農華麻鴨肝臟組織多胺代謝與增殖相關基因表達的研究

摘" 要" 旨在研究農華麻鴨肝臟組織多胺代謝與增殖相關基因表達的發育規律。選取0、30、60、90、120日齡的農華麻鴨各8只，采用高效液相色譜測定鴨肝臟組織中多胺含量，利用qRT-PCR分析鴨肝臟組織多胺代謝及增殖相關基因的相對表達量。結果表明，鴨肝臟生長發育過程中，亞精胺和精胺始終維持較高水平，精胺含量隨日齡增長先升后降，在60日齡達到峰值為1 377.43 mg/kg；腐胺和亞精胺在0日齡含量最高，分別為131.60 mg/kg和694.64 mg/kg，后繼隨日齡增長腐胺和亞精胺含量逐漸降低。多胺代謝和增殖相關基因表達及相關性分析表明，多胺代謝與增殖相關基因呈一定規律性表達，SSAT、SPMS、ODC、APAO、 GATA4、 CCND1、HGF和PCNA的相對表達量隨日齡增長先升后降。精胺與VEGF、HGF、PCNA、 GATA4基因表達量顯著相關；亞精胺與VEGF、CCND1、HGF顯著相關；腐胺與VEGF、HGF顯著相關。HGF和VEGF與SMOX、SPDS、ODC顯著相關；GATA4和CCND1與SSAT、SPMS、ODC顯著相關；PCNA與SSAT、SPMS、GATA4、 CCND1基因表達量顯著相關。多胺代謝相關基因可通過介導多胺合成和分解代謝途徑維持肝臟多胺池穩態，進而調控肝臟生長發育。

關鍵詞" 鴨；肝臟；多胺；相關性；基因表達

doi：10.7606/j.issn.1004-1389.2024.08.002

https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2024.08.002

收稿日期：2022-06-20" 修回日期：2022-10-06

基金項目：國家自然科學基金（31872358，32172727）。

第一作者：王" 鑫，男，碩士研究生，研究方向為動物遺傳育種與繁殖。E-mail：xinwang@stu. sicau.edu.cn

通信作者：康" 波，男，教授，博士生導師，研究方向為動物生理與環境生理。E-mail ：bokang@sicau.edu.cn

多胺是具有生物活性的低分子脂肪族含氮化合物，主要包括腐胺、亞精胺和精胺，廣泛分布于動植物體內［1-3］。多胺合成途徑起始于鳥氨酸，鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶（Ornithine decarboxylase，ODC）的作用下生成腐胺，ODC也是多胺合成代謝的第一個限速酶［4］。腐胺進一步由亞精胺合成酶（Spermidine synthase，SPDS）和精胺合成酶（Spermine synthase，SPMS）催化，依次生成亞精胺和精胺。多胺的分解代謝途徑主要由亞精胺/精胺乙酰轉移酶（N1-Spermidine/spermine acetyltransferase，SSAT）和乙酰多胺氧化酶（Acetylpolyamineoxidase，APAO）催化完成，精胺經SSAT作用轉化為N1乙酰亞精胺/精胺，然后經過APAO氧化降解為亞精胺，亞精胺可通過相似的方式轉化為腐胺。此外，精胺也可以在精胺氧化酶（Spermineoxidase，SMOX）的作用下不通過乙酰化中間產物直接被氧化為亞精胺［5-6］。表明生物體內存在一套完整的多胺調控機制，在多胺合成和分解代謝相關酶的調控下相互轉換，以維持體內多胺池穩態［7-8］。新近研究證實，多胺可通過參與細胞周期調控以及激活真核翻譯起始因子來啟動和加速細胞增殖，并且多胺還參與調控細胞凋亡、組織再生和器官發育等生物學過程［9-11］。

張軍等［12］運用GomPertz模型分析1～7周齡櫻桃谷鴨內臟器官生長發育規律，發現櫻桃谷鴨肝臟生長速度從第4周開始由慢變快，到6周齡達到頂峰。萬雨［13］對江南白鵝肝臟生長進行曲線擬合，發現江南白鵝肝臟生長速度在4～7周齡內快速增加，在42日齡達到生長拐點，提示鴨肝臟生長速度可能在30～60日齡內快速增加，在42日齡達到拐點。肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）、細胞增殖核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、鋅指轉錄因子（GATA binging protein 4，GATA4）、細胞周期蛋白（Cyclin D1，CCND1）和血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）等調節因子與肝臟增殖密切相關［14-15］。HGF是一種促肝生長因子，能誘導肝細胞DNA合成和有絲分裂，啟動肝臟增殖。GATA4屬于GATA家族，該家族廣泛存在于真核生物中，是DNA聚合酶δ的輔助因子，在G1晚期開始表達，S期表達量最高，GATA4主要表達在肝臟，可通過反式激活Hhex啟動子等參與調控肝臟發育［16-17］。VEGF是一種多潛能細胞因子，具有促進血管內皮增生、促進肝竇內皮細胞增生和抑制其凋亡的作用，在肝臟部分切除后能促進肝臟增生［15，18］。CCND1是細胞周期主要的正態調控因子之一，可以調節細胞G1期啟動進入S期，因此，CCND1的高表達會引起細胞增殖加快［15］。此外，CCND1在肝臟再生過程中能激活相關的細胞分裂基因，進而促進肝臟增殖。由于多胺在肝臟快速增殖中含量發生顯著變化，但關于鴨肝臟生長發育過程中，多胺含量和代謝基因與肝臟增殖相關基因的關系尚不清楚。

因此，本研究檢測不同日齡農華麻鴨肝臟組織多胺含量、多胺代謝和增殖相關基因表達量，探究鴨肝臟多胺代謝與增殖相關基因表達的規律及相關關系，以期為多胺調控鴨肝臟發育的相關研究提供理論數據。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

隨機選取相同環境下飼養（四川農業大學家禽育種場）的無血源關系的0、30、60、90和120日齡農華麻鴨各6只（雌雄各半），頸部放血處死，迅速采集肝臟組織，液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.2" 組織總RNA提取及反轉錄

使用Trizol（TaKaRa，大連）法提取鴨肝臟總RNA，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量。參照TaKaRa反轉錄試劑盒（TaKaRa，大連）操作說明，將肝臟總RNA反轉錄為cDNA。

1.3" 高效液相色譜檢測肝臟組織多胺含量

取80 mg鴨肝臟組織浸泡于0.5 mL的5%高氯酸，加入10 μL的1，6-己二胺研磨充分，取上清；上清液中加入適量2.5" mol/L" NaOH和10 μL的苯甲酰氯，漩渦振蕩均勻，置于40 ℃水浴鍋衍生1 h。隨后用6" mol/L" HCl將pH調至中性（pH=7.0）；分別用15 mL超純水和15 mL 15%甲醇活化C18固相萃取柱，再用萃取柱過濾衍生液，接著用0.5 mL甲醇洗脫樣品；0.22 μm針頭過濾器過濾洗脫液后4 ℃避光保存。流速為0.5 mL/min，紫外檢測器檢測波長229 nm，柱溫" 25 ℃，流動相組成為水∶甲醇=38∶62（V∶V）作為高效液相色譜檢測條件。

1.4" qRT-PCR檢測多胺代謝及增殖相關基因表達量

參考GenBank目的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設計ODC、SPDS、SPMS、SSAT、APAO、SMOX、HGF、VEGF、PCNA、 GATA4和CCND1基因引物（表1），并委托擎科生物科技有限公司合成。利用qRT-PCR分析不同日齡鴨肝臟組織中多胺代謝及增殖相關基因相對表達量，每個樣品設3個重復。PCR反應體系（10 μL）為：SYBR Green 5.0 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 0.5 μL，去RNase水4.1 μL。" q-PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，39個循環。

1.5" 統計分析

利用Excel 2021計算不同日齡鴨肝臟組織中目的基因的相對表達量，運用SPSS 26.0統計軟件ANOVA 過程進行方差分析，并用Duncan氏方法進行多重比較，數值以“平均值±標準差”表示，Plt;0.05 表示差異顯著。用Origin軟件對基因表達量進行相關性分析和繪圖。

2" 結果與分析

2.1" 不同日齡鴨的肝臟組織多胺含量

農華麻鴨肝臟組織的腐胺和亞精胺含量隨著日齡的增長呈逐漸下降趨勢（圖1），0日齡腐胺和亞精胺含量達到最大值，分別為131.60 mg/kg和694.64 mg/kg；120日齡腐胺和亞精胺含量達到最低值，分別為24.59 mg/kg和154.11"" mg/kg；精胺含量隨著日齡增長呈先上升后下降的趨勢，60日齡達到最大值為1 377.43 mg/kg。

2.2" 不同日齡鴨肝臟組織多胺代謝相關基因表達的變化規律

鴨肝臟組織中多胺代謝相關基因在不同時間段的表達規律不同（圖2），SSAT、SPMS、ODC和APAO的相對表達量隨著日齡的增長整體呈先上升后降的趨勢。SMOX和SPDS的相對表達量均在0日齡最高，隨后基因表達量開始下降，120日齡又顯著上升。

2.3" 不同日齡鴨肝臟增殖相關基因表達量的變化規律

鴨肝臟增殖相關基因在鴨肝臟生長發育不同時期存在差異表達（圖3）。 GATA4、 CCND1、HGF和PCNA的mRNA表達量隨日齡增長呈先上升后下降的趨勢，均在60日齡表達量最高。VEGF的相對表達量在0日齡最高，隨著日齡增長基因表達量開始下降，120日齡有顯著上升。

2.4" 不同日齡鴨肝臟多胺代謝與增殖基因表達的相關性分析

圖4是農華麻鴨肝臟增殖相關基因與多胺代謝相關基因的相關關系。肝臟增殖基因VEGF與SMOX、SPDS、ODC呈極顯著正相關。 CCND1與SSAT、ODC、SPMS呈顯著正相關。HGF與SMOX、SPDS、ODC、VEGF呈極顯著正相關。 GATA4與 CCND1、SSAT、SPMS呈顯著正相關。PCNA與SSAT、SPMS、 GATA4、 CCND1呈極顯著正相關。

2.5" 不同日齡鴨肝臟組織多胺含量與增殖基因的相關性分析

圖5是農華麻鴨肝臟增殖相關基因與多胺含量的相關關系。精胺與VEGF和HGF基因表達量呈極顯著負相關；精胺與PCNA和 GATA4呈極顯著正相關（Plt;0.01）。亞精胺與VEGF、 CCND1和HGF基因表達量呈顯著正相關。腐胺與VEGF和HGF呈極顯著正相關。

3" 討 論

3.1" 鴨肝臟多胺含量變化的規律

動物機體的多胺可分為內源性多胺和外源性多胺，內源性多胺主要由細胞自主合成。細胞內多胺水平主要取決于多胺合成途徑與分解代謝途徑的相互作用，并受到多胺轉運蛋白的調控。多胺的匱乏會使細胞大量停滯在G1期［19］，而超生理劑量的多胺會使小鼠卵巢顆粒細胞發生氧化應激［20］。表明，多胺含量的穩定對維持機體正常生命活動至關重要。研究表明，多胺可通過調控細胞增殖周期和增殖相關基因的表達促進器官的生長發育。外源性多胺能顯著改善肝臟部分切除大鼠的缺血再灌注損傷，促進肝臟組織再生［21-22］；腐胺可消除α生育酚對肝臟切除大鼠的不良作用，抑制α生育酚誘導的類視黃醇水平降低，進而恢復肝臟增殖潛力［23］。綜上所述，多胺可作為肝臟損傷的保護因子，促進肝細胞增殖，在肝臟再生過程中發揮重要作用。Alhonen等［24］研究發現S期細胞數量與亞精胺濃度之間顯著相關，并且肝臟再生需要亞精胺和精胺達到臨界濃度。Nishimura等［25］測定3、10和26周齡雌性大鼠肝臟多胺水平，發現10周齡大鼠肝臟亞精胺含量較3周齡下降了50%以上，而腐胺和精胺的變化不顯著，并且肝臟組織中腐胺含量顯著低于精胺和亞精胺。Furukawa等［26］研究發現，3周齡的雞肝臟組織中腐胺無明顯變化，亞精胺含量顯著下降，精胺含量明顯上升。本研究發現，在農華麻鴨肝臟快速生長發育階段，精胺含量顯著上升，亞精胺含量顯著下降，但精胺和亞精胺濃度維持較高的范圍，與Alhonen等［24］和Nishimura等［25］研究結果一致。但是本研究中發現隨著日齡的增長精胺含量顯著上升，與Nishimura等［25］研究結果不相同，推測是不同物種在合成和分解多胺過程中存在物種差異。Krausova等［27］檢測了38只雞肝臟中多胺含量，發現僅有13%的雞肝臟中腐胺水平高于檢測限（2.1 mg/kg），亞精胺與精胺含量顯著相關，并且肝臟中多胺含量差異極大。這與本研究的結果相同，提示在鴨生長發育過程中，肝臟組織中亞精胺含量會隨年齡增長逐漸降低，腐胺含量顯著低于亞精胺與精胺含量，并且精胺與亞精胺含量具有顯著相關關系。綜上，在農華麻鴨肝臟組織生長過程中，機體會通過多胺的相互轉化維持多胺池穩態，進而促進肝臟組織的生長發育。

3.2" 鴨肝臟多胺代謝基因表達量的規律

多胺合成和分解代謝相關基因可以調控機體內腐胺、亞精胺和精胺的相互轉化，維持機體多胺池穩定。Niu等［28］發現，過表達ODC會使鵝顆粒細胞中腐胺含量顯著上升，亞精胺和精胺含量無顯著變化，并且多胺代謝相關基因SPDS、SSAT和SMOX含量顯著上調，SPMS無顯著變化。外源性精胺灌胃可通過介導多胺代謝關鍵基因ODC、SPDS、SPMS和SSAT基因表達影響雌鵝十二指腸組織中亞精胺和精胺含量，而對腐胺含量無顯著影響［29］。此外，本研究發現在農華麻鴨胸肌、腿肌、大腦和小腦等不同組織部位，多胺代謝基因的表達趨勢并不相同，這可能是基因在不同組織的表達特異性導致的。在多胺分解代謝途徑中，亞精胺可通過SSAT轉化為精胺，精胺在APAO催化下轉化為腐胺。SSAT在30日齡表達量最高，且與60日齡差異不顯著，SMOX和APAO在30日齡和60日齡變化不顯著，并且在30、60日齡內精胺含量顯著上升且高于其他日齡。表明在肝臟快速增殖時期，SSAT基因表達量上調，致使肝臟中多胺含量上升，進而調控肝臟生長發育。在多胺合成途徑中，腐胺可通過SPDS作用轉化為亞精胺，亞精胺進一步在SPMS的作用下轉化為精胺。SPDS在30日齡和60日齡表達量差異不顯著，SPMS的表達量顯著上調，表明在肝臟快速生長發育時期，SPMS基因表達量上調，致使肝臟中多胺含量上升，進而調控肝臟生長發育。綜上所述，多胺代謝基因通過維持肝臟多胺動態平衡以調控肝臟生長發育。

3.3" 鴨肝臟多胺含量和代謝基因與肝臟增殖基因的相關性分析

肝臟發育基因在肝臟增殖中起重要調控作用。HGF、VEGF、 GATA4、 GATA4與 CCND1是常見的肝臟增殖評價指標。Massimino等［14］通過胚胎發育第12天到孵化后第4天的基因表達分析，發現參與肝臟發育的基因HGF、GATA和 PROX1表達峰值主要出現在胚胎第12天和胚胎第20天之間。Schorr等［30］發現鴨肝細胞可以在加入HGF的培養基中穩定增殖，并且這種增殖可以被HGF精確調控。此外，在肝臟部分切除的大鼠中，剩余肝臟的HGF水平會迅速升高［31］，進而促進肝臟再生。細胞周期蛋白是調節細胞周期活動的重要蛋白質，它對整個正常細胞周期的維持起決定性作用，促進 CCND1的表達能促進細胞增殖，修復損傷組織。 GATA4/5/6亞家族主要表達在肝臟和心臟等中胚層和內胚層來源的器官［17］，研究發現，農華麻鴨 GATA4與出生后的肝臟和心臟發育關系更為密切，而且 GATA4在鴨肝臟的表達量隨著年齡的增加而逐漸升高［32］。VEGF通過增加微血管通透性、促進內皮細胞生長和促進內皮細胞通過細胞外基質遷移在傷口愈合中起關鍵作用。在肝臟切除的大鼠中，用轉染VEGF的間充質干細胞治療可以通過誘導祖細胞直接分化為肝細胞［33］。本研究發現精胺與VEGF、HGF、 GATA4基因表達量顯著相關，亞精胺與VEGF、 CCND1和HGF基因表達量顯著相關，腐胺與VEGF和HGF基因表達量顯著相關，表明多胺含量可以調控肝臟增殖基因的表達。并且肝臟增殖基因與多胺代謝基因也密切相關。HGF和VEGF與SMOX、SPDS和ODC基因表達量顯著相關，PCNA和" GATA4與 CCND1、SSAT和SPMS基因表達量顯著相關； CCND1與SSAT、ODC和SPMS基因表達量顯著相關。表明多胺代謝相關基因可通過調控機體多胺轉化維持肝臟多胺池維態，進而調控肝臟生長發育。此外，肝臟增殖基因之間顯著相關，表明肝臟增殖基因之間存在協同作用，共同調控肝臟生長發育。綜上所述，肝臟中多胺代謝基因可通過介導多胺代謝途徑維持多胺池穩定，進而調控肝臟生長發育。并且肝臟增殖相關基因之間還存在協同作用，共同促進肝臟生長發育。

4" 結" 論

農華麻鴨肝臟組織中腐胺和亞精胺含量隨日齡增長逐漸降低，精胺含量在60日齡達到最高。多胺代謝和肝臟增殖相關基因呈一定規律性變化，并且多胺含量和多胺代謝基因與增殖基因之間具有顯著相關關系，表明多胺代謝相關基因可通過介導多胺代謝途徑維持多胺池穩態，進而調控肝臟生長發育。

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WANG Xin，WANG" Zhiting，WANG" Zelong，GUO" Yongni，SUN Qin and KAGN Bo

（College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Chengdu" 611130，China）

Abstract" The purpose of this experiment is to study the developmental regularity of polyamine metabolism and proliferation related gene expression in the liver of Nonghua duck. Eight Nonghua ducks aged 0，30，60，90 and 120 days were selected to determine the content of polyamines in duck liver by HPLC，and the relative expression of polyamine metabolism and proliferation related genes in duck liver were analyzed by qRT PCR. The results showed that during the growth and development of duck liver，spermidine and spermine remained at a high level all the time，and the spermine content increased first and then decreased with the increase of age，reaching a peak of 1" 377.43 mg/kg at 60 days of age; The contents of putrescine and spermidine were the highest at 0 day-old，which were 131.60 mg/kg and 694.64 mg/kg，respectively. Later，the contents of putrescine and spermidine decreased gradually with the increase of day age. The expression and correlation analysis of polyamine metabolism and proliferation related genes showed that polyamine metabolism and proliferation related genes were regularly expressed. The relative expression of SSAT，SPMS，ODC，APAO， GATA4， CCND1，HGF and PCNA increased first and then decreased with increase of days of age.Spermine was significantly correlated with the expression of VEGF，HGF，PCNA and" GATA4; spermidine was significantly correlated with" the expression of VEGF， CCND1 and HGF;" putrescine was significantly correlated with" the expression of VEGF and HGF.HGF and VEGF were significantly correlated with" the expression of" SMOX，SPDS and ODC;" GATA4 and" CCND1 were significantly correlated with" the expression of" SSAT，SPMS and ODC; PCNA was significantly correlated with" the expression of" SSAT，SPMS， GATA4 and" CCND1. The polyamine metabolism related genes can maintain the homeostasis of liver polyamine pool by mediating polyamine synthesis and catabolism，and then regulate liver growth and development. This study provideda theoretical reference for the study on the mechanism of polyamines regulating the growth and development of duck liver.

Key words" Duck; Liver; Polyamines; Correlation; Gene expression

Received ""2022-06-20""" Returned" 2022-10-06

Foundation item" The National Natural Science Foundation of China（No.31872358，No.32172727）.

First author" WANG Xin，male，master student. Research area： animal genetics，breeding and reproduction. E-mail：xinwang@stu. sicau.edu.cn

Corresponding"" author" KAGN Bo，male，professor，doctoral supervisor. Research area： animal physiology and environmental physiology. E-mail：bokang@sicau.edu.cn

（責任編輯：顧玉蘭" Responsible editor：GU Yulan）