟件進行數據處理與分析，應用R語言進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 病害發生情況統計

如表3所示，烤煙移栽后45天，高感品種凈葉黃的黑脛病發病率和病情指數在未施用生物炭的情況下均顯著高于K326和NC82;施用生物炭后，NC82、K326、凈葉黃的發病率分別降低了56.00%、64. 63%、75. 00%，防治效果分別為27.00%、31.00%、56.52%。表明施用生物炭可以抑制煙草黑脛病的發生。

2.2 樣品脫機測序數據統計

高通量測序數據統計結果（表4）顯示，按97%的相似度標準進行分類，各樣本的平均有效序列數量達54 693.4條。最長序列長度平均約為498 bp，最短約為233 bp，序列的平均長度約417bp。表明測序有效數據量充足，可用于進一步分析。

2.3 Alpha多樣性分析

2.3.1 樣本OTU測序分析

如圖1所示，隨著測序樣本數量的增加，Pan曲線的斜率持續升高，各組中OTU總數也不斷增長并趨于穩定：Core曲線反映所有樣本核心OTU數量的演變過程，Core曲線的斜率呈逐級降低走勢，表明各組內樣本間共有OTU數量呈降低趨勢，且趨向穩定。表明測序質量和測序深度都滿足后續分析的要求。

2.3.2 Alpha多樣性指數分析

根據最低樣本序列對樣本進行抽平后共獲得30 122條有效序列，以97%為相似性閾值對其進行劃分及OTU聚類，總共得到了8 021個OTUs，歸屬于45個門，360個目，146個綱，1 091個屬，580個科，2 264個種。

由表5可知，生物炭對烤煙根際土壤細菌群落的Alpha多樣性指數無顯著影響，但烤煙品種對Chaol、Shannon和Simpson指數表現出顯著或極顯著影響。未施生物炭情況下，K326的各項Alpha多樣性指數均顯著低于NC82和凈葉黃。烤煙根際土壤細菌的有效序列數和Chaol指數明顯受到生物炭和品種互作效應的顯著影響，生物炭處理降低了不植煙土壤（CK）細菌有效序列數和Chaol指數：凈葉黃和NC82根際土壤細菌多樣性對生物炭的響應與CK相似，但K326卻表現出相反的變化趨勢，生物炭對該品種根際土壤的細菌多樣性具有促進作用。

2.4 細菌群落組成與結構分析

2.4.1 門水平細菌群落分布

如圖2所示，在未添加生物炭的情況下，變形菌門（Proteobacteria）及放線菌門（Actinobacteriota）等為各處理的優勢菌門，總豐度達80%以上。生物炭對不同抗性烤煙品種根際土壤細菌優勢菌門相對豐度的影響不同，施用生物炭后，與CK相比，CKB中放線菌門、酸桿菌門豐度下調，變形菌門和厚壁菌門（Firrnicutes）豐度上調，綠彎菌門豐度微微下調；凈葉黃根際土各類細菌相對豐度的變化趨勢與CK相反：K326根際土壤放線菌門和變形菌門豐度對生物炭的響應與CK相似：NC82根際土壤中除放線菌門外，酸桿菌門、綠彎菌門、變形菌門和厚壁菌門豐度對生物炭的響應均與CK相似，分別表現為上調、下調、微微下調和上調。

圖3顯示了各處理施用生物炭前后土壤細菌在門水平上豐度變化顯著的類群。施用生物炭后，不植煙的土壤（CKB）中厚壁菌門、髕骨菌門（Patescibacteria）、硝化菌門（Nitrospirota）與Dei-nococcota的豐度顯著提高；高感品種凈葉黃（JB）根際土壤中SAR324_cladeMarine_group_B與纖維桿菌門（Fibrobacterota）的豐度顯著降低；中抗品種K326（KB）根際土壤中放線菌門的豐度顯著升高，而脫硫菌門（Desulfobacterota）與NBI-j的豐度顯著降低：高抗品種NC82（NB）根際土壤中Dependentiae豐度顯著升高，鹽厭氧菌門（Halanaerobiaeota）豐度顯著降低。由此可知，生物炭的施用對不同抗性品種烤煙根際土壤細菌在門水平上的影響表現不同。

2.4.2 屬水平細菌群落分布

如圖4所示，共檢出23個屬，其相對豐度在不同處理不同品種烤煙間差異明顯。施人生物炭后，這23個屬的總豐度在未種植煙草以及種植K326與NC82的土壤環境中均呈下降趨勢，在凈葉黃土壤中表現為增加。與不施生物炭相比，CKB中有10個屬上調，13個屬下調：NB中有8個屬上調（4個屬與CK相同），15個屬下調（8個屬與CK相同）：KB中有12個屬上調（5個屬與CK相同），11個屬下調（7個屬與CK相同）；JB中有12個屬上調（1個屬與CK相同），10個屬下調（1個屬與CK相同）。

2.4.3 不同烤煙品種根際土壤關鍵細菌對于生物炭施入的響應

以LDA值高于3.0為閾值進行LEfSe分析，結果（圖5）顯示，在對照土壤中，鏈霉菌科（Streptosporangiaceae）、索氏菌科（Solirubrobacteraceae）等微生物類群顯著富集；施人生物炭后，對照組土壤中髕骨菌門、藍細菌綱（Cyanobacteriia）、葉綠體目（Chloroplast）等類群的細菌數量明顯增多。在K326的根際土壤中，放線菌綱（Actinobacteria）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等菌群具有極高的富集度，施人生物炭后，Gaiellales目、酸桿菌綱（Acidobacteri-ae）等明顯增加。煙草NC82土壤中數量較多的微生物有芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、11- 24目等，施人生物炭后Blastocatellales科、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）等顯著富集。在凈葉黃根際土壤中高度富集的微生物有伯克氏菌目（Burk-holderiales）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等，施人生物炭后TKIO綱富集顯著。以上結果表明，不同品種烤煙根際土壤中主要微生物種類呈現顯著的多樣性，這些微生物在應對生物炭的影響時表現出不同的反應模式。

2.5 不同烤煙品種根際土壤細菌群落組成的層級聚類及PCoA分析

2.5.1 細菌物種豐度聚類分析

門水平上相對豐度前35類群的層次聚類結果（圖6）顯示，除了K326與CK和CKB處理間距離最近外，NC82、凈葉黃施炭與未施碳處理和K326施炭處理相對距離較近，聚成一組。屬水平上豐度前40類群的層次聚類分析結果（圖7）顯示，不同處理屬水平與門水平的結果相似，但處理間相似性略有不同，主要優勢菌屬不能很好地區分，表明通過層次聚類分析的方法無法體現處理間的差異，但可以體現出主要優勢菌屬的豐度分布。

2.5.2 細菌群落門水平主成分分析

在未施生物炭情況下，不同烤煙品種根際土壤中細菌群落主成分分析結果（圖8）表明，品種間群落結構存在顯著差異（P= 0.024）。其中，第二主成分PC2和第一主成分PC1對細菌群落結構的影響較為顯著，解釋率分別為23.42%和44. 05%。K326與NC82間的根際土壤細菌群落結構相似性較高，而與凈葉黃表現出了明顯的分離現象。表明不同品種之間的土壤細菌群落結構特征存在著明顯的分化。

生物炭的施用改變了土壤細菌的群落結構（圖9），對于未種植煙株土壤，生物炭顯著改變了土壤樣本中細菌群落結構的分布態勢（P=0.045），其分布方向傾向于向PC1軸的左上方趨近。不同抗性烤煙品種的土壤細菌群落對生物炭的反應模式不同，但施用前后差異不顯著。其中，NC82的土壤細菌群落在受到生物炭影響后，沿PC2軸向上遷移，呈現出明顯的變化；凈葉黃沿PC2軸向下遷移：K326向PC1軸的左上方偏移，表明其對生物炭的響應趨勢介于CK與NC82之間。

3 討論與結論

根際是一個復雜的微生態系統，在植物生長發育中起著重要作用。本研究中，不同品種烤煙黑脛病病情指數和發病率排序如下：NC82＜K326＜凈葉黃：添加生物炭后，各品種的發病率均明顯下降，表明生物炭對煙草黑脛病的發生具有良好的抑制效果，該結論與李成江等的研究結果一致。究其原因，可能在于生物炭特殊的結構為微生物的生長、繁衍以及代謝活動提供了適宜的環境條件，同時為土壤提供碳源，促進有益菌并抑制病原疫霉菌的生長發育。

不同抗性烤煙品種間根系土壤細菌群落Al-pha多樣性對生物炭施入的響應存在顯著差異。Alpha多樣性指數在生物炭和烤煙品種間存在顯著互作效應。K326的土壤細菌多樣性相對較低，凈葉黃和NC82的相對較高，表明根際微生物的多樣性受煙草品種影響較大，主要原因在于不同植物以及同一種植物不同品種根系土壤物質組成存在區別，對特定微生物產生的促生或抑生作用也各不相同，最終影響根際土細菌群落結構的Al-pha多樣性。

生物炭對烤煙根際土壤中微生物多樣性產生了異質性影響。其中，K326的土壤微生物多樣性顯著增加：而NC82和凈葉黃的土壤菌群多樣性有不同程度的減少。這與丁瑋等在水稻上的研究結果相吻合。可能是因為生物炭能為微生物提供適宜的碳源，從而激發細菌的繁殖發育，使中抗品種K326根際土細菌多樣性增加：同時生物炭對土壤微環境具有一定的改善作用，促進某類細菌的生長發育，當其群落大小或數量差異變大時，群落的均勻度會降低，進而導致多樣性指數下降。

植煙土壤中主要的優勢菌門包括酸桿菌門、放線菌門等，總豐度達到80%以上，且各優勢菌門的相對豐度在不同煙草品種之間存在差異，這與Lauber等的研究結果一致。施用生物炭后部分菌門相對豐度發生顯著變化，其中，未植煙土壤中包括厚壁菌門、髕骨菌門、硝化菌門與Deino-coccota; NC82根際土壤中包括Dependentiae與Halanaerobiaeota；凈葉黃根際土壤中包括SAR324_cladeMarine_group_B與絲狀桿菌門：K326根際土壤中包括放線菌門、脫硫菌門與NB1-j。LEfSe分析結果表明，不同抗性烤煙品種對生物炭的反應程度亦有著明顯的區別，其根際土壤中的關鍵微生物群體表現出顯著的類別劃分態勢，這與殷全玉等的研究結果基本一致。由于生物炭的作用機制復雜，其對細菌菌群的影響也是多種多樣的，這些都有待于深入探索。

本研究發現，未施生物炭情況下，抗黑脛病能力不同的烤煙品種間根際土壤細菌群落構成具有顯著差異，其中高抗品種NC82以及高感品種凈葉黃的根際土壤中細菌群落結構表現出完全分裂的傾向。值得一提的是，生物炭在改良未種植煙草土壤細菌群落結構方面展現出較佳的效果，而各植煙土壤在施入生物炭后細菌群落也發生了一定程度的分離，但未達到顯著性差異水平，表明生物炭的添加不能有效改變不同抗性煙草品種的土壤微生物群落結構，這與關于大豆的研究結果相似。

本研究表明，根際土壤細菌群落Alpha多樣性指數在生物炭和烤煙品種間存在顯著互作效應。在植煙土壤中添加生物炭可以降低煙株黑脛病的發病率。不同煙草品種根際土壤中的關鍵微生物類群有所區別，而且這些微生物對生物炭的反應也不同。具體來看，高抗品種和高感品種之間土壤細菌群落結構存在顯著區別，并且對生物炭的響應規律也有所不同。盡管生物炭的施入總體上并未顯著改變不同抗性烤煙品種根際土壤的菌群結構，但相對而言，中等抗性品種K326對生物炭輸入的靈敏度更高，使得其根際土壤細菌群落結構出現較為顯著的轉變。

基金項目：河南省科技攻關項目（232102110053）；中國煙草總公司陜西省公司科技項目（2022610700260183，2021611000270042）