基于KASP技術快速檢測略陽烏雞MSTN和 KLF7基因SNP及其與體質量性狀關聯性分析

摘" 要" 為高效、低成本對略陽烏雞SNP變異位點進行準確分型并評價其選育效果，采用KASP技術對略陽烏雞群體MSTN基因外顯子1的g.233Agt;G位點和" KLF7基因內含子2的g.1022Cgt;T位點，進行連續四個世代SNP多態分析。結果顯示：MSTN基因檢測到AA、AG、GG 3種基因型，" KLF7基因檢測到CC、CT、TT 3種基因型；兩個位點均為中度多態，MSTN基因位點P1代、" KLF7基因位點P3和P7代偏離Hardy--Weinberg遺傳平衡狀態，其余各代均處于平衡狀態；體質量與多態位點關聯分析表明，MSTN基因位點AA型體質量顯著高于AG和GG型，" KLF7基因位點雜合型體質量顯著高于純和型，且體質量性狀隨世代顯著提高（Plt;0.05），研究結果表明經過世代選育后略陽烏雞體質量性狀選育效果顯著，同時表明兩個位點均可以作為略陽烏雞肉用性狀選育的有效選擇位點。

關鍵詞" KASP技術；MSTN；" KLF7；關聯分析；體質量性狀選育

doi：10.7606/j.issn.1004-1389.2024.08.001

https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2024.08.001

收稿日期：2023-12-15" 修回日期：2024-01-02

基金項目：2023畜禽新品種培育-略陽雞（K3031223079）。

第一作者：蔡瑛婕，女，碩士研究生，研究方向為動物遺傳育種與繁殖。E-mail：caiyingjie2022@nwafu.edu.cn

通信作者：張建勤，女，博士，副教授，博士生導師，研究方向為動物遺傳育種與繁殖。E-mail：zhangjianqin0822@nwafu.edu.cn

單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）作為動植物基因組中最常見的遺傳變異類型之一，已經應用于基因定位、遺傳圖譜構建、親緣關系分析及遺傳標記輔助選擇等多個基礎研究領域［1-2］。SNP檢測和分型技術包括TaqMan探針法、PCR-RFLP、PCR-SSCP、競爭性等位基因特異性PCR 技術（Kompetitive Allele Specific PCR，KASP）、SNP芯片等方法。利用SNP多態性標記的主要障礙之一是基因分型的效率和成本［3］，其中，PCR-RFLP難以找到合適的內切酶，SNP芯片檢測成本較高，TaqMan探針法價格昂貴且檢測設計不夠靈活［4］，PCR-SSCP步驟繁瑣，較為耗時，效率低［5］，而KASP技術具有低成本、高通量、高特異性和高靈敏度等優勢被更多關注和應用［6-7］，KASP技術是一種基于已知SNP位點的終點熒光基因分型技術，該檢測方法可使用等位基因特異性熒光對共顯性標記進行基因分型，將雙等位基因SNP基因分型為同源等位基因1、同源等位基因2及雜合型［8］。 近年來，KASP技術在畜禽研究領域被廣泛應用，例如牛、羊、家禽等經濟動物的產乳［9-12］、生長繁殖等［13-18］生產性狀基因SNP位點挖掘及遺傳疾病鑒定［19-20］、動物福利［21］方面。

MSTN基因是轉化生長因子-β超家族最重要的成員之一，目前在羊、牛和家禽等物種上已被定位和標記，馬麗娜等［22］通過TaqMan探針法檢測了灘羊MSTN基因SNP分型并發現RS417816017位點XY型個體具有生長優勢，高峰等［23］對西門塔爾牛MSTN基因直接測序，比對了突變前后MSTN基因的理化性質，任冰冰等［24］和左斌等［25］證明MSTN基因多態性可以作為草科雞、瀘寧雞和米易雞屠宰性狀的候選基因。KLFs是真核生物中重要的調控因子，" KLF7是KLFs家族的成員之一，研究表明，牛" KLF7基因內含子2中g.42025 Tgt;C、g.42075 Agt;G的SNP多態性可作為牛生長性狀的遺傳標記［26］，董定娟等［27］發現在廣西黃雞和寧海黃雞" KLF7基因上，有兩個相同的位點18000Agt;C、45125Tgt;A對部分屠體性狀有極顯著或顯著影響。

本試驗以肉用系略陽烏雞P1代、P3代、P5代和P7代母雞作為試驗材料，通過KASP技術迅速檢測MSTN基因和" KLF7基因SNP變異類型，并與體質量性狀進行關聯分析，進一步驗證MSTN基因和" KLF7基因作為影響略陽烏雞體質量性狀重要候選基因的世代選育效果，為略陽烏雞生長性狀的精確選育提供理論參考。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

隨機選擇肉用系略陽烏雞P1代、P3代、P5代和P7代各200只母雞，均來自于陜西省龍佳農業科技發展有限公司（龍昊烏雞種源繁育中心）。記錄略陽烏雞8周齡體質量，翅下靜脈采集血樣，裝入含有抗凝劑的5 mL真空采血管，置于" -80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2" 主要儀器和試劑

主要試劑：蛋白酶K、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-Hcl、乙二胺四乙酸EDTA、十二烷基硫酸鈉SDS（楊凌康博生物試劑經營部）；氯化鈉（楊凌索來寶生物化學玻璃儀器供應站）。

主要儀器：超微量分光光度計（Nanodrop 2000，賽默飛世爾科技公司）、實時熒光定量PCR儀（FQD-96A，杭州博日科技有限公司）。

1.3" DNA提取

采用酚氯仿法提取DNA，用Nanodrop 2000和1%瓊脂糖凝膠電泳測定DNA的純度和濃度，-80 ℃保存，備用。

1.4" KASP檢測

1.4.1" 引物設計" 根據GenBank上公布的雞MSTN、" KLF7基因序列（GenBank登錄號均為NC_052538），按照KASP技術原理，利用Premier 5.0軟件設計引物，該基因設計包含兩條具有競爭性等位基因特異性的正向引物和一條反向通用引物。兩條正向引物的3′端各自連接著已知序列的等位基因1或等位基因2，5′端連接不同的熒光探針，根據熒光信號的顏色，可以識別出樣品的SNP基因型。引物的退火溫度值控制在" 55 ℃～60 ℃，使用Oligo 7.56軟件對引物進行評估，避免引物出現錯配、發卡結構或二聚體等問題。引物序列如表1所示，由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

1.4.2" KASP分型

PCR反應體系總體積為" 5.0 μL，包括2.0 μL質量濃度為10 ng·μL-1的DNA，2.5 μL KASP Master Mix（LGC公司，UK），0.07 μL KSAP Primer mix和0.43 μL去離子水。反應中同時設置用去離子水代替DNA的空白對照，以防止試驗結果的偏差。PCR反應在Thermal Cycler PCR儀（S1000TM，USA）上進行。PCR反應程序為：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，從61 ℃以每循環遞減0.6 ℃至55 ℃，45 s，共10個循環；95 ℃，15 s，55 ℃退火和延伸45 s，共進行30個循環。PCR反應結束后進行熒光掃描和基因分型分析。

1.5" 數據處理

使用Excel 2022整理和計算樣品的基因頻率、基因型頻率和多態信息含量（Polymorphism Information Content，PIC），采用X2檢驗分析研究位點是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態，利用SPSS 26.0軟件處理和分析KASP分型結果與略陽烏雞的生長性狀之間存在的相關性，均使用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和最小顯著差異法（Least Significant Difference，LSD）進行多重比較，以Plt;0.05表示差異顯著，結果以“平均值±標準差”的形式表示。

2" 結果與分析

2.1" KASP分型結果

KASP分型結果揭示（圖1，圖2），200只略陽烏雞個體在MSTN和" KLF7基因中均發現3種基因型。

2.2" Hardy--Weinberg平衡檢驗

如表2所示，AA、AG基因型頻率為0.41～0.51，CC、CT基因型頻率為0.33～0.66，GG、TT基因型頻率最低，在連續4 個世代中，等位基因A、等位基因C為優勢等位基因；X2檢驗結果表明，MSTN基因位點P1代、" KLF7基因位點P3代和P7代偏離Hardy--Weinberg遺傳平衡狀態，其余各代均處于平衡狀態；根據等位基因頻率計算突變位點的PIC，均為0.25～0.5，說明兩個SNP位點為中度多態。

2.3" SNP與體質量關聯分析

由表3和表4可知，MSTN基因的" g.233Agt;G基因型位點與略陽烏雞各世代8周齡體質量顯著相關（Plt;0.05），在P1代中，AA型個體體質量顯著高于GG型（Plt;0.05），而AG型個體與AA型、GG型均無顯著差異（Pgt;" 0.05）。在P3、P5和P7代中AA型個體顯著高于AG型和GG型（Plt;0.05），而AG型和GG型無顯著差異（Pgt;0.05）。

KLF7基因上的SNP位點g.1022Cgt;T與略陽烏雞各世代8周齡體質量顯著相關，在P1代中，CT型個體體質量顯著高于CC型（Plt;" 0.05），而TT型個體與CC型、CT型均無顯著差異（Pgt;0.05）。在P3、P5和P7代中CT型個體顯著高于CC型和TT型（Plt;" 0.05），而CC型和TT型無顯著差異（Pgt;0.05）。同時，MSTN基因位點和" KLF7基因位點的體質量性狀均隨世代傳遞顯著提高（Plt;0.05）。

3" 討" 論

3.1" KASP分型技術的應用

KASP技術相較于DHPLC、Taqman探針法、PCR-SSCP、PCR-RFLP等技術具有速度更快、適用范圍廣、靈活性更強等優勢［28］，但仍具有一定的局限性，如本研究KASP分型結果顯示，除了3種分型結果外，還存在少量紫色信號，分析原因可能為模板DNA存在降解或濃度不高等問題，導致DNA片段化，出現了分型不明確的現象，表明模板DNA質量的高低對于KASP檢測成功率有重要影響，因此，實驗室小規模檢測條件下應當保證模板DNA的質量并調整到相似的濃度。同時，KASP熒光信號的定量處理會產生分型錯誤，SNP位點需在已知條件下才能進行檢測，對未知位點難以開展研究；對模板DNA質量要求較高；突變型等位基因數量過小時，難以區分野生型和突變型個體；若SNP位點距離較近時，KASP引物設計會受到影響導致無法進行有效PCR擴增。雖然KASP技術與基因精準分型的研究需求有一定差距，但相較于其他技術，KASP可作為一種更可靠、更迅速、更準確的檢測方法適用于基礎研究領域，也有必要提升KASP引物設計技術及模板DNA質量等基礎條件，并建立KASP數據庫及基因分型技術體系，為種質資源鑒定、分子標記輔助育種、群體分析等提供重要的輔助手段。

本試驗將KASP技術應用于略陽烏雞與生長性狀相關的SNP多態性連續世代研究，迅速快捷、準確低成本地完成了基因分型工作，以期為分子遺傳標記輔助育種提供理論支持，推動略陽烏雞分子遺傳標記輔助育種或其他家禽的育種" 進程。

3.2" 群體內的遺傳多樣性

本試驗對略陽烏雞SNP位點進行PIC分析，顯示MSTN和" KLF7的兩個SNP位點在略陽烏雞的各世代中呈現為中度多態性，莊嘉楠等［29］通過微衛星DNA分析來自3個散養場的黑羽和白羽略陽烏雞，發現略陽烏雞群體具有較高的遺傳多態性，相較本研究結果揭示的多態性高，主要是因為本研究的略陽烏雞群體是經過選育的群體，多樣性必然會較低。研究人員對寧海黃雞和廣西黃雞" KLF7基因多態性進行分析，結果顯示，寧海黃雞和廣西黃雞" KLF7基因大多數位點屬中度多態［27］，這與本研究結果相同。關聯分析結果顯示，MSTN基因AA型體質量顯著高于AG和GG型，表明AA型為優勢基因型，提示A等位基因是提高體質量的優勢等位基因。" KLF7基因雜合型體質量顯著高于純和型，然而這并不能證明該等位基因與體質量有直接的相關性，這一SNP位點的雜合狀態可能通過影響體質量相關的基因或基因產物，進而影響個體體質量。MSTN基因及" KLF7基因的優勢基因型在P3代、P5代、P7代相較P1代優勢更為明顯，體質量性狀隨世代顯著提高，說明本品種選育對略陽烏雞體質量性狀具有顯著的選育效果。X2檢驗分析結果表明，略陽烏雞MSTN基因各世代群體基因型頻率僅有P1代偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態，表明略陽烏雞體質量性狀選擇強度對該位點影響較小，并未打破遺傳平衡狀態。" KLF7基因各世代群體基因型頻率P1代、P5代處于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態，而P3代、P7代反之，表明在略陽烏雞體質量性狀選育過程中，該位點呈現平衡與不平衡狀態交替出現的現象，分析原因為存在等位基因的分離以及基因連鎖現象，導致該位點存在某些非隨機關聯。

3.3" 體質量性狀與MSTN基因型之間的關聯" 分析

MSTN基因編碼一種抑制肌肉細胞增殖和分化的生長因子，其基因突變或缺失可導致肌肉生長和發育的異常［30］。利用MSTN基因的遺傳變異信息，選擇有利遺傳變異，可以促進家畜的生長和發育，提高肉質和產量，從而為畜牧業的發展做出重要貢獻。本試驗對MSTN基因潛在的SNP位點進行探究，通過KASP技術進行分型，進一步分析SNP位點與體質量的相關性。KASP分型結果顯示，g.233Agt;G變異位點與不同基因型之間8周齡體質量具有顯著差異（Plt;0.05）。這與張跟喜等［31］的研究結果相似，MSTN基因c.234Ggt;A發生變異可以負調控邊雞體質量。任冰冰等［24］和左斌等［25］在草科雞、瀘寧雞和米易雞的研究中均證明了MSTN基因可以調控雞群的生長，證明MSTN基因可作為影響家禽生長性狀的候選基因，也可以作為分子標記進行輔助選擇育種。

3.4" 體質量性狀與KLF7基因型之間的關聯分析

KLFs家族是一類廣泛存在于真核生物中的轉錄因子，" KLF7是KLFs家族重要的家族成員之一，目前，" KLF7基因的研究主要集中在大型經濟動物如牛和豬等，對于家禽的研究較少，并且該基因與生長性狀的相關研究較為有限。Ma等［26］對4個不同品種共計1 002頭牛進行研究，結果表明" KLF7基因的g.42025 Tgt;C、g.42075 Agt;G變異位點與牛的生長性狀之間存在極顯著的關聯。這項研究為探索" KLF7基因在畜牧業中的應用提供了重要的理論基礎。家禽方面，Zhang等［32］研究發現，雞" KLF7基因SNP位點141Agt;G顯著促進肉雞的腹脂質量和腹脂率。 本研究結果表明，SNP變異位點對不同世代的8周齡體質量有顯著影響，證明" KLF7基因位點變異與略陽烏雞的體質量性狀存在相關性，這與Zhang等［32］的研究結果一致。" KLF7基因與脂肪沉積有關［33］，結合以上研究結果，推測" KLF7基因位點變異通過影響脂肪生成，進而影響家禽體質量性狀。

4" 結" 論

KASP技術具有低成本、迅速、準確度高等優點，但會由于DNA模板質量問題出現分型不明確現象；MSTN基因的g.233Agt;G位點和" KLF7基因的g.1022Cgt;T位點均可以作為略陽烏雞體質量性狀有效選擇位點。

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Rapid Detection of SNPs in MSTNand KLF7 Genes" in Lueyang

Black-bone" Chickens and Their Correlation with

Body Mass Traits Based on KASP Technique

CAI Yingjie，GUO Tong，ZHOU Jie，ZHANG Huiya and ZHANG Jianqin

（College of Animal Science and Technology，Northwest Aamp;F University，Yangling" Shaanxi" 712100，China）

Abstract" To accurately identify SNP sites and evaluate their application in the breeding effect of Lueyang black-bone chickens efficiently and cost effectively，KASP technology was used to analyze the SNPs in the first exon of MSTN gene （g.233Agt;G） and the second intron of"" KLF7 gene （g.1022Cgt;T） in the population of Lueyang black-bone chickens over four generations （P1，P3，P5，and P7）.The results showed that AA，AG，and GG genotypes were detected in the MSTN gene，CC，CT and TT genotypes were found in KLF7 gene.The SNPs in MSTN gene in P1 and"" KLF7 gene in P3 and P7 deviated from the Hardy-Weinberg genetic equilibrium，while they were in equilibrium in the other generations.The association analysis" between body mass and SNPs showed that chickens with AA genotype in MSTN had significantly higher body mass than those with AG and GG genotypes，the individuals with heterozygous SNP in"" KLF7 had higher body mass than those with homozygous genotype.The body mass trait increased significantly after generations of breeding （Plt;0.05）.The results suggest that both SNP loci can be used for body mass trait selection in breeding Lueyang black-bone chickens.

Key words" KASP technology;MSTN;" KLF7;Correlation analysis;Selection for body mass traits

Received ""2023-12-15""" Returned" 2024-01-02

Foundation item" 2023 Breeding of New Breeds of Livestock and Poultry-Lueyang Chicken"" （No.K3031223079）.

First author" CAI Yingjie，female，master" student.Research area：animal genetics，breeding and reproduction.E-mail：caiyingjie2022@nwafu.edu.cn

Corresponding"" author" ZHANG Jianqin，female，Ph.D，associate professor，doctoral supervisor.Research area：animal genetics，breeding and reproduction.E-mail：zhangjianqin0822@nwafu.edu.cn

（責任編輯：顧玉蘭" Responsible editor：GU Yulan）