發酵飼料對刺參生長及其腸道、養殖水體菌群的影響

摘"要：為深入研究發酵飼料對刺參（Apostichopus japonicus）苗種培育的效應，試驗對比了兩種發酵飼料的差異，評估它們對刺參苗種生長速率與存活率的影響，并通過高通量測序分析了飼料對養殖池水和刺參腸道菌群結構的差異和關聯。試驗選取75 kg健康刺參苗種，分為未發酵飼料組（CT）、枯草芽孢桿菌發酵飼料組（BA）和布氏乳桿菌發酵飼料組（LAB），每組3個平行。結果顯示，LAB組的特定生長率（4.14%±0.55%）最高，顯著高于CT組（3.36%±0.42%）和BA組（3.8%±0.75%）；BA組存活率最高（79.7%±2.74%），顯著高于LAB組（70.28%±1.11%）和CT組（72.42%±6.18%）。發酵飼料組的增重率和飼料系數優勢明顯。腸道菌群豐度和多樣性顯著高于水體（P＜0.05），LAB組和BA組的CHAO1指數、香農指數均高于CT組，發酵飼料增加了變形菌門和疣微菌門相對豐度。發酵飼料對腸道菌群有促進作用，提高了刺參的存活率和增重率，并增加了水體菌群豐度，對水體生態平衡有正面影響。

關鍵詞：刺參（Apostichopus japonicus）；發酵飼料；生長；高通量測序；菌群

刺參（Apostichopus japonicus）屬棘皮動物門（Echinodermata），海參綱（Holothuroidea），廣泛養殖于我國的膠東半島和河北、遼寧沿海地區^[1-2]。刺參是一種以沉積物為食的底棲生物，其腸道內細菌占有很高的比例。研究指出，細菌是刺參能量獲取的重要來源，超過70%的能量需求依賴于細菌的貢獻^[3]。因此，對刺參腸道及養殖環境菌群多樣性的研究顯得非常關鍵。刺參腸道的微生物生長依賴于其所處的養殖環境，而這些微生物群落也在刺參體內發揮著免疫和輔助消化的作用^[4]。當前，刺參飼料領域的研究焦點主要集中于飼料成分如何優化以促進刺參的生長發育^[5]，而針對刺參發酵飼料的深入探索尚處于初級階段。姜燕等^[6]在養殖實踐中觀察到，采用發酵飼料進行投喂，能夠顯著提升刺參的養殖產量，為刺參飼料配方的創新開辟了新路徑。本研究通過刺參發酵飼料為切入點，綜合分析了其對刺參生長、腸道菌群及養殖水體菌群的影響，旨在為刺參養殖提供理論依據和參考數據。

發酵飼料技術是抗生素禁令下的畜禽飼料創新技術^[7]，目前看發酵飼料主要有以下優點：改良飼料品質^[8]，降低餌料系數^[9]，物質會被分解成微小的分子和容易被動物吸收的營養物質，這樣一來，飼料就更容易被動物吸收和利用了^[10]。在發酵的過程中，微生物會產生大量消化酶和促生長因子，可以提高飼料的消化利用率^[11]。同時，發酵飼料可以降低飼料成本，飼料發酵之后通過益生菌的大量繁殖可以提高飼料的蛋白質含量^[12-13]此外，發酵飼料的投喂可以提高養殖動物的免疫力，增加養殖動物的抗病能力。目前已經有研究表明乳酸桿菌^[14]和芽孢桿菌^[15]可以產生細菌素，抑制病原菌的生長。

1"材料與方法

1.1"刺參苗種來源

本研究所使用的刺參來自遼東灣新區一家海水養殖場，選擇了生長狀況良好且攝食能量旺盛的健康刺參苗種，每頭苗種的規格為（1.93±0.22）g，經過5 d的臨時飼養后，進行相關的試驗研究。

1.2"飼料的來源與制作

本試驗所用飼料購于某水產飼料公司，飼料分三組，其中發酵組兩組，其中一組基于未經發酵的飼料，加入了5%的葡萄糖和10%的布氏乳桿菌發酵液，并在30°C的溫度下進行了2 d的恒溫發酵，從而得到了布氏乳桿菌發酵飼料。另一組在未發酵飼料的基礎上添加了5%的葡萄糖和10%的枯草芽孢桿菌發酵液，在30 ℃恒溫條件下發酵2 d，制備成枯草芽孢桿菌發酵飼料。將飼料與海泥以1∶4的比例充分混合，隨后加入足量海水并均勻攪拌，確保混合物細膩。之后，通過80目篩絹精細過濾，以去除雜質，最終得到的混合物即可進行投喂。

1.3"投喂發酵飼料對刺參生長的影響

在本次試驗中，選用了9個容積達40 m³的刺參育苗池，隨后在池中布設了波紋板，作為刺參幼苗的有效附著基質。每個育苗池中均投放12.5 kg刺參苗種。試驗設置三組不同的處理方式：第一組投喂未經發酵的飼料（CT組），第二組投喂由枯草芽孢桿菌發酵的飼料（BA組），而第三組則投喂由布氏乳桿菌發酵的飼料（LAB組）。每組設三個平行的處理組。試驗周期為40 d，每天投喂兩次，投喂量為刺參體質量的2%，日換水1/2，每隔20 d進行一次倒池。

在養殖試驗完成后，將所有的試驗刺參取出，測量其總重量，并進行隨機采樣，以計算刺參的平均體質量和特定生長率（Specific growth rate，SGR）；基于總重和平均體質量來確定總數，并據此進一步估算其生存率（Survival rate，SR）。根據刺參增重和初始體質量的比值算出增重率（Weight gain rate，WGR）。根據刺參試驗時間段內攝入的飼料總量和試驗時間段內的體質量增加總量，計算飼料系數（Feed Conversion Ratio，FCR），SGR（%·d^-1）、SR（%）、WGR（%）、FCR計算公式如下：

SGR=（lnW_t–lnW₀）/t×100%；

SR=（N₀-N_t）/N₀×100%；

WGR=（W_t-W₀）/W₀×100%；

FCR=TFI/TWG。

式中，W₀和W_t分別為試驗刺參的起始和結束時體質量，g；t為養殖的時間周期，d；N₀和N_t分別為試驗中刺參的起始數量和結束數量，個；TFI為刺參在特定時間段內攝入的飼料總量，g；TWG為刺參在同一時間段內的體質量增加總量，g。

1.4"樣品采集

選取健康刺參取出刺參腸道內容物，試驗開始時取第一次樣，20 d倒池時取第二次樣，40 d試驗結束時取第三次樣。分別標記為投喂枯草芽孢桿菌發酵飼料組BA₁、BA₂、BA₃，投喂布氏乳桿菌發酵飼料組LAB₁、LAB₂、LAB₃和不投喂發酵飼料的空白對照組CT₁、CT₂、CT₃。

采集刺參養殖池水質樣本4 L，運用玻璃采水器過濾處理，隨后經0.22 μm孔徑的無菌醋酸纖維素濾膜進行真空抽濾處理，旨在從樣本中分離并提取細菌總DNA。樣品分別標記為投喂枯草芽孢桿菌發酵飼料組W.BA₁、W.BA₂、W.BA₃，投喂布氏乳桿菌發酵飼料組W.LAB₁、W.LAB₂、W.LAB₃和不投喂發酵飼料的空白對照組W.CT₁、W.CT₂、W.CT₃。所有樣本都在-80 ℃的超低溫冰箱中冷凍儲存。

1.5"DNA提取

從刺參腸道和養殖水體樣本中，提取細菌的DNA，并參考相關文獻中的提取方法^[16]。

1.6"PCR擴增與高通量測序

細菌16S rRNA基因V3—V4片段的擴增引物為343F（5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′）（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和798R（5′-AGGGTATCTAATCCT-3′），進行PCR擴增，送至諾禾致源（北京）股份有限公司進行高通量測序。

1.7"數據分析

采用Usearch軟件執行OTUs（操作分類單元）的聚類分析，并確定了97%的相似度閾值。使用RDP-classifier軟件執行物種的分類，其中分類的閾值被設定為0.8，低于這個閾值的物種將被分類為未分類（Unclassified）。采用SPSS 17.0統計軟件，對試驗收集的數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA），進一步借助Tukey事后檢驗，以細致探究不同組別間的差異層次。顯著性水平為P＜0.05。

2"試驗結果

2.1"投喂發酵飼料對刺參特定生長率、存活率、增重率以及飼料系數的影響

根據表1的數據，LAB組的SGR值為（4.14±0.55）%/d，這一數值稍微超過了BA組，并且也明顯高于CT組（P＜0.05）；然而，從SR的角度分析，BA組的數值為（79.7±2.74）%，顯著高于CT組（72.42±6.18）%（P＜0.05）；從WGR來看，LAB組的增重率最高，為（68.83±1.04）%，BA組次之，CT組最低，為（55.33±2.52）%，差異顯著；飼料系數對比來看，LAB組最低，BA組次之，CT組最高。

2.2"高通量測序結果

利用高通量測序技術，我們對刺參腸道和養殖水體的18個樣本進行了檢測，得到了80 512～103 358條有效序列。這些有效序列的百分比均超過了79.81%，覆蓋率也高達96.42%，這證明測序的結果能夠真實地展現樣本的信息。

2.3"菌群多樣性

2.3.1"刺參腸道和養殖水體菌群多樣性分析

18個樣品中ACE和Chao1多樣性指數分別是刺參腸道樣品600.049～774.513和471.286～770.943，水體樣品302.333～397.065和335.364～397.065；Shannon和Simpson指數分別是刺參腸道樣品4.970～6.117和0.866～0.963，水體樣品3.254～4.663和0.654～0.896。不同飼料養殖的刺參，其腸道與養殖水體中的菌群構成在數量及多樣性方面均呈現出顯著差異（P＜0.05）。具體而言，等級分布曲線（rank abundance）能同時反映樣品中細菌的豐富度和均勻度。曲線在橫軸上的長度代表物種豐富度，長度越長，物種越豐富；曲線的平坦程度反映物種均勻度，曲線越平，均勻度越高。圖1（封三）顯示，刺參腸道細菌多樣性高于水體樣品，且腸道中有明顯優勢的細菌種類。

2.3.2"發酵飼料對刺參腸道和水體菌群的影響

基于OTUs的聚類分析數據，從樣本中篩選出了有效的OTUs，并對比了刺參腸道與養殖水體樣本之間的區別。從圖2（見封三）可以觀察到，在CT組中，刺參腸道和養殖水體樣本共享了47個OTUs，其中刺參腸道樣本中只有424個OTUs，而養殖水體樣本中只有295個OTUs。在BA組中，發酵飼料組的刺參腸道和養殖水體樣本共享了41個OTUs，在刺參的腸道樣本中，存在576個獨特的OTUs，而在養殖的水體樣本中，則有309個獨特的OTUs。在LAB組樣本中，刺參腸道和養殖水體樣本共同存在50個OTUs，在刺參腸道樣本中，有618個OTUs是獨特的，而在養殖水體樣本中則有309個獨特的OTUs。

以樣本中的OTUs繪制了Venn圖（韋恩圖）。由圖3（封三）可知，LAB組獨有的OTUs為376個，BA組獨有的OTUs為338個，CT組獨有的OTUs為225個，3組共同擁有的OTUs為163個。水體樣品中W.LAB組獨有的OTUs為191個，W.BA組獨有的OTUs為121個，W.CT組獨有的OTUs為119個，3組共同擁有的OTUs為124個。

2.3.3"基于門水平上的菌群結構與聚類分析

根據菌群結構分析，不同飼料投喂組別9個腸道樣品中檢測到的細菌歸屬于89個門類，32 704個屬，腸道樣本中變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobiae）、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteria）、藍菌門（cyanobacteria）、厚壁菌門（firmicutes）是主要優勢菌門，和CT組相比LAB組和BA組變形菌門相對豐度降低，疣微菌門相對豐度提高，LAB組菌群豐度最高。

養殖水體菌群結構分析中，不同飼料投喂組別9個養殖水體樣品中檢測到的水體樣本細菌歸屬于79個門類，13 013個屬，水體樣本中變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobiae）、蛭弧菌門（bdellovibrionota）、納古菌門（nanoarchaeota）等是主要優勢菌門，和W.CT組相比W.LAB和W.BA組變形菌門相對豐度降低，擬桿菌門相對豐度升高。

2.3.4"測序腸道及水體樣本中優勢微生物基于屬水平的系統分類

在屬水平上各組腸道菌群中的優勢菌屬主要是沈氏菌屬（Shimia）、桃色桿菌屬（Persicirhabdus）、魯杰氏菌（Ruegeria）、拉布倫茨氏菌屬（Labrenzia）、鹽桿條菌屬（Haloferula）、洛克氏菌屬（Halocynthiibacter）等。與CT組相比LAB組和BA組沈氏菌屬相對豐度降低，LAB組菌群多樣性最豐富。

水體各組的優勢菌屬為弧菌屬（Vibrio）、海生桿菌屬（Marivita）、海小桿菌屬（Marinobacterium）、棕囊藻桿菌屬（Phaeocystidibacter）、異冰居菌屬（Glaciecola）等，隨著投喂時間加長各組弧菌屬（Vibrio）的相對豐度都在降低，其中W.LAB組相對豐度最低。

3"討論

3.1"投喂刺參發酵飼料會影響其特定的生長速度、生存率、質量提升速度及飼料系數

發酵飼料過程中產生的微生物酶可以分解飼料中的復雜成分，從而提高飼料的消化率，使養殖動物能更好地吸收利用營養，有助于養殖生物的成長^[17]。通過對比投喂發酵飼料對刺參特定生長率、存活率、增重率和飼料系數的影響看出，LAB組的刺參特定生長率顯著高于CT組，BA組的刺參存活率顯著高于CT組。通過對比，投喂發酵飼料組的增重率提高了，同時飼料系數也降低了。李利華^[18]的試驗發現，發酵飼料顯著促進刺參生長及存活，其效果遠超常規飼料。本試驗的結論緊密契合前期研究揭示的發酵飼料對刺參存活率的正向作用，再度鞏固了發酵飼料在刺參養殖業中的優勢地位。

3.2"發酵飼料對刺參腸道菌群和水環境的影響

3.2.1"投喂發酵飼料對刺參腸道和養殖水體菌群多樣性影響分析

腸道菌群通過營養代謝、免疫調節、維持腸道屏障和影響神經系統，與宿主形成共生關系，平衡時促進健康生長，失衡可導致多種疾病。本研究表明，LAB組和BA組顯著提高了腸道菌群和養殖水體的OTUs數目和特有OTUs數目；與CT組相比，LAB組和BA組Chao1指數、香農指數提高，Chao1指數、香農指數分別與菌群豐度和物種多樣性呈正相關，這表明發酵飼料對刺參腸道菌群有一定的促進作用，這可能與發酵飼料中益生菌在刺參腸道定植有關。

在養殖水體中W.LAB組的Chao1指數和ACE指數均高于BA組和CT組，Chao1指數和ACE指數與菌群豐度呈正相關，說明布氏乳桿菌發酵飼料增加了水體菌群豐度，反應了對水體生態系統的正面影響，有助于維持或恢復水體的生態平衡和健康狀態。

3.2.2"基于門水平刺參腸道與環境之間的菌群結構關系

依據樣本中的菌群構成以及聚類分析的結果來進行研究，刺參腸道與養殖水體中，變形菌門占據核心地位，構成刺參養殖生態系統內最為龐大的細菌群體。此菌門在刺參所處的自然環境中，對核心的碳氮循環環節展現出不可或缺且決定性的功能^[19]。該結論與海洋細菌領域的廣泛研究成果相契合，進一步強化了先前發現的有效性與可靠性^[20]。在次優勢菌群中除了BA₁組的次優勢菌群為放線菌門，其余各養殖組的次優勢菌門均為疣微菌門。在養殖池塘水系中，海洋放線菌彰顯卓越大分子降解力，涵蓋淀粉與蛋白質，助力海洋生態物質循環。同時，該類微生物能合成高效抗菌物質，為天然抗菌劑研發提供重要資源。更值得一提的是，海洋放線菌獨具耐熱耐干孢子生成能力，這些特性賦予其在極端環境中生存并發揮作用的能力，從而極大地擴展了其應用前景與生態重要性，因此具有成為益生菌的巨大潛力^[21]。疣微菌門內的微生物在水生生態環境中有著廣泛的分布，并在生物地球的氮循環過程中發揮著至關重要的角色^[22]。擬桿菌門為海洋浮游細菌體系的核心分支，位居次優勢群落，其成員菌種憑借胞外水解酶合成，展現對幾丁質等生物大分子的分解能力^[23]。此外，擬桿菌門經常與脂質、蛋白質等有機物質的代謝和轉化密切相關，這些有機物質在水體的碳循環中起到了關鍵的作用^[24]。

本試驗還發現LAB組和BA組對比CT組變形菌門相對豐度降低，疣微菌門相對豐度提高。CT組相比LAB組和BA組腸道菌群在門水平上的組成結構也發生了一定的變化，這可能與發酵飼料能夠緩解腸道刺激、改善腸道環境有關。和W.CT組相比，W.LAB和W.BA組變形菌門相對豐度降低，擬桿菌門相對豐度升高。說明投喂發酵飼料對養殖水體菌群門水平的組成結構也有一定的影響。

LAB組的菌群結構較豐富，與之相對應的是該組的刺參特定增長率和增重率最高。各組的腸道樣品中只有BA組的次優勢菌門為放線菌門，同時在各養殖組中BA組刺參存活率最高，結合菌群功能分析推斷放線菌門可能起到了一定的作用。

3.2.3"基于屬水平刺參腸道與環境之間的菌群結構關系

聚類結果分析，刺參腸道菌群結構和水體菌群結構相關性較低。這與刺參底棲并以沉積物為食的習性有關，與前人研究結果一致^[25]。在試驗開始時各組水體樣品菌群中優勢菌屬均為弧菌屬（Vibrio），在養殖試驗結束時各組優勢菌屬均為海小桿菌屬（Marinobacterium）。海小桿菌屬廣泛分布于海洋環境中，該菌屬多為好氧、啫鹽性微生物，可以在各種溫度和鹽度的海洋環境中廣泛生存^[26]。和刺參腸道菌屬相對比，養殖水體優勢菌屬隨養殖周期變化更大。

刺參腸道優勢菌屬為沈氏菌屬（Shimia）、拉布倫茨氏菌屬（Labrenzia）、棕囊藻桿菌屬（Phaeocysti-dibacter）。沈氏菌屬（Shimia）、拉布倫茨氏菌屬（Labrenzia），都屬于變形菌門（Proteobacteria）的細菌，廣泛分布于海洋環境中，特別是在海水和海底沉積物中。這使得它們在海洋生態系統的碳循環中扮演重要角色，有助于維持生態平衡。拉布倫茨氏菌屬（Labrenzia）的某些細菌具有氧化硫化物的能力，這些細菌能夠將硫化物氧化為硫酸鹽，從而在硫循環中發揮作用，有助于減少環境中的硫污染^[27]。拉布倫茨氏菌屬（Labrenzia）在本試驗中為養殖中后期的優勢菌屬，且兩種發酵飼料組中的該菌屬豐度高于未發酵飼料組，結合生長存活數據發酵組高于未發酵組，推測發酵飼料在處理硫化氫等水產養殖有害物質時強于未發酵飼料。棕囊藻桿菌屬（Phaeocystidibacter）屬于變形菌門伶俐桿菌科，棕囊藻是一種廣泛分布于海洋中的微藻，因此棕囊藻桿菌屬的細菌可能與這些藻類存在共生或互利關系。刺參飼料中含有大量藻類，推測該優勢菌屬和投喂飼料有一定關聯。

4"結論

和不發酵飼料相比，發酵飼料對刺參中間培育過程中的生長和存活率都有一定的影響，投喂布氏乳桿菌發酵飼料可以顯著提高刺參養殖過程中的產量，投喂枯草芽孢桿菌發酵飼料可以提高刺參的存活率。刺參腸道與其周圍環境的主導菌群存在某種聯系，但同時也展現出其獨有的結構和屬性。本研究選用兩種不同菌種發酵飼料探究發酵飼料對刺參生長和菌群產生的影響，希望對刺參的綠色養殖給出理論參考。

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Effects of fermented feed on the growth of Apostichopus japonicus and its intestinal and water microbial communities

LIU Jingwen，WEI Yinghua，WANG Hanlin

（Key Laboratory of Mariculture amp; Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China ）

Abstract：

To investigate the effects of fermented feed on the cultivation of juvenile sea cucumbers （Apostichopus japonicus）， the impact of two types of fermented feed were examined on the growth and survival of juvenile sea cucumbers.High-throughput sequencing was used to analyze the differences and correlations in the microbial community structure between the culture water and the intestines of the sea cucumbers. 75 kg healthy juvenile sea cucumbers were selected and divided into three groups：the unfermented feed group （CT），the Bacillus subtilis fermented feed group （BA），and the Lactobacillus buchneri fermented feed group （LAB），with three replicates for each group.The results showed that the specific growth rate （SGR） was the highest in the LAB group （4.14%±0.55%），significantly higher than that in the CT group （3.36%±0.42%） and the BA group （3.8%±0.75%）.The survival rate was the highest in the BA group （79.7%±2.74%），significantly higher than that in the LAB group （70.28%±1.11%） and the CT group （72.42%±6.18%）.The fermented feed groups also exhibited significant advantages in terms of weight gain rate and feed conversion ratio.The intestinal microbial community's abundance and diversity were significantly higher than those in the water （p＜0.05）.The Chao1 and Shannon indices in the LAB and BA groups were higher than those in the CT group.Fermented feed increased the relative abundance of the phylum Proteobacteria and enhanced the relative abundance of the phylum Verrucomicrobia.Fermented feed positively influenced the intestinal microbiota，improving the survival rate and weight gain rate of the sea cucumbers，and increased the microbial abundance in the water，contributing to ecological balance in the aquatic environment.

Key words：Apostichopus japonicus;fermented feed;growth; high-throughput sequencing;microbial community

（收稿日期：2024-10-21）