苗期水稻響應低磷脅迫的分子調控機制

摘要： 【目的】磷素是水稻生長必需的大量營養元素之一，磷營養供應不足將影響水稻產量和稻米品質。研究低磷條件下水稻根系的生理響應及其基因的差異表達，明確水稻根系差異表達基因對磷高效吸收和利用的生理調控機制，旨在為農業生產中磷高效吸收利用水稻品種的選種和育種提供理論依據。【方法】采用水培試驗，供試水稻材料包括磷敏感基因型通粳981 （TJ981）、耐低磷基因型鄭旱6 號（ZH6） 和根系擴展型鎮稻99 （ZD99）。分別設置營養液正常（CK） 與低磷（LP，磷濃度為CK 的1/20） 兩個磷濃度。水稻生長15 天后取樣，采用轉錄組測序（RNA-seq） 技術，結合水稻根內磷含量、根系分泌酸性磷酸酶（APase） 活性及根際pH 等指標變化情況，分析差異表達基因在水稻根系生理調控中的作用。【結果】與CK 處理相比，LP 處理的通粳981、鎮稻99 和鄭旱6 號根系上、下調差異表達基因數分別是447 和1395 個、352 和1185 個、475 和1856 個，且3 個不同水稻品種共有237 個差異表達基因，其中33 個上調差異表達基因和204 個下調差異表達基因。低磷條件下，通粳981、鎮稻99 和鄭旱 6 號水稻根中磷含量均顯著低于對照（CK），分別為對照的41.31%、36.29% 和33.17%，高于兩處理培養液中磷含量的差異，表明無機磷轉運蛋白1-2 基因的上調表達促進了根系對磷的吸收。低磷處理1、8 和15 天時，3 個品種水稻根系分泌酸性磷酸酶（Apase） 活性均高于對照，這一結果與紫色酸性磷酸酶基因的差異表達有關。【結論】低磷誘導水稻根系基因的差異表達，水稻根系中轉錄下調基因數遠多于轉錄上調基因數；低磷誘導水稻根系中無機磷轉運蛋白OsPT1-2 的上調表達，促進低磷條件下水稻根系對磷的吸收；紫色酸性磷酸酶和質膜H+-ATP 酶基因的誘導表達，增加了水稻根系分泌酸性磷酸酶活性，降低了H+的運輸和分泌，導致根際pH 降低，更有利于磷的吸收。

關鍵詞： 水稻；低磷；轉錄組測序；差異表達基因；生理調控

磷素是植物生長必需的大量營養元素，參與植物體內多種生理生化反應[1]，磷營養缺乏或不足將影響水稻產量和稻米品質。磷營養易被土壤中的有機物、金屬陽離子固定形成磷的有機、無機復合物，從而降低磷的有效利用。研究發現，磷肥的當季利用率較低，一般約為5%～15%，不會超過30%[2]。我國磷匱乏耕地占比超過65%，其中，約有30% 的耕地土壤中有效磷含量僅為3～5 mg/kg，由此可知大部分土壤有效磷含量較低[3]。據統計，世界上約有1/3 的耕地因為有效磷含量不足而影響植物的正常生長發育[4]。因此，磷素供應不足已成為限制作物高產的一個主要因素。

水稻（Oryza sativa） 是我國的三大糧食作物之一，年種植面積占糧食作物總面積的30%，產量是糧食作物的40%，水稻是對缺磷比較敏感的作物，因此，缺磷是限制我國水稻產量的一個重要因子[5]。有研究表明，在減施氮磷肥條件下，水稻產量與有效穗數、每穗總粒數、結實率、千粒重均呈極顯著正相關[6]。宋桂云等[7]通過研究低磷脅迫對直立穗型品種沈農265 和直立穗型品種遼粳294 產量性狀的影響，發現低磷脅迫使兩個水稻品種的經濟產量和生物產量都下降，如穗數和穗粒數減少、著粒密度下降。低磷條件下水稻根系磷素吸收能力是決定植株生長發育的關鍵因素[8]。研究表明，磷缺乏使根系分泌APase 增多、活性增強[9]，且APase 催化可重復利用有機磷化合物的分解[10]，提高根系對磷素的吸收[ 1 1 ]。因此，如何提高土壤磷資源有效利用效率，實現水稻的優質和高產，需研究低磷對水稻形態、生理和基因表達的影響，闡明水稻的耐低磷機制，發掘水稻耐低磷關鍵基因[12]，尋找低磷條件下水稻生產優質高效的栽培調控途徑，為水稻生產提供技術支撐。

本研究運用轉錄組測序、蛋白質譜分析與實時熒光定量PCR 技術相結合的方法，研究低磷對水稻根中基因表達的影響，重點分析低磷條件下水稻根中磷穩態調控相關基因的差異表達，結合低磷水稻根系中的磷含量和根系酸分泌活性變化等的檢測，著重分析低磷條件下差異表達基因在水稻根系生理調控中的作用，為農業生產中磷高效利用水稻品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

根據前期預試驗的研究[13]結果，選用磷敏感基因型水稻通粳981 （TJ981）；耐低磷基因型水稻鄭旱6 號（ZH6） 和根系擴展型水稻鎮稻99 （ZD99） 為供試材料。

1.2 材料處理

水稻種子的催芽、幼苗培養和低磷處理方法參照文獻[14]，略有改動。選擇籽粒飽滿的供試水稻種子，浸入20% HgCl2 溶液中消毒15 min 后，用去離子水沖洗3～5 次，再將種子放入加有適量去離子水的培養皿中，32℃ 催芽。待種子露白時，挑選發芽勢基本一致的種子，放入96 孔板中并置于塑料容器內，采用國際水稻研究所（IRRI） 完全培養液培養。

待幼苗達2 葉1 心時（約播種后15 天），挑選長勢健壯的幼苗進行分組培養，即正常營養液（CK） 培養和低磷（LP） 營養液培養。分別將秧苗置于對應寫好編號的塑料杯（規格為10 cm × 5 cm × 20 cm） 中。塑料杯分為兩組，一組加入約1 L 的正常培養液（對照組，CK），另一組加入1 L 的低磷培養液（處理組，LP，僅磷濃度按1/20 的比例降低，其余營養成分含量不變）。調節培養液的pH 至5.2～5.4，每天更換1 次培養液，每個處理設置6 次生物學重復。將幼苗放置于人工氣候箱中進行培養。培養條件：14h 光照/ 1 0 h 黑暗，溫度：光照時為3 2℃，黑暗27℃；濕度：60%～70%；光照強度：光照時為30000 lx，黑暗時為0 lx。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 酸性磷酸酶活性的測定 根系分泌酸性磷酸酶（Apase） 活性的測定方法參照文獻[15]。以每小時1 g 鮮重所生成的對硝基苯酚mg 數表示，每次處理3 株幼苗，設6 次重復。

1.3.2 磷（P） 含量的測定（微波消解-ICP-MS 法） 使用微波消解儀（MARS5） 對待測樣品進行處理后，用ICP-MS （Agilent7500a） 測定樣品中的磷含量，樣品消解的具體方法參照相關文獻[16] 。

1.3.3 RNA 提取、純化、建庫和轉錄組測序 采用TRIzol 法提取根中總RNA，磁珠純化mRNA后，以此為模板合成cDNA，經過磁珠純化、末端修飾、連接接頭后，對連接產物進行PCR 擴增并用磁珠純化制備測序文庫。對構建好的文庫進行質量和產量檢測，質檢合格后進行Illumina 表達譜測序[17]。

1.4 數據處理和統計分析

試驗數據采用Excel 2010 進行初步處理和圖表繪制，應用SPSS 25.0 軟件進行方差分析和相關分析。

2 結果與分析

2.1 差異表達基因數量的分析

以fold change 絕對值≥2 或≤0.5 （|log2FC|≥1或≤1） 并且P ≤ 0.05 為條件，對轉錄測序得到的基因進行篩選得知，與CK 相比，低磷誘導TJ981 水稻根中上、下調表達基因分別是447 個和1395 個；ZD99 水稻根中有352 個上調表達基因，1185 個下調表達基因；ZH6 水稻根中有上調表達基因475 個和1856 個下調表達基因（圖1）。

圖2 顯示，在低磷條件下，TJ981 和ZD99 共有差異表達基因292 個，上、下調基因分別為61 和231 個；TJ981 和ZH6 共有差異表達基因877 個，上、下調基因分別為74 和803 個；ZH6 和ZD99 分別有77 和625 個上、下調差異表達基因；3 個不同水稻品種共有上、下調差異表達基因分別是33 和204 個。

以上結果表明，低磷誘導不同品種水稻根中表達受抑制（下調表達） 基因的數量顯著高于受誘導（上調表達） 基因的數量。不同品種水稻根中既有一定數量的共有差異表達的基因，又有較多數量的品種特異性差異表達基因。也就是說，低磷誘導不同品種水稻根中基因的表達既有一定共性又有品種特異性。

2.2 差異表達基因分析

2.2.1 低磷誘導磷吸收相關基因的表達 由轉錄測序結果可知，低磷誘導供試水稻根中無機磷轉運蛋白1-2 基因（OsPht1;2） 的轉錄，各供試水稻品種與CK 有顯著差異（Plt;0.05），log2FC （fold change） 值TJ981 為1.590，ZD99 為2.261，ZH6 為1.096。

無機磷轉運蛋白顯著誘導表達可能促進低磷條件下水稻根系對介質中有效磷的吸收、分配和體內磷穩態的維持，為此，本試驗采用微波消解-ICPMS法，測定了水稻根系磷含量。由圖3 可知，在低磷處理下，TJ981、ZD99 和ZH6 水稻根中的磷含量均顯著低于對照，分別為對照的41.31%、36.29% 和33.17%。但在對供試水稻進行低磷處理時，所用營養液中磷含量僅為正常供磷培養液中磷含量的1/20。這表明，低磷處理下水稻根組織內磷含量占正常供磷處理下水稻根磷含量的比例超出了低磷和正常磷水平培養液中磷含量占比。由此驗證了低磷誘導無機磷轉運蛋白基因（OsPT1;2） 的表達能促進水稻根系對介質中有效磷的吸收。

2.2.2 磷活化相關基因的表達 在TJ981 和ZH6水稻根中，低磷顯著誘導紫色酸性磷酸酶15 （PAPs15） 基因的轉錄，供試水稻品種TJ981 和ZH6 與CK 有顯著差異（Plt;0.05），ZD99 與CK 無顯著差異，Log2 FC （fold change） 值TJ981 為1.453，ZH6 為0.949，ZD99 為?0.005。低磷誘導3 種水稻根系中紫色酸性磷酸酶22 （PAPs 22） 蛋白的翻譯結果見表1。供試水稻品種TJ981、ZH6 和ZD99 中，紫色酸性磷酸酶22 的匹配得分均為29.83，覆蓋值均為16.39，在TJ981、ZD99 和ZH6 中的變化倍數分別為1.69、1.76 和1.58。這表明，低磷能誘導水稻根系酸性磷酸酶（APase） 基因的表達。

為驗證低磷誘導水稻根中酸性磷酸酶（Apase） 基因的表達，測定了低磷水稻根系Apase 活性，結果表明，3 個品種水稻幼苗在低磷處理1、8 和15 天時，其根系分泌Apase 活性均較對照升高（圖4）。即低磷誘導PAPs 基因的表達進而導致水稻根系分泌Apase 活性升高。

另外，課題組前期以ZH6 為材料，采用0.1% 瓊脂糖凝膠檢測根系分泌酸的變化發現，與對照相比，低磷水稻根系分泌酸增多[15]。即低磷脅迫促進根系H+的分泌而使根際pH 降低，有助于結合態無機磷的活化。

3 討論

3.1 低磷水稻根中差異表達基因數量

轉錄組測序可知，低磷處理水稻根系中，下調基因數都明顯高于上調基因數，表現為下調基因數∶上調基因數為3∶1～4∶1。3 個品種水稻有大量的特異性差異表達基因，且品種間有一定數量的共有差異表達基因。這說明，低磷抑制水稻根中大量基因的表達。不同品種水稻根中基因表達對低磷脅迫的應答，既有一定的共性也有品種特異性。

3.2 差異表達基因分析

3.2.1 低磷誘導無機磷轉運蛋白基因（OsPT1;2） 的表達 磷酸鹽轉運蛋白1 （PHT1） 型蛋白被定義為磷（Pi） 攝取系統的主要貢獻者[18]，磷酸鹽通過根細胞吸收后，通過不同的磷酸鹽轉運蛋白在不同的植物組織和細胞器內轉運[ 1 9 ]。OsPHT1;1 和OsPHT1;8 對Pi 具有更高的親和力，并在富含Pi 的條件下參與水稻對Pi 的吸收和轉運[20?21]。本研究發現，低磷誘導3 種水稻根中OsPT1;2 的轉錄。OsPT1;2 屬于PHT1亞家族，已有研究結果發現，OsPT1;2 可能定位在質膜上，顯然OsPT1;2 的誘導表達能促進低磷條件下根系對培養液中有效磷的吸收，是低磷條件下水稻體內Pi 含量顯著降低的補償機制之一。此外，水通道蛋白在無機養分的運轉中也有一定的作用，本研究結果發現，低磷誘導TJ981 水稻根中水通道蛋白PIP 2-6 的翻譯。顯然，無機磷轉運蛋白（PHT） 和PIP 2-6 的顯著誘導表達能促進低磷水稻根系對介質中有效磷的吸收、分配及維持體內磷穩態。通過測定水稻根中P 含量也證實，OsPht1;2 誘導表達有助于根系吸收培養液中有效磷。

3.2.2 磷活化相關基因的表達 低磷條件下植物根系通過分泌有機酸、酸性磷酸酶、質子及糖類等物質直接或間接影響土壤磷素轉化，提高土壤磷有效性[22]。酸性磷酸酶（APase） 活性的變化是衡量植物應對缺磷的生理指標，也是植物對缺磷的一種適應性響應[ 2 3 ]。本研究結果發現，低磷條件下TJ981、ZD99 和ZH6 根系分泌的APase 活性均高于對照，這一結果與李永夫等[24]的研究結果基本一致。轉錄測序結果顯示，低磷誘導3 種水稻根中PAPs 15 基因的表達，這表明，低磷致使根系APase 活性增高與PAPs基因的誘導表達相關，由此可知，低磷誘導APase基因的表達及活性升高利于活化結合態有機磷。

此外，轉錄測序結果也表明，低磷能誘導TJ981根系質膜ATP 酶的轉錄，促進H+運輸和分泌，致使根際環境酸化。測定結果也證實，低磷導致水稻根際pH 降低。也就是說，低磷脅迫促進水稻根系酸的分泌，導致根際pH 降低，進而促進結合態無機磷的活化。

4 結論

低磷脅迫能影響TJ981、ZD99 和ZH6 水稻根系中1842、1537 和2331 個基因的轉錄，且轉錄下調表達基因數高于上調表達基因數。低磷脅迫通過誘導水稻根系中無機磷轉運蛋白基因OsPT1;2 的表達，促進低磷條件下水稻根系對培養液中有效磷的吸收。低磷脅迫通過誘導水稻根系中PAPs、質膜H+-ATP酶基因的表達，促進有機、無機結合態磷的活化。

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