單細胞測序技術在纖維化疾病中的應用進展

[摘要]纖維化疾病是由異常的損傷修復反應引起的病理改變，通常表現為間質細胞及細胞外基質的過度沉積，導致組織器官結構破壞和功能喪失，是許多疾病致殘、致死的主要原因。單細胞測序技術出現之前，對纖維化疾病的研究主要局限于組織層面及細胞的平均狀況，缺乏單一細胞水平的研究，在揭示細胞異質性或疾病相關細胞類型方面還存在很多局限性，這可能是纖維化疾病發病機制尚未完全闡明的重要原因。本文對單細胞測序技術在纖維化疾病中的最新研究進展進行總結和評述，從單個細胞層面鑒別纖維化疾病間質細胞的異質性和細胞亞型及其發揮的作用，以期為纖維化疾病發病機制的深入研究提供一定參考。

[關鍵詞]單細胞測序；纖維化疾病；細胞異質性；細胞亞型；發病機制

[中圖分類號]R641" " [文獻標志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2024）12-0192-05

Application Progress of Single-cell RNA Sequencing Technology in Fibrotic Diseases

YUN Jiao， XIE Ruxin， ZHANG Shiwei， ZHONG Ai， CHEN Junjie

（ Department of Burn and Plastic Surgery， West China Hospital， Sichuan University， Chengdu 610000， Sichuan， China ）

Abstract： Fibrotic diseases are a tissue fibrotic disorder arising following an aberrant wound-healing response. Fibrosis， characterized by interstitial cells proliferation and excessive accumulation of extracellular matrix （ECM）， contributes to a high level of morbidity and mortality worldwide. Fibrosis can affect any organ， leading to progressive tissue and organ dysfunction. To date，the etiopathogenesis of fibrotic diseases has not been thoroughly elucidated， which is partially due to the incomplete understanding of the heterogeneity and subtype. The development of single-cell RNA-sequencing gives us an opportunity to explore pathogenesis of the fibrotic diseases under the heterogeneity and subcluster. Compared with the average expression of genes from a mixed cell population obtained via high-throughput sequencing， large-scale single-cell RNA-seq allows unbiased assessment of cellular heterogeneity at an unprecedented scale and resolution. In this review， we primarily focus on the recent insights into the heterogeneity and subclass of mesenchymal cells in fibrotic tissues by scRNA-seq. Therefore， it will greatly benefit to facilitate our comprehension of pathogenic mechanisms of fibrotic diseases.

Key words： single-cell RNA-sequencing; fibrotic diseases; heterogeneity; subtype; pathogenesis

纖維化的本質是組織細胞受到損傷后的修復反應，但當損傷較大或反復損傷超出了損傷周邊實質細胞的增生修復能力時，間質細胞和細胞外基質將大量增生對缺損組織進行修復。當修復反應過度、過強或者失控時，即發生纖維化的病理改變，引起器官結構破壞和功能衰竭，嚴重威脅人類健康和生命[1]。在全世界范圍內，組織纖維化是許多疾病致殘、致死的主要原因，據美國有關統計資料表明，接近45%死亡患者的病因可以歸結于組織纖維化疾病[2]。到目前為止，人們對纖維化疾病發病機制的認識還存在局限性[3]。單細胞測序技術出現之前，以往的測序技術只能反映被測細胞基因的平均表達水平，并不能識別每個細胞表達的信息，對纖維化疾病的研究主要局限于組織層面及細胞的平均狀況，在揭示細胞異質性或疾病相關細胞類型方面還存在很多欠缺，這可能是纖維化疾病發病機制尚未完全闡明的重要原因[4]。

單細胞測序技術是在細胞層面對單一細胞進行基因測序的技術，可以描述單個細胞的特征，這為充分了解組織的細胞異質性、明確細胞間各基因之間的調控關系以及發現疾病相關新的細胞亞型等帶來了突破性見解[5]。近年來，隨著單細胞測序技術的迅速發展，越來越多的研究者利用該技術對纖維化疾病的機制進行了深入研究。本文綜述了單細胞測序技術在纖維化疾病中有關細胞異質性及亞型的最新研究進展，以期為纖維化疾病發病機制的進一步研究提供參考。

1" 肺纖維化

1.1 巨噬細胞：為了探索肺纖維化疾病中間質細胞亞型及其在肺纖維化過程中發揮的作用，Dvir等人使用單細胞測序技術對由博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中的巨噬細胞的異質性進行研究。研究結果確定了肺纖維化中巨噬細胞的三個不同亞簇：C1、C2和C3簇。C1簇為肺泡巨噬細胞，C3簇為間質巨噬細胞，而C2簇為中間簇，介于肺泡巨噬細胞和間質巨噬細胞之間。由167個肺纖維化患者和50個健康對照的肺樣本組成的數據分析顯示，肺纖維化患者的C1簇基因表達顯著降低，C2和C3簇基因表達顯著增加[6]。其中單核細胞衍生的肺泡巨噬細胞C1簇發揮促纖維化作用[7]。有推論認為C2簇是肺損傷后到肺纖維化病變過程中出現的過渡態。另外，肺纖維化單細胞測序數據分析顯示，成纖維細胞也分為A、B、C三簇。而且巨噬細胞和成纖維細胞之間的旁分泌相互作用維持成纖維細胞增殖和組織纖維化，C2簇細胞通過產生Pdgf-aa促進成纖維細胞遷移或增殖證明了這一理論。該研究將博來霉素誘導肺纖維化小鼠中分離并培養2 d含C2簇巨噬細胞的培養基與從相同小鼠中分離含C1簇巨噬細胞的培養基相比，發現C2簇的培養基增強了成纖維細胞的遷移能力。與C1簇培養基相比，Pdgf-aa的抗體阻斷抑制了含C2簇培養基中成纖維細胞的增殖，表明成纖維細胞遷移或增殖依賴于C2簇巨噬細胞分泌的Pdgf-aa[8]。上述研究應用單細胞測序技術發現了巨噬細胞、成纖維細胞的新細胞亞型及在肺纖維過程中發揮的作用，對進一步探究肺纖維化疾病發生發展新的分子機制具有重要作用。

1.2 內皮細胞：為了探索肺纖維化疾病發展中內皮細胞的作用，Liu X等[9]通過單細胞測序技術來研究博來霉素誘導的大鼠肺纖維化中內皮細胞（Endothelial cell，EC）的異質性。他們對2 181個內皮細胞（479個來自對照肺的細胞，1 702個來自BLM處理肺的細胞）進行了重點分析，并確定了五個不同的內皮細胞亞群。進一步的分析表明，這些內皮細胞亞群參與了與肺損傷和纖維化相關的生物學過程，如“血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的產生”、“血管生成的調節”、“單核細胞趨化”和“細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）結合”。還發現標記為a簇的內皮細胞在纖維化肺組織中擴張，表現出促纖維化表型，并可能通過與基質細胞等的潛在聯系在肺纖維化中發揮關鍵作用。該研究還通過肺纖維化中內皮細胞、巨噬細胞和基質細胞之間的通信分析，揭示了內皮細胞在募集單核細胞、誘導成纖維細胞增殖以及促進細胞外基質的產生方面都具有重要作用。有學者研究表明內皮-間充質轉化（EndMT）參與了纖維化的發病機制[10]，而該研究使用單細胞測序技術分析了EndMT相關基因的表達水平，卻發現在五個內皮細胞亞群中的表達沒有顯著差異。因此，單細胞測序技術不僅能夠鑒別新的細胞亞群、明確亞群的生物學過程，還可以用來檢驗以前的研究成果。

2" 肝纖維化

2.1 肝星狀細胞：又叫伊東細胞、貯脂細胞、脂肪細胞、肝竇周細胞（Hepatic stellate cell，HSC），是肝臟非常重要的非肝細胞類型之一。HSC產生和分泌許多不同的細胞因子和生長因子來維持肝臟穩態并調節肝損傷后的肝再生[11]。肝損傷后，HSC會通過表達細胞外基質α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和I型膠原的基因，同時減少過氧化物酶增殖物激活受體γ（PPARγ）等基因的表達，激活為肌成纖維細胞（Myofibroblast，MFB）[12]。肝星狀細胞激活轉化成為肌成纖維細胞和細胞外基質（ECM）蛋白沉積是肝纖維化的主要病理表現。Dobie R等[13]使用單細胞測序技術分析肝纖維化的證據也充分證明了肝星狀細胞是肝損傷肝纖維化小鼠模型中主要的膠原產生細胞。Zhang W等[14]使用單細胞測序技術分析四氯化碳（CCl4）誘導的肝纖維化小鼠的肝星狀細胞，共確定了8個HSC亞群。該研究分析顯示，HSC1簇表達與細胞增殖相關的基因，如CDC20，這表明HSC1簇可能代表活化HSC群體的早期活化階段，而HSC2、HSC3和HSC4是衍生自HSC1的主要中間HSC簇，HSC5和HSC6是晚期至終末期HSC群體。這揭露了肝損傷后HSC激活轉化的軌跡，為肝損傷肝纖維化進展過程中HSC向肌成纖維細胞轉化的深入研究提供了重要參考依據。

2.2 肌成纖維細胞：Krenkel的研究團隊將肝纖維化小鼠體內靜息的肝星狀細胞和肌成纖維細胞，與體外培養的肌成纖維細胞通過單細胞測序技術進行分析比較，發現靜息的肝星狀細胞形成以高血小板衍生生長因子受體β（PDGFRβ）表達為特征的同質群體，而體內和體外的肌成纖維細胞則分裂成以α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、膠原或免疫標記物為特征的異質群體。除此之外，該研究還發現肌成纖維細胞分為四個亞群，即MFBⅠ、MFBⅡ、MFBⅢ、MFBⅣ，其中MFBⅢ亞群與增殖的成纖維細胞關系最為密切[15]。研究數據證明了肌成纖維細胞的異質性，同時也表明了肝纖維化中存在功能相關的亞群。單細胞測序技術在肝臟上的應用從單個細胞水平為肝臟細胞譜系多樣性提供了前所未有的分子證據，同時也揭示了肝纖維化相關的細胞亞型及其功能等，為了解肌成纖維細胞在肝纖維化發生和發展中的作用提供了新的參考方向[16]。

3" 心肌纖維化

3.1 成纖維細胞：心肌纖維化是心肌損傷過程中許多非心肌細胞，包括成纖維細胞、內皮細胞等去取代壞死或凋亡的心肌細胞進而修復損傷的適應性反應。但當這種機制失代償時，非心肌細胞會導致心臟組織僵硬和功能受損，嚴重時可導致心力衰竭和死亡[17]。Wan J等[18]使用單細胞測序技術對心肌纖維化慢性心力衰竭小鼠的非心肌細胞進行研究，該研究標注了9種非心肌細胞，包括B細胞、內皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、NK細胞、中性粒細胞、周細胞、平滑肌細胞和T細胞，為心肌纖維化的研究奠定了細胞基礎。心肌成纖維細胞在心肌纖維化中發揮著關鍵作用。心肌缺血后，成纖維細胞被激活，發生纖維化反應，導致膠原蛋白產生修復心肌[19]，而其過度增殖和活化會導致病理性心肌纖維化。在單細胞測序技術的支持下研究人員將成纖維細胞分為6個亞組，包括Fib_0、Fib_1、Fib_2、Fib_3、Fib_4和Fib_5。其中，Fib_0簇的細胞比例變化最為顯著，其細胞數量顯著增加。功能富集分析表明，Fib_0簇中差異表達的基因主要富集膠原合成功能，揭示了這個亞簇與心肌纖維化過程密切相關。基于單細胞測序數據心臟內皮細胞根據不同的轉錄特征被分為5個簇，End_0、End_1、End_2、End_3和End_4，其中End_2可能是與細胞外基質的黏附和遷移有關的細胞，與心肌纖維化有著密不可分的關系。基于單細胞測序數據的心肌纖維化心力衰竭小鼠的細胞-細胞間通信分析為我們提供細胞類型之間的多邊通信網絡，幫助我們深入了解和掌握信號傳輸的整個過程，從而形成動態的疾病發展軌跡。在9種非心肌細胞類型通信檢測中，成纖維細胞和內皮細胞與其他細胞的配體-受體關系最為顯著。在心肌纖維化心力衰竭晚期，成纖維細胞與其他細胞之間的信號交流明顯減弱，這可能是由于成纖維細胞在心力衰竭晚期階段整體過度衰老所致。相比之下，心力衰竭晚期內皮細胞和巨噬細胞與其他細胞之間的交流增強，這表明心肌纖維化致心力衰竭晚期的活躍細胞可能是內皮細胞和巨噬細胞[20]。上述研究結果進一步表明，基于單細胞測序數據和細胞間通信分析揭示的新細胞簇及其信號網絡在心肌纖維化進展中起著不可或缺的作用。

3.2 IL-11與成纖維細胞：Obana M等[21]對心臟纖維化小鼠進行了單細胞測序分析，發現IL-11和IL-11受體均在成纖維細胞中富集，并且IL-11在產生細胞外基質促進心肌纖維化的成纖維細胞亞群中高度表達。研究數據表明IL-11在心肌成纖維細胞中具有強烈的促纖維化作用，可以增加肌成纖維細胞和細胞外基質的產生、運動、收縮和侵襲。與之前的研究者提出的IL-11通過轉錄激活劑減輕心肌梗死后的心臟纖維化結論相反[22]。因此，利用單細胞測序技術對生物分子等進行進一步分析與研究為探究心肌纖維化機制提供新的證據非常重要。

4" 腎纖維化

4.1 肌成纖維細胞：雖然人們普遍認為肌成纖維細胞是導致纖維化的細胞，但腎臟肌成纖維細胞的起源仍然存在很大爭議[23]。根據以往學者們的研究報道，大約50%的腎臟肌成纖維細胞來源于周細胞譜系[24]。然而，另一半的起源仍不清楚，有的認為肌成纖維細胞來源近端管狀上皮細胞[25]，也有認為來源于循環祖細胞的，還有報道腎肌成纖維細胞的35%源自骨髓來源的間充質細胞[26]。此外，纖維細胞和巨噬細胞也被認為是腎臟肌成纖維細胞的祖細胞。為了驗證肌成纖維細胞的來源，Kramann R等[27]進行單細胞測序分析，實驗數據反映了肌成纖維細胞的異質性，進一步證明了單核細胞來源在腎纖維化中占肌成纖維細胞的一小部分，而大多數腎肌成纖維細胞來源于間充質細胞，如周細胞和成纖維細胞。

4.2 腎小管上皮細胞：Rudman-Melnick V等[28]使用單細胞測序技術揭示缺血再灌注誘導腎纖維化研究中鑒定了腎細胞群，包括足細胞、腎小管上皮細胞、Henle環、收集管細胞、內皮細胞、周細胞、巨噬細胞、T細胞和基質/周細胞等，還在近端小管檢測到腎損傷時纖維化標志物基因Col1a1、Vim、Fn1升高。也有研究表明腎小管上皮細胞周期停滯和成纖維細胞活化是纖維化的早期觸發因素[29]。有學者利用單細胞測序技術進一步揭示了DAB2基因在腎臟中僅表達于腎小管上皮細胞與巨噬細胞，將腎小管上皮細胞上的DAB2基因敲除后可以減緩腎臟纖維化進程。這項研究表明了腎小管上皮細胞上的DAB2基因在腎纖維化中的重要作用[30]。以上結論反映了利用單細胞測序技術研究腎纖維化帶來的新見解，為腎纖維化機制探索提供了一定參考。

5" 皮膚纖維化

5.1 增生性瘢痕：又稱為肥大性瘢痕，在臨床上常表現為局限于原損傷邊界范圍內的質韌性增厚、突起，可伴或不伴有瘙癢及疼痛。增生性瘢痕是一種以細胞外基質過度沉積為特征的異常瘢痕，難以治療，其形成的確切機制及更好的治療方式也一直在探索當中。宋濱宇等[31]利用單細胞測序技術對3個正常瘢痕和3個增生性瘢痕的共計45 095個細胞進行分析，確定了16個細胞簇在不同細胞群體之間表現出高度的異質性，發現根據基因標記結果16個細胞簇分屬于8種類型的細胞，分別是黑素細胞（14簇）、朗格漢斯細胞（8、9簇）、T細胞（7、12簇）、汗腺細胞（18簇）、成纖維細胞（0、2、4、5、10、15簇），角質形成細胞（11、13簇）、平滑肌細胞（3簇）和內皮細胞（1、6簇）。Sideek MA等[32]在前人的基礎上，利用單細胞測序技術研究了增生性瘢痕內皮細胞的異質性，鑒定了17個細胞簇。其中，血管內皮細胞由標記的7簇表示并表達PLVAP、ACKR1和SELE；還發現增生性瘢痕皮膚中血管內皮細胞占比較正常皮膚約高出兩倍。

5.2 瘢痕疙瘩：Deng CC等[33]通過使用單細胞測序技術探索瘢痕疙瘩中成纖維細胞的異質性，結果表明瘢痕疙瘩成纖維細胞可以分為4個亞群：分泌型乳頭狀細胞、分泌型網狀細胞、間充質細胞和促炎細胞。其中，與正常瘢痕組織相比，瘢痕疙瘩中間充質成纖維細胞亞群的百分比顯著增加。基于單細胞測序數據，他們分析了配體-受體間相互作用介導的細胞-細胞通信，觀察到在瘢痕疙瘩中，間充質成纖維細胞和其他細胞之間的相互作用最為豐富，這表明間充質成纖維細胞在瘢痕疙瘩形成中發揮著重要作用。Liu X等[34]對瘢痕疙瘩皮膚組織和鄰近相對正常組織的28 064個細胞進行了單細胞測序分析。揭示了瘢痕疙瘩組織中成纖維細胞和血管內皮細胞亞群的擴增顯著，反映出它們與瘢痕疙瘩的發病機制密切相關。他們的研究結果強調了TGFβ和Eph-ephrin信號通路在瘢痕疙瘩異常纖維化中的作用。確定了可能參與瘢痕疙瘩成纖維細胞纖維化過程的關鍵調節因子，如TWIST1、FOXO3和SMAD3。

5.3 硬皮病：也稱系統性硬化癥（Systemic sclerosis，SSc），是一種免疫介導的風濕性疾病，皮膚纖維化是SSc的顯著標志。根據皮膚纖維化的范圍可以將SSc患者分為兩個群：其一，局限性皮膚SSc（lSSc），皮膚纖維化局限于肘部、膝蓋或面部；其二，彌漫性皮膚SSc（dSSc），涉及四肢、軀干，甚至全身。有不少學者用單細胞測序技術研究了SSc患者皮膚成纖維細胞亞群的異質性。然而調節SSc纖維化的主要驅動因素和基本機制在很大程度上仍然未知。為了進一步探索系統性硬化癥的發生機制，Gur C等[35]對56例健康對照和97例處于疾病不同階段的SSc患者的皮膚和血液樣本進行了單細胞測序分析。結果發現成纖維細胞呈高度多樣化的轉錄狀態，注釋了10個不同的成纖維細胞亞群。表達COCH的成纖維細胞（Fibro_COCH）是皮膚中成纖維細胞的主要亞群之一，它表達特定的ECM成分促進皮膚纖維化形成。

單細胞測序技術在皮膚纖維化方面的新發現，在一定程度上補充了皮膚纖維化發病機制研究在單個細胞層面的欠缺，將為我們更好地探索皮膚纖維化提供寶貴的線索。

6" 其他纖維化疾病

Psaila B等[36]利用單細胞測序方法發現骨髓纖維化（Myelofibrosis，MF）患者的造血干、祖細胞不同于健康人，MF患者的造血干、祖細胞高表達巨核細胞相關的基因（VWF、ITGA2B/CD41），并存在表達PF4（較成熟巨核細胞的分子標記）和轉化生長因子（Transforming growth factor beta，TGF-β）的祖細胞亞群。表明MF患者的造血干、祖細胞可向巨核細胞系特異性分化。同時，通過比對MF患者和健康人分化成熟的巨核細胞發現，MF患者的巨核細胞高表達編碼細胞外基質蛋白的基因促進纖維化形成，同時又產生肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）抑制膠原蛋白的沉積，提示MF的發生是促纖維化因子和抗纖維化因子之間相互作用的結果。這些發現為骨髓纖維化的進一步研究帶來了重要的價值。

7" 小結

單細胞測序技術突破組織細胞平均水平的局限性，從單個細胞層面鑒別細胞異質性、揭示細胞亞型及其作用。該技術在肺纖維化、肝纖維化、心肌纖維化、腎纖維化、皮膚纖維化等疾病中的應用，分析了間質細胞的異質性，識別出了更多的細胞亞群及其表達的促纖維化機制，為進一步研究纖維化疾病潛在的發病機制提供了重要的參考價值。

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[收稿日期]2023-08-03

本文引用格式：云嬌，謝如欣，張師瑋，等.單細胞測序技術在纖維化疾病中的應用進展[J].中國美容醫學，2023，33（12）：192-196.