馬鈴薯 StCYP83B1基因過表達載體構建及遺傳轉化

摘" 要" 旨在為解析馬鈴薯" StCYP83B1基因的免疫功能提供重要材料基礎，從四倍體馬鈴薯栽培種‘大西洋’的cDNA中克隆到" StCYP83B1基因，將其與融合mCherry標簽的35S：：pART27重組載體連接，構建p35S：：StCYP83B1-mCherry植物過表達載體，并通過農桿菌介導的本氏煙瞬時表達體系確認該蛋白的表達；利用農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化方法，將p35S：：StCYP83B1-mCherry轉入馬鈴薯中，隨機挑選3株轉基因植株進行鑒定：PCR檢測證明 StCYP83B1已整合到馬鈴薯基因組中，反轉錄實時定量PCR檢測表明 StCYP83B1在轉化植株中的轉錄水平比未轉化的對照植株上調40～49倍，免疫印跡檢測表明StCYP83B1蛋白可以在轉化植株中正常表達。同時，對轉化馬鈴薯植株及微型薯的表型鑒定表明， StCYP83B1過量表達并不影響馬鈴薯的正常生長發育。該穩定轉化馬鈴薯植株的獲得為后續深入解析" StCYP83B1基因的免疫功能及作用機制奠定了重要材料基礎。

關鍵詞" 馬鈴薯；" StCYP83B1；表達載體；遺傳轉化

doi：10.7606/j.issn.1004-1389.2024.08.007

https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2024.08.007

收稿日期：2023-04-28" 修回日期：2023-05-25

基金項目：國家自然科學基金（31872657）；國家重點研發計劃（2017YFD0200602-2）；國家現代農業產業技術體系（CARS-09）；高校科研業務科技創新專項（2452020146）。

第一作者：孔樂輝，女，碩士研究生，從事植物與卵菌互作機理研究。E-mail：542909995@qq.com

通信作者：強曉玉，女，副教授，主要從事植物抗病性及植物與微生物互作的機理研究。E-mail：qiangxiaoyu@nwafu.edu.cn

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是1 a生草本植物，塊莖可供食用，其耐寒、耐旱、耐貧瘠，具有極強的適應性［1］。2015年，中國啟動馬鈴薯主糧化的國家戰略部署，馬鈴薯已經成為了中國第四大糧食作物，僅次于水稻、玉米、和小麥［2］。目前世界上有2/3的人將馬鈴薯作為主食，其在實現全球無饑餓、可持續發展中發揮了重要作用［3］。馬鈴薯栽培種‘大西洋’是美國從B5141-6ⅹWauseon雜交后代中選育出來的新品種［4］，于1978年引入中國，是中國主要的油炸專用型品種之一。該品種薯形圓，薯皮光滑、長勢均勻，芽眼淺且少，有利于生產加工；它的還原糖含量低，干物質和淀粉含量高，儲藏性好，適用于炸薯片和炸薯條。‘大西洋’品種的適應性較強，在全國范圍內種植面積較廣，中國黑龍江墾區該品種年均種植面積在667" hm2以上［5］。由致病疫霉（Phytophthora infestans）引發的晚疫病是馬鈴薯生產中的第一大病害，而品質優良的‘大西洋’品種對晚疫病高感，這嚴重制約了馬鈴薯加工產業的發展。由于栽培馬鈴薯四倍體遺傳的復雜性，馬鈴薯的遺傳改良進程緩慢，利用傳統的雜交育種技術很難在短時間內育成優良品種［6］。隨著分子生物學研究的不斷發展，科學家們嘗試利用農桿菌介導的基因轉化技術對馬鈴薯品種進行遺傳改良，以加速馬鈴薯定向育種進程。

硫代葡萄糖苷（又稱芥子油苷，glucosinolate，GS）是一類氨基酸衍生的次生代謝產物，當病原菌入侵植物時，GS被植物體內的黑芥子酶水解產生一系列有活性的化合物，可減少病原菌侵染后造成的傷害甚至直接殺死病原體，從而在植物防御反應中發揮重要作用［7-8］。 CYP83B1基因屬于細胞色素P450基因超家族中的 CYP83家族，其編碼的蛋白在GS生物合成中具有重要作用［9］。擬南芥AtCYP83B1酶催化擬南芥GS生物合成途徑中的吲哚3-乙醛肟轉化為吲哚-3-乙酰氧肟，在 cyp83b1突變體中由于AtCYP83B1酶的缺失，表現出低GS水平。Tuo等［10］通過病毒誘導的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）技術對番木瓜 CpCYP83B1基因功能鑒定，發現沉默 CpCYP83B1導致番木瓜葉片中的芐基硫代葡萄糖苷（Benzylglucosinolate，BGLS）含量明顯下降，初步證明 CpCYP83B1是番木瓜體內合成BGLS的關鍵基因。Gonzlez-Romero等［11］將擬南芥BGLS合成途徑中的6個基因（ SUR1、 UGT74B1、 SOT16、 CYP79A2、 CYP83B1和 GGP1）穩定轉化至馬鈴薯中，獲得了合成BGLS的轉基因馬鈴薯，并且發現轉基因馬鈴薯產生的BGLS對致病疫霉具有抑制作用。目前， CYP83B1基因在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［9］、油菜（Brassica napus）［12］、菘藍（Isatis indigotica Fort.）［13］等多種十字花科植物中的功能均有報道，但有關馬鈴薯 CYP83B1基因的功能機制研究鮮有報道。本研究通過克隆馬鈴薯" StCYP83B1基因，構建由CaMV35S啟動子驅動的" StCYP83B1植物過表達載體，利用農桿菌介導的遺傳轉化法轉化馬鈴薯栽培種‘大西洋’；對獲得的 StCYP83B1-OE轉化植株分別進行目的基因DNA插入水平、轉錄水平和蛋白翻譯水平鑒定，確認了 StCYP83B1-OE穩定轉化馬鈴薯植株的成功構建。這為深入解析 StCYP83B1的免疫功能及作用機制奠定了重要材料基礎。

1" 材料與方法

1.1" 材" 料

1.1.1" 植物材料" 馬鈴薯：四倍體馬鈴薯栽培種‘大西洋’，由西北農林科技大學單衛星實驗室保存；煙草：本氏煙（Nicotiana benthamiana），由西北農林科技大學單衛星實驗室保存。

培養條件：23 ℃，16 h光照/8 h黑暗培養。

1.1.2" 菌株材料" 細菌菌株：大腸桿菌菌株DH5α，農桿菌菌株GV3101，由西北農林科技大學單衛星實驗室保存。

1.1.3" 質粒載體" 植物過表達載體：融合mCherry標簽的35S：：pART27，由西北農林科技大學單衛星實驗室保存。

1.2" 方法

1.2.1""" StCYP83B1基因克隆和過表達載體構建" 根據National Center for Biotechnology Information（NCBI）公布的 StCYP83B1 （XM_006358748.2）序列信息，利用Primer 5.0設計同源臂引物，F：5′-TTTGGAGAGGACACGCT-CGAGATGATGCTCTTTCTACTCTTTGTA-GCCCTTC-3′，R：5′-ATCCTTATAATCCAT-GATTCAAAATAACTTTTAGGGATAAGCC-AAAGGTCATTTTTC-3′。以‘大西洋’cDNA為模板，擴增目的序列，將擴增好的目的序列與酶切好的過表達載體用同源重組酶連接并將重組質粒進行轉化至大腸桿菌感受態，測序成功后即可得到植物過表達載體p35S：：StCYP83B1-mCherry。

1.2.2" 農桿菌介導的煙草瞬時表達" 將p35S：：StCYP83B1-mCherry載體通過電擊法轉化至農桿菌GV3101。取200 μL過表達載體的農桿菌菌液，加入含有利福平（Rifampicin）、慶大霉素（Gentamycin）、壯觀霉素（Spectinomycin）的LB液體培養基，置于28 ℃搖床，轉速為200 r/min，至菌液OD600gt;1.0。室溫下離心5 min（轉速為" 3 500 g）收集菌體，并重懸于含有200 μmol/L 乙酰丁香酮的MES，稀釋至OD600=0.5備用。利用1 mL一次性注射器將菌液注射于煙草葉片，并做以標記；吸去葉片表面多余的重懸菌液，并保濕避光；次日，移至正常光照條件，2～3 d后收取注射區煙草葉片用于蛋白提取。

1.2.3" 免疫印跡（Western blotting）" 用Hepes緩沖液提取蛋白樣品［14］，參照Fan等［15］的方法進行免疫印跡檢測StCYP83B1蛋白表達情況。

1.2.4" 農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化" 參照孔祥嵐［16］的方法，遺傳轉化所用培養基配方和培養條件如表1所示，并做出相應的改良。在此遺傳轉化體系中，莖段外植體的大小調整為8～10 mm，以確保愈傷組織的形成以及減少農桿菌侵染對外植體帶來的傷害；預培養時間延長為2 d，使受體細胞處于易整合外源基因的感受態；農桿菌的侵染條件調整為OD600=0.4，侵染5 min，農桿菌濃度過高易出現污染現象，過低則轉化效率低。農桿菌侵染時間過長，則因浸泡缺氧而軟腐，導致莖段喪失形成愈傷組織的能力，侵染時間過短又會影響目的基因的轉化率；此外，使用融合有mCherry標簽的過表達載體（p35S：：StCYP83B1-mCherry），易于轉基因植株的鑒定。

1.2.5" 轉基因植株PCR檢測" 用植物基因組DNA提取試劑盒提取轉基因馬鈴薯的基因組DNA。取1 μL DNA作為模板進行PCR檢測，PCR反應程序為：95" ℃預變性8 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環35次。擴增產物使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.2.6" 轉基因植株qRT-PCR檢測" 根據馬鈴薯" StCYP83B1基因序列設計特異引物（F：5′-CGATGAAGCACATGAAAGGA-3′; R：5′-TT-TGGCCTATTGGGATTTTG-3′），以 StEF1α作為內參基因（F：5′-ATTGGAAACGGATATGCTCCA-3′; R：5′-TCCTTACCTGAACGCCTGTCA-3′）。使用Trizol（Invitrogen）法提取馬鈴薯葉片的RNA［17］，使用TaKara 公司反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM" RT reagent Kit，RR047A）合成cDNA后進行qRT-PCR反應。反應條件：95" ℃預變性10 min，95" ℃變性10 s，55" ℃退火30 s， 72" ℃延伸30 s，45個循環，使用2-ΔΔCT計算基因相對表達量［14］。

2" 結果與分析

2.1" p35S：：StCYP83B1-mCherry植物過表達載體的構建

以‘大西洋’總RNA反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，得到大小為1 500 bp左右的目的序列（圖1-a）；將擴增好的目的序列與酶切好的融合mCherry標簽的載體質粒（35s：：pART27）用同源重組酶連接，將連接好的重組質粒轉化至大腸桿菌感受態DH5α細胞中，挑取陽性克隆進行菌落PCR檢測，得到1 500 bp左右的條帶（圖1-b）。提取質粒后送至北京擎科生物公司測序，將測序正確的重組質粒命名為p35S：：StCYP83B1-mCherry（圖1-c）。將其轉入農桿菌感受態GV3101中，同時借助農桿菌介導的煙草瞬時表達體系，在本氏煙草葉片上瞬時表達p35S：：StCYP83B1-mCherry，并于表達2 d后，利用Western blotting確認該蛋白的表達（圖1-d）。

2.2" 馬鈴薯遺傳轉化和植株再生

利用農桿菌介導的方法進行馬鈴薯遺傳轉化，整個遺傳試驗經過馬鈴薯組培苗培養、切取莖段、制備農桿菌菌液、農桿菌侵染和共培養（圖2-a）、分化培養（圖2-b和2-c）和生根培養（圖2-d和2-e），最終得到轉化植株（圖2-f）。

2.3""" StCYP83B1-OE穩定轉化馬鈴薯植株的" 鑒定

2.3.1""" StCYP83B1-OE轉化馬鈴薯植株中目的基因插入水平檢測" 任意挑選3株" StCYP83B1-OE轉化株系（Line1、Line2、Line3），提取其基因組DNA，利用pKAN-F和StCYP83B1-R引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，陽性對照（質粒p35S：：StCYP83B1-mCherry）和3株轉化植株均擴增出1 500 bp左右的目標條帶；而陰性對照（‘大西洋’）沒有擴增出目的條帶（圖3）。從而初步證明了" StCYP83B1基因已整合到馬鈴薯的基因組中。

2.3.2""" StCYP83B1-OE轉化馬鈴薯植株中目的基因轉錄及蛋白翻譯水平的檢測" 以馬鈴薯" StEF1α基因作為內參基因，利用qRT-PCR技術對" StCYP83B1-OE轉化株系（Line1、Line2、Line3）中的" StCYP83B1基因轉錄水平進行分析。結果顯示：與‘大西洋’相比，"" StCYP83B1基因在" StCYP83B1-OE轉化株系中的轉錄水平均顯著上升，在Line1、Line2、Line3株系中分別上調48、49、40倍（圖4-a）。

分別提取‘大西洋’與" StCYP83B1-OE轉化株系（Line1、Line2、Line3）葉片中的總蛋白，利用anti-mCherry抗體進行Western blotting檢測。結果顯示，與‘大西洋’相比，StCYP83B1-mCherry蛋白在Line1、Line2、Line3中均可正常表達（圖4-b）。從而在轉錄水平和蛋白翻譯水平上均確認了" StCYP83B1-OE穩定轉化馬鈴薯植株的成功獲得。

2.3.3""" StCYP83B1-OE轉化馬鈴薯植株及微型薯的表型鑒定" 通過對" StCYP83B1-OE轉化株系（Line1、Line2、Line3）及其微型薯的生長表型進行觀察，發現與‘大西洋’相比，3株轉化株系的株高、葉面積以及微型薯的表型均無顯著差異（圖5-a和5-b）。由此表明， StCYP83B1過量表達并不會影響馬鈴薯的正常生長發育。

3" 討" 論

轉基因技術在植物科學研究中發揮著重要作用，為基因結構和功能的研究提供了技術保障。一般對于基因功能的研究策略采用功能失活和功能獲得，其中功能獲得常使用的方法是基因過表達技術［18］。基因過表達主要通過過表達載體的構建以及利用轉基因技術使目的基因在轉化植株中過量表達來實現［19］。由于本研究所選擇的候選基因" StCYP83B1可能具有正調控植物抗病性的潛在功能，因此，選用過表達載體使其在晚疫病易感品種‘大西洋’中過量表達則更有利于目標基因的免疫功能分析及新種質創制。

植物外植體經過農桿菌侵染后，大部分受體植株是沒有轉化的，只有少數被轉化［20］，因此轉化植株的鑒定方法對于轉基因植株的獲得非常重要。目前，應用于轉基因植株的鑒定方法可分為利用標記基因進行鑒定、分子檢測和免疫印跡技術三大類［20］。標記基因包括選擇標記基因和報告基因。通常用于鑒定轉化植物的選擇性標記基因是編碼抗生素或除草劑抗性的基因［21］。賦予細胞抗卡那霉素的新霉素磷酸轉移酶II（nptII）基因是馬鈴薯轉化中最常用的標記基因［22］。一些報告基因如β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、熒光素酶基因（LUC）、綠色熒光蛋白基因（GFP）也被用于篩選轉化植株［23］。本研究所使用的過表達載體具有在CaMV35S啟動控制下的紅色熒光蛋白基因（mCherry）和卡那霉素抗性基因，mCherry在587 nm的激發光下會激發出紅色熒光［24］。因此，在轉化植株的鑒定過程中，可通過卡那霉素或在熒光顯微鏡下觀察初篩轉化植株。為了進一步確定目的基因是否轉入受體植株中，還需進行分子檢測。常用的分子檢測法是聚合酶鏈式反應（polymerase chain Reaction），即 PCR檢測。本研究中，利用PCR檢測法對轉化植株從DNA插入水平進行了鑒定，發現與非轉基因馬鈴薯相比，轉化植株擴增出1 500 bp的目的條帶（圖3），初步證明了" StCYP83B1基因已整合到馬鈴薯的基因組中。外源目的基因經過PCR檢測已確定被整合到受體基因組上，但外源基因內部或啟動子序列的DNA甲基化以及雙鏈RNA引發的甲基化都可影響外源基因的表達，導致外源基因出現轉錄水平基因沉默現象［25-26］。因此，需要從轉錄水平對轉化植株進行鑒定，本研究中" StCYP83B1在轉化植株中的轉錄水平比未轉化的對照植株上調40～49倍（圖4-a），表明" StCYP83B1基因可以在轉化植株體內正常轉錄。mRNA的翻譯水平也會受到多種因素的影響而抑制目的蛋白的表達，這就需要從蛋白水平對轉化植株進行鑒定。本研究中使用mCherry抗體在轉化植株中檢測到明顯的目的蛋白（圖4-b），表明" StCYP83B1在轉化植株體內可以正常表達（圖4-b），從而成功獲得" StCYP83B1-OE轉化植株。

綜上，本研究利用農桿菌介導的遺傳轉化體系，成功制備了" StCYP83B1-OE穩定轉化馬鈴薯植株，為后續解析" StCYP83B1基因的功能機制提供了重要的材料基礎。

參考文獻" Reference：

［1］" 張" 鵬.我國薯類基礎研究的動態與展望［J］.生物技術通報，2015，31（4）：65-71.

ZHANG P.Trends and prospect of basic research on root and tuber crops in China［J］.Biotechnology Bulletin，2015，31（4）：65-71.

［2］" 肖金鐘.馬鈴薯生產中的常見病害［J］.現代園藝，2020， 43（18）：37-40.

XIAO J ZH.Common diseases in potato production［J］.Contemporary Horticulture，2020，43（18）：37-40.

［3］" 姜" 偉，刁培松，張" 華.中國馬鈴薯生產及機械化收獲現狀［J］.農業裝備與車輛工程，2021，59（4）：18-22.

JIANG W，DIAO" P S，ZHANG H.Current situation of" potato" production and" mechanized" harvest in China［J］.Agricultural Equipment amp; Vehicle Engineering，2021，59（4）：18-22.

［4］" WEBB R E，WILSON D R，SHUMAKER J R，et al.Atlantic：A new potato variety with high solids，good processing quality，and resistance to pests［J］.American Potato Journal，1978，55（3）：141-145.

［5］" 徐" 寧，張洪亮，張榮華，等.不同施肥處理對馬鈴薯品種大西洋產量及干物質含量的影響［J］.黑龍江農業科學，2019，301（7）：66-68.

XU N，ZHANG H L，ZHANG R H，et al.Effects of different fertilization treatments on Atlantic yield and dry matter content of potato varieties ［J］.Heilongjiang Agricultural Science，2019，301（7）：66-68.

［6］" CHAKRAVARTY B，WANG-PRUSKI G，FLINN B，et al.Genetic transformation in potato：approaches and strategies［J］.American Journal of Potato Research，2007，84（4）：301-311.

［7］" PIETERSE C M，VAN WEES S C，VAN PELT J A，et al.A novel signaling pathway controlling induced systemic resistance in" Arabidopsis［J］.Canadian Metallurgical Quarterly，1998，10（9）：1571-1580.

［8］" WITTSTOCK U，HALKIER B A.Glucosinolate research in the Arabidopsis era［J］.Trends in Plant Science，2002， 7（6）：263-270.

［9］" BAK S，TAX F E，FELDMANN K A，et al.CYP83B1，a cytochrome P450 at the metabolic branch point in auxin and indole glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis［J］.Plant Cell，2001，13（1）：101-111.

［10］" TUO D C，YAN P，ZHAO G Y，et al.An efficient papaya leaf distortion mosaic potyvirus vector for virus-induced gene silencing in papaya［J］.Horticulture Research，2021，8（1）：144.

［11］" GONZLEZ-ROMERO M E，RIVERA C，CANCINO K，" et al.Bioengineering potato plants to produce benzylglucosinolate for improved broad-spectrum pest and disease resistance［J］.Transgenic Research，2021，30（5）：649-660.

［12］" 程文財，丁聰聰，趙" 云，等.油菜BnCYP83B1基因的克隆與生長素相互作用的研究［J］.四川大學學報（自然科學版），2014，51（5）：1092-1098.

CHEN W C，DING C C，ZHAO Y，et al.Cloning and mRNA expression of BnCYP83B1 gene under 2，4-D hormone in" Brassica napus［J］.Journal of Sichuan University，2014，51（5）：1092-1098.

［13］" 趙桂紅，石" 宏，張妮妮，等.菘藍" CYP83B1基因的克隆與表達分析［J］.植物科學學報，2017，35（1）：64-72.

ZHAO G H，SHI H，ZHANG N N，et al.Cloning and expression analysis of"" CYP83B1 gene from Isatis indigotica Fort［J］.Plant Science Journal，2017，35（1）：64-72.

［14］" 高賢賢，孔樂輝，史青堯，等.馬鈴薯"" StBI-1基因鑒定及其抗疫霉菌的功能探索［J］.西北農業學報，2022，31（10）：1329-1336.

GAO X X，KONG L H，SHI Q Y，et al.Identification of Solanum tuberosum"" StBI-1" gene and exploration of its function in resistance to Phytophthora［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2022，31（10）：1329-1336.

［15］" FAN G J，YANG Y，LI T T，et al.A" phytophthora capsici RXLR effector targets and" inhibits a" plant" pIase to suppress endoplasmic reticulum-mediated" immunity［J］.Molecular Plant，2018，11（8）：1067-1083.

［16］" 孔祥嵐.馬鈴薯遺傳轉化及免疫相關基因" StCAD7 基因編輯載體的構建［D］.陜西楊凌：西北農林科技大學，2021.

KONG X L.Establishment of potato genetic transformation system and the construction of gene editing vector of immune-related gene"" StCAD7 ［D］.Yangling Shaanxi：Northwest Aamp;F University，2021.

［17］" SHAN W X，HARDHAM A R.Construction of a bacterial artificial chromosome library，determination of genome size，and characterization of an"" Hsp70" gene family in Phytophthora nicotianae［J］.Fungal Genetics and Biology，2004，41（3）：369-380.

［18］" 楊詩怡，周小利，陳志蕓，等.植物基因功能驗證技術概述［J］.安徽農業科學，2017，45（34）：136-140.

YANG SH" Y，ZHOU X L，CHEN ZH" Y，et al.Technical overview of the validation of gene functionin plants［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2017，45（34）：136-140.

［19］" 宋斯敏，鄭啟明，李世嬌，等.水稻OsAAA1基因超表達載體構建及遺傳轉化［J］.中國農學通報，2020，36（12）：91-96.

SONG S M，ZHENG Q M，LI SH" J，et al.OsAAA1"" gene in rice：overexpression vector construction and genetic transformation［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2020，36（12）：91-96.

［20］" 金萬枚，鞏振輝，李桂榮，等.植物遺傳轉化方法和轉基因植株的鑒定［J］.陜西農業科學，2000（1）：24-29.

JIN W M，GONG ZH H，LI G R，et al.Methods of plant transformation and identification of transgenic plants［J］.Shaanxi Journal of Agricultural Sciences，2000（1）：24-29.

［21］" BRUCE M A，SHOUP RUPP J L.Agrobacterium-mediated transformation of Solanum tuberosum L." potato［J］.Methods in Molecular Biology，2019，1864：203-223.

［22］" BARRELL P J，MEIYALAGHAN S，JACOBS J M，et al.Applications of biotechnology and genomics in potato improvement［J］.Plant Biotechnology Journal，2013， 11（8）：907-920.

［23］" VERHEES J，VAN DER KROL A R，VREUGDENHIL D，et al.Characterization of gene expression during potato tuber development in individuals and populations using the luciferase reporter system［J］.Plant Molecular Biology，2002，50（4-5）：653-665.

［24］" ZHAO B Q，DING W L，TAN Z Z，et al.A large stokes shift" fluorescent" protein constructed from the fusion of red fluorescent mcherry and" far-red" fluorescent BDFP1.6［J］.Chembiochem，2019，20（9）：1167-1173.

［25］" PERISIC T，HOLSBOER F，REIN T，et al.The CpG island shore of the"" GLT-1" gene acts as a methylation-sensitive enhancer［J］.Glia，2012，60（9）：1345-1355.

［26］" METTE M F，AUFSATZ W，VAN DER WINDEN J，" et al.Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA［J］.EMBO Journal，2000，19（19）：5194-5201.

Construction of" an Overexpression Vector for"" StCYP83B1 in Potato （Solanum tuberosum） and Development of"" StCYP83B1-Overexpressing" Transgenic Potato Lines

KONG Lehui，ZONG Deqian，SHI Qingyao，YIN Panpan，WU Wenyu，SHAN Weixing and QIANG Xiaoyu

（College of Agronomy，Northwest Aamp;F University，Yangling"" Shaanxi" 712100，China）

Abstract" To obtain the important transgenic potato plants for further investigation of the immune function of"" StCYP83B1" gene in potatoes，this study cloned"" StCYP83B1" gene from the cDNA of tetraploid potato cultivar" ‘Atlantic’" and inserted it into the 35S：：pART27 recombinant vector labeled with mCherry to create a plant overexpression vector named p35S：：StCYP83B1-mCherry. The expression of StCYP83B1 protein was confirmed using an Agrobacterium-mediated transient expression system in Nicotiana benthamiana. The p35S：：StCYP83B1-mCherry vector was transformed into potato cultivar ‘Atlantic’ via Agrobacterium-mediated genetic transformation. Three individual transgenic lines were randomly selected for identification. PCR detection confirmed the integration of"" StCYP83B1" into potato genome，while qRT-PCR detection revealed a 40-49 fold increase in the transcription level of"" StCYP83B1" in transgenic lines compared to untransformed control plants. Western blotting detection confirmed the protein expression of StCYP83B1 in transgenic lines. Additionally，the phenotypic analyses conducted on the transgenic potato plants and the minitubers indicated that overexpression of"" StCYP83B1" did not affect the potato growth and development. These results confirmed the successful generation of"" StCYP83B1 -OE transgenic potato plants，providing an essential materials for further functional and mechanistic studies on the"" StCYP83B1" gene.

Key words" Potato;"" StCYP83B1 ; Expression vector; Genetic transformation

Received"" 2023-04-28""" Returned" 2023-05-25

Foundation item" National Natural Science Foundation of China （No.31872657）; National Key Ramp;D Program of China （No.2017YFD0200602-2）; National Modern Agricultural Industrial Technology System （No.CARS-09）; Special Research Project of Science and Technology Innovation for Universities and Colleges in China（No.2452020146）.

First author" KONG Lehui，female，master student.Research area：molecular mechanism of plant-oomycetes interactions. E-mail：542909995@qq.com

Corresponding"" author" QIANG Xiaoyu，female，associate professor.Research area：plant disease"" resistance and plant-microbe interactions.E-mail：qiangxiaoyu@nwafu.edu.cn

（責任編輯：成" 敏" Responsible editor：CHENG Min）