基于蛋白質(zhì)組學(xué)研究西瓜接穗對嫁接苗根系生長的影響

摘" 要" 為研究嫁接苗中西瓜接穗對南瓜砧木根系生長的影響，以西瓜品種‘早佳8424’、南瓜品種‘偉砧1號’為試驗(yàn)材料，設(shè)置兩個嫁接組合，西瓜/南瓜（W/P）和南瓜/南瓜（P/P），采用貼接法嫁接，并以不嫁接的南瓜自根苗（P）為對照，采用iTRAQ技術(shù)對W/P、P/P嫁接苗及P的根系蛋白質(zhì)組進(jìn)行全面分析和比較。結(jié)果表明W/P和P/P嫁接苗的砧穗愈合良好，但在愈合期結(jié)束后，W/P嫁接苗的地上部和根系生長最為緩慢。iTRAQ結(jié)果表明相較于P，W/P根系中共鑒定到194個差異豐度蛋白，其中上調(diào)蛋白135個、下調(diào)蛋白59個；相較于P/P，W/P根系中共鑒定到54個差異豐度蛋白，其中上調(diào)20個、下調(diào)蛋白34個。這些差異豐度蛋白主要富集在羧酸代謝、碳水化合物代謝、逆境脅迫響應(yīng)等過程。W/P嫁接苗的根系中參與蔗糖代謝、糖酵解和三羧酸循環(huán)的酶，如蔗糖合成酶、果糖激酶、丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶等豐度顯著低于P/P和P。W/P嫁接苗的根系中脅迫相關(guān)蛋白的豐度顯著升高，包括多個類乳膠蛋白、苯丙氨酸解氨酶、水孔蛋白等。說明W/P嫁接苗中西瓜接穗可抑制砧木根系中的碳水化合物代謝、促進(jìn)根系的逆境脅迫響應(yīng)。

關(guān)鍵詞" 西瓜；南瓜；嫁接；蛋白質(zhì)組學(xué)；iTRAQ；根系

doi：10.7606/j.issn.1004-1389.2024.08.008

https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2024.08.008

收稿日期：2023-07-22" 修回日期：2023-10-10

基金項目：國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2019YFD1001901）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目（CAAS-ASTIP-IVFCAAS，CAAS-ZDRW-202302）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-25）。

第一作者：趙加欣，女，碩士研究生，從事西瓜嫁接育苗研究。E-mail：yywjiaxin@163.com

通信作者：董春娟，女，副研究員，主要從事蔬菜苗期生長發(fā)育調(diào)控研究。E-mail：dongchunjuan@caas.cn

西瓜（Citrullus lanatus L.）是一種重要的園藝作物，中國是西瓜生產(chǎn)和消費(fèi)大國，栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位［1］。然而隨著多年連作，枯萎病等士傳病害日益嚴(yán)重，已經(jīng)成為制約西瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙因素。嫁接可以提高西瓜對土傳病害的抗性，同時還可以顯著提高產(chǎn)量、增強(qiáng)植株抗逆性和抗病性，在西瓜生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用［2-3］。在西瓜嫁接栽培生產(chǎn)中，由于長期使用單一砧木品種、栽培管理措施不當(dāng)、不適宜的天氣以及接穗本身光合同化養(yǎng)分減少等，使根系生長和活力受到限制，根系對水分和養(yǎng)分的吸收供應(yīng)不足難以維持植株生長，從而導(dǎo)致嫁接苗出現(xiàn)早衰或急性凋萎現(xiàn)象［4-5］，嚴(yán)重限制了西瓜嫁接栽培技術(shù)的應(yīng)用。

砧穗間的信號互作和物質(zhì)交流一直是嫁接研究的熱點(diǎn)［6-8］。研究發(fā)現(xiàn)，嫁接后砧木可以影響接穗的光合作用、碳代謝、內(nèi)源激素含量等，從而影響接穗的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)［8-10］。然而，相比于砧木對接穗的影響，接穗對砧木根系的影響相關(guān)研究較少，僅在部分作物中有報道。如在山核桃嫁接苗中，接穗顯著改變砧木根系長度、根系表面積、根系體積以及生物量等形態(tài)指標(biāo)［11］，類似的研究結(jié)果在葡萄［12］、蘋果［13］、柑橘［14］等嫁接苗中也有發(fā)現(xiàn)。趙加欣等［5］研究發(fā)現(xiàn)在西瓜/南瓜嫁接苗中，西瓜接穗可以抑制砧木根系中糖的積累，抑制根系生長和活力。上述這些研究仍停留在表型和生理研究層面，對接穗影響根系的全面分子機(jī)制仍不甚了解。

同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)是一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)，通過特異性地標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán)，可同時比較多個樣品的相對蛋白含量，具有精確度高、重復(fù)性好、能鑒定低豐度蛋白等特點(diǎn)，已成為蛋白定性和定量研究的重要工具之一［15］。如 Shi等［16］采用iTRAQ技術(shù)解析了西瓜嫁接苗耐冷性提高的分子機(jī)制，共鑒定到4 796個低溫響應(yīng)蛋白，參與光合作用、碳代謝和氧化磷酸化、活性氧清除、精氨酸生物合成等過程。Li等［17］采用iTRAQ分析了西瓜響應(yīng)綠斑駁病毒CGMMV的蛋白，共鑒定到595個差異蛋白，參與光合、糖代謝、次生代謝物合成、植物-病原菌互作、蛋白合成與周轉(zhuǎn)等過程。本試驗(yàn)利用iTRAQ技術(shù)對西瓜/南瓜、南瓜/南瓜嫁接苗及南瓜自根苗的根系蛋白質(zhì)組進(jìn)行全面分析，鑒定差異蛋白及其相關(guān)途徑，挖掘與碳水化合物代謝和脅迫響應(yīng)相關(guān)的蛋白和基因，以期闡明西瓜接穗對砧木根系的影響，為西瓜嫁接苗的壯根培育提供科學(xué)依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

西瓜接穗選用‘早佳8424’，購自新疆農(nóng)科院哈密瓜研究中心；南瓜砧木品種選用‘偉砧1號’，購自山東偉麗種苗有限公司。接穗播種于托盤（長×寬×高=540 mm×270 mm×60 mm）中，購自臺州隆基塑業(yè)有限公司；砧木播種于營養(yǎng)缽中，規(guī)格為上口徑70 mm、下口徑50 mm、高" 55 mm，購自北京順莉科技有限公司。育苗用蛭石、珍珠巖和石英砂，購自河北靈壽縣騰達(dá)礦產(chǎn)品加工廠。

1.2" 砧穗幼苗培養(yǎng)與嫁接

試驗(yàn)材料于2021年3―5月培養(yǎng)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南區(qū)玻璃溫室中。西瓜和南瓜種子分別于室溫浸種24 h和" 6 h，5%"" NaClO消毒10 min，蒸餾水洗凈后，在恒溫箱內(nèi)" 28 ℃催芽。待種子露白后，挑選萌發(fā)整齊一致的種子，將接穗播種于裝有蛭石、珍珠巖混合基質(zhì)（體積比為1∶1）的育苗托盤中，每托盤播種約150粒。將砧木種子播于裝有蛭石和石英砂混合基質(zhì)（體積比為5∶1）的營養(yǎng)缽中，每營養(yǎng)缽中播1粒種子。用于接穗的西瓜和南瓜分別比砧木晚播種1 d和3 d。播種后覆蓋1.5 cm厚的蛭石，充分澆施1/2 Hoagland營養(yǎng)液，并于玻璃溫室自然溫光條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待接穗幼苗長至子葉平展、砧木幼苗長至第1片真葉露心時進(jìn)行嫁接。

試驗(yàn)設(shè)置兩組嫁接處理，西瓜/南瓜（接穗/砧木，W/P）和南瓜/南瓜（P/P），W/P和P/P中砧木分別比接穗早播種1 d和3 d。嫁接采用單子葉貼接法，嫁接操作和愈合期環(huán)境設(shè)置參照趙加欣等［5］。以不嫁接的南瓜自根苗（P）為對照，P的環(huán)境設(shè)置與嫁接苗一致。嫁接后8 d將幼苗移入玻璃育苗溫室中，自然溫光環(huán)境培養(yǎng)至嫁接" 后14 d，期間采用1/2 Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行" 灌溉。

1.3" 嫁接苗韌皮部和木質(zhì)部連通情況觀察

采用熒光示蹤法觀察韌皮部連通情況［18］。取樣前24 h將接穗子葉的近軸面用砂紙輕輕摩擦，取5 μL 5（6）-羧基熒光素二乙酸酯［5（6）-carboxyfluorescein diacetate（CFDA），10"" mmol·L-1，Sigma，美國］溶液滴在磨損的子葉表面，子葉上包裹錫箔紙以防止熒光染料見光分解。取樣觀測時在愈合部位下方1.5 cm處進(jìn)行徒手切片，切片迅速放入盛有80%甘油的培養(yǎng)皿中以防止染料丟失。將切片撈出置于載玻片上，熒光顯微鏡（Olympus）下觀察韌皮部中CF熒光，熒光的最適激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為515 nm。

嫁接苗木質(zhì)部連通情況參照Miao等［19］的方法，略作改動。嫁接后第1 天起，每天取嫁接苗，于愈合部位下方2 cm處切斷，豎直放置于1%的酸性品紅水溶液中，在溫度28 ℃、光照強(qiáng)度100"" μmol·m-2·s-1條件下靜置6 h。于愈合部位上、下方各0.5 cm處進(jìn)行徒手切片，在SZX16體視鏡（Olympus）下觀察。

1.4" 幼苗生長指標(biāo)的測定

分別于嫁接后0、7、14 d進(jìn)行取樣，測定不同處理幼苗的地上部干質(zhì)量、根系鮮質(zhì)量和干質(zhì)量［20］，根據(jù)干質(zhì)量的增長量分別計算地上部和根系的生長速率［21］。每處理設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)9株。

1.5" 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1.5.1" 蛋白提取與定量" 對W/P、P/P嫁接苗和P自根苗，取嫁接后14 d的幼苗根系樣品，液氮研磨后加入蛋白裂解液（100 mmol·L-1 NH4HCO3、6 mol·L-1尿素、0.2% SDS，pH"" 8.0），振蕩混勻，冰水浴超聲5 min使充分裂解。于4" ℃、12 000" g離心15 min，取上清加入終濃度10 mmol·L-1 DTTred于56" ℃反應(yīng)1 h，之后加入足量碘乙酰胺（iodacetamide，IAM），于室溫避光反應(yīng)1 h。加入4 倍體積的預(yù)冷丙酮于" -20" ℃條件下沉淀3 h，離心收集沉淀，沉淀用預(yù)冷丙酮重懸并清洗，離心收集沉淀，風(fēng)干，加入適量蛋白溶解液（6 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1""" TEAB，pH 8.5）溶解蛋白沉淀。使用Bradford蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。試驗(yàn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，共9個樣品。

1.5.2" 蛋白酶解和iTRAQ標(biāo)記蛋白" 每個樣品各取120 μg蛋白，加入蛋白溶解液定容至100 μL，加入1 μg·μL-1胰蛋白酶3 μL和50"" mmol·L-1 TEAB緩沖液500 μL，混勻，37 ℃酶切過夜。加入等體積的1%甲酸，混勻，室溫條件下，12 000" g離心5 min。取上清緩慢通過C18脫鹽柱，之后使用1 mL清洗液（0.1%甲酸、4%乙腈）連續(xù)清洗3次，再加入0.4 mL洗脫液" （0.1%甲酸、75%乙腈）連續(xù)洗脫2次，洗脫樣合并后凍干。加入100 μL 100 mmol·L-1 TEAB緩沖液復(fù)溶，并加入41 μL乙腈溶解的TMT標(biāo)記試劑，室溫下顛倒混勻反應(yīng)2 h。之后加入終濃度8%氨水終止反應(yīng)，取等體積標(biāo)記后的樣品混合，除鹽后凍干。

1.5.3" HPLC-MS/MS分析" 使用L-3000 HPLC系統(tǒng)，色譜柱為Waters BEH C18" （25 cm×4.6 mm，5 μm），進(jìn)行HPLC分級。設(shè)置柱溫為50" ℃、流速1 mL·min-1，流動相A液為2%乙腈、98%水，氨水調(diào)至pH 10，B液為98%乙腈、2%水，氨水調(diào)至pH 10。每分鐘收集1管，合并為10個餾分，凍干后各加入0.1%甲酸溶解。使用Q ExactiveTM HF-X質(zhì)譜儀［配備納米電噴霧離子源Nanospray FlexTM（ESI）］進(jìn)行液相二級質(zhì)譜分析，生成質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)（raw文件）。

1.6" 差異蛋白篩選及生物信息學(xué)分析

下機(jī)后的raw文件直接導(dǎo)入到Proteome Discoverer 2.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，譜肽、蛋白定量，設(shè)置過濾條件為：保留可信度在99%以上的譜肽，保留至少包含1個unique肽段的蛋白，對保留可信的譜肽和蛋白做FDR（False Discovery Rate）驗(yàn)證，去除FDR大于1%的肽段和蛋白。按差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）篩選差異表達(dá)蛋白，其中，F(xiàn)C≥1.3且P≤0.05為上調(diào)表達(dá)蛋白，F(xiàn)C≤0.77且P≤0.05為下調(diào)表達(dá)蛋白，差異表達(dá)蛋白的參數(shù)設(shè)定參照Cui等［22］。

比對Pfam、ProDom、SMART等結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫，利用模式結(jié)構(gòu)或特征進(jìn)行功能未知蛋白的結(jié)構(gòu)域注釋。利用Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫（http：//www.geneontology.org/）對篩選到的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析。

1.7" RT-qPCR驗(yàn)證

根系總RNA采用EasyPure Plant RNA Kit（全式金，北京）試劑盒提取，使用TransScript" All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR （One-Step gDNA Removal ）試劑盒（全式金，北京）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和cDNA第一鏈合成。Real-time PCR定量分析采用試劑盒為Transstart" Top Green qPCR Kit（全式金，北京），儀器為LightCycler 96實(shí)時熒光定量PCR儀（Roche，瑞典）。以南瓜持家基因EF1-α作為Real-time PCR的內(nèi)參基因［23］。各基因的特異性擴(kuò)增引物見表1。基因相對表達(dá)水平采用2-ΔΔCT法計算［24］，設(shè)定目標(biāo)基因在嫁接后0 d時的表達(dá)水平為1.0。

1.8" 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，采用SAS 9.20軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（Plt;0.05）。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 西瓜接穗對嫁接苗愈合的影響

砧穗間物質(zhì)交流的開始標(biāo)志著接合部位維管束的連通，反映嫁接愈合進(jìn)程。利用CF熒光示蹤法觀測嫁接苗愈合部位韌皮部連通情況，結(jié)果如圖1所示。2 dag時，P/P和W/P嫁接苗韌皮部均未連通；3 dag時，部分W/P和P/P嫁接苗接合部位下方可觀測到接穗運(yùn)輸下來的CF熒光，并且隨著嫁接愈合，觀測到的熒光亮度越來越強(qiáng)；到5 dag時，所有嫁接苗的韌皮部全部連通，W/P和P/P嫁接苗間的韌皮部連通未表現(xiàn)出顯著差異。

嫁接苗愈合部位木質(zhì)部連通情況采用品紅示蹤法觀察（圖2）。1 dag時在W/P和P/P嫁接苗接合部位上方均未觀測到砧木運(yùn)輸上來的紅色品紅；2 dag時可在P/P嫁接苗的接穗維管束中觀測到紅色品紅，但在W/P的接穗中觀測到品紅需要在3 dag后，表明在木質(zhì)部連通率上，P/P嫁接苗要略早于W/P嫁接苗。

上述結(jié)果表明，本研究所用的西瓜接穗‘早佳8424’與南瓜砧木‘偉砧1號’嫁接苗（W/P）可以良好愈合，不會因異體嫁接親和性較差或接合部位韌皮部連通較晚，從而對嫁接苗根系生長和活力產(chǎn)生影響。

2.2" 西瓜接穗對W/P嫁接苗地上部和根系生長速率的影響

比較不同嫁接苗在0～14 dag的生長速率，結(jié)果如圖3所示，相較于愈合后（7～14 dag），在嫁接愈合期（0～7 dag），P/P、W/P和P的地上部和根系的生長均較緩慢，且W/P的地上部的生長速率顯著低于P和P/P，P與P/P之間無顯著差異，而根系生長速率在W/P、P/P和P之間無顯著差異。在7～14 dag期間，地上部和根系的生長速率均呈現(xiàn)出W/Plt;P/Plt;P（圖3）。上述結(jié)果表明，在愈合后W/P嫁接苗地上部和根系的生長受到顯著抑制。

2.3" 西瓜接穗對W/P嫁接苗砧木根系蛋白質(zhì)組的影響

采用iTRAQ分析W/P、P/P和P根系蛋白質(zhì)組的差異，質(zhì)譜檢測共獲得1 244 594張譜圖，匹配到的譜圖為297 224張，共獲得肽段150 675個，F(xiàn)DR≤1%的蛋白數(shù)量為10 389個。肽段序列覆蓋度在lt;10%、10%～20%、20%～30%、30%～40%、40%～100%的蛋白質(zhì)分別占鑒定總蛋白的37.64%、27.15%、15.09%、" 11.33%和8.79%，即大部分鑒定到的蛋白質(zhì)具有較好的覆蓋度，表明數(shù)據(jù)可靠性。

按FC≥1.5（上調(diào)）或FC≤0.67（下調(diào)）、且" P≤0.05作為差異表達(dá)蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)，鑒定到的差異豐度蛋白（differentially accumulated protein，DAP）數(shù)量如圖4所示。P/P與P相比，14 d時共鑒定到29個DAP，其中下調(diào)蛋白20個，上調(diào)蛋白9個；W/P vs P比較組在14 d時鑒定到DAP最多（194個），其中下調(diào)蛋白59個，上調(diào)蛋白135個；W/P與P/P相比，共54個DAP，其中下調(diào)蛋白34個，上調(diào)蛋白20個（圖4）。使用Venn圖分析各比較組的DAP，10個DAP是P/P vs P比較組中獨(dú)有的，160個DAP是W/P vs P比較組中獨(dú)有的，30個DAP是W/P vs P/P比較組中獨(dú)有的，僅有1個蛋白是在所有比較組中共有的（圖4）。

2.4" 嫁接苗根系DAP的GO富集分析

對上述DAP 進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果如圖5所示，共201個DAP富集到47個GO term，在生物過程方面，主要富集到細(xì)胞過程、脅迫響應(yīng)、非生物逆境響應(yīng)、有機(jī)酸代謝過程、羧酸代謝過程、碳水化合物代謝過程等GO term；在分子功能方面，主要富集到催化活性、氧化還原酶活性、抗氧化活性、金屬離子結(jié)合、陽離子結(jié)合等GO term；在細(xì)胞組分方面，主要富集到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外圍、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、胞外區(qū)、質(zhì)膜、細(xì)胞核等GO term。

2.5" 西瓜接穗對W/P嫁接苗根系中碳水化合物代謝相關(guān)蛋白含量的影響

在鑒定到的DAP中，參與羧酸代謝的酶共富集到39個，其中碳水化合物代謝相關(guān)的酶共22個，部分DAP的信息如表2所示，這些DAP在碳水化合物代謝途徑中的位置如圖6所示，主要參與蔗糖代謝、糖酵解和TCA循環(huán)。與P相比，P/P嫁接苗中蔗糖合成酶（CmSS、CmSS5）、果糖激酶（CmFK7）、丙酮酸激酶（CmPK）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（CmPPC2b）的蛋白含量顯著下調(diào)（表2），在W/P嫁接苗中，上述碳水化合物代謝相關(guān)蛋白進(jìn)一步下調(diào)，且其他蛋白如半乳糖基-蔗糖轉(zhuǎn)移酶（CmRFS2）、磷酸三糖異構(gòu)酶（CmTPI）、蘋果酸脫氫酶（CmMDH）較P也顯著下調(diào)（表2）。

選擇部分碳水化合物代謝相關(guān)的基因，對其表達(dá)水平進(jìn)行RT-qPCR定量分析（圖7），這些基因在P、P/P和W/P根中的表達(dá)趨勢和蛋白組學(xué)結(jié)果（表2）一致，基因表達(dá)量基本呈P gt; P/P gt; W/P的變化趨勢。

綜上結(jié)果表明，在P/P和W/P嫁接苗中，長勢較弱的接穗可抑制砧木根系中碳水化合物代謝相關(guān)基因的表達(dá)，且西瓜接穗的抑制效果更強(qiáng)。

2.6" 西瓜接穗對W/P嫁接苗根系中脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白含量的影響

在鑒定到的DAP中，脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白共有72個，其中部分DAP的含量變化如表3所示。與P相比，W/P嫁接苗中，類乳膠蛋白Major latex protein（MLP）-like protein（CmMLP43a、CmMLP43b、CmMLP34a、CmMLP34b、CmMLP34c、CmMLP328a、CmMLP328b、CmMLP328c）、苯丙氨酸解氨酶（CmPAL4、CmPAL7）以及水孔蛋白（CmTIP1-1、CmPIP1-3、CmPIP1-4a、CmPIP1-4b、CmPIP2-7a、CmPIP2-7b、CmPIP2-7c）的含量顯著上調(diào)，上述蛋白在P/P中的含量較P也有所下調(diào)，但均未達(dá)到顯著性差異（Pgt;0.05）。

選擇部分脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因，對其表達(dá)水平進(jìn)行RT-qPCR定量分析，結(jié)果如圖8所示，這些基因在P自根苗、P/P嫁接苗、W/P嫁接苗根中的表達(dá)趨勢和蛋白組學(xué)結(jié)果（表3）一致，基因表達(dá)量基本呈Plt;P/Plt;W/P的變化趨勢。可見，在W/P嫁接苗中，西瓜接穗促進(jìn)了砧木根系中脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。

3" 討論與結(jié)論

西瓜是重要的園藝作物，以南瓜為砧木進(jìn)行嫁接“換根”，可以有效克服連作障礙、提高抗病性和耐逆性，從而提高西瓜產(chǎn)量和品質(zhì)［3，25-27］。嫁接苗作為一個植株整體，砧木根系的生長發(fā)育除了依賴自身吸收的水分、礦質(zhì)養(yǎng)分外，也依賴于接穗供給的光合產(chǎn)物、植物激素等［5，28］，然而嫁接苗中接穗對砧木根系的影響一直是砧穗互作研究的盲點(diǎn)。前期研究發(fā)現(xiàn)，西瓜接穗通過抑制嫁接苗根系中糖的積累，抑制糖代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)化酶和己糖激酶（CWIN、HXK）等的活性，從而抑制嫁接苗的根系生長和活力［5］。在本研究中，供試的西瓜接穗品種和南瓜砧木品種間具有很好的親和性，嫁接后愈合良好，但在嫁接愈合期（0～7 d），嫁接苗根系的生長速率緩慢，且西瓜接穗對W/P根系生長速率的影響不顯著，這與愈合期弱光高濕的環(huán)境有關(guān)。在高溫高濕環(huán)境下，根系生長主要受環(huán)境的影響，盡管地上部的生物量存在差異，但未對根系生長造成顯著差異。在嫁接愈合后" （7～14 d），W/P中接穗地上部和砧木根系的生長速率均顯著低于P/P和P（圖3），這與前期研究結(jié)果一致［5］。接穗對嫁接苗根系生長的調(diào)控作用在核桃［11］、柑橘［14］、桃［29］等果樹中也有報道。然而，Sallaku等［21］的研究表明，在西瓜/南瓜嫁接植株中，砧木的根長和根表面積等僅受接穗和砧木之間兼容性問題的影響，未受到接穗的影響，這可能與不同研究中取樣時間的不同有關(guān)。Sallaku等［21］的取樣時間為嫁接后60 d，在該研究中，嫁接苗種植在塑料營養(yǎng)缽（20cm×12cm×8 cm）中，在這一營養(yǎng)缽栽培條件下，植株的根系生長基本進(jìn)入平臺期，而本研究的取樣時間為嫁接后14 d，是幼苗根系快速生長期。

采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析西瓜接穗影響嫁接苗根系生長的分子機(jī)制，共鑒定到238個差異蛋白，GO富集分析顯示，差異蛋白主要富集于羧酸代謝、碳水化合物代謝、脅迫響應(yīng)等過程（圖4和圖5）。碳水化合物代謝是根細(xì)胞獲得生長所需能量的主要方式，地上部的光合產(chǎn)物通過韌皮部向下運(yùn)輸?shù)礁浚└瞪L［30］。在本研究中，相較于南瓜接穗，W/P中西瓜接穗生長較緩慢，光合產(chǎn)物的合成少，因此運(yùn)輸?shù)礁档奶菧p少。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根系中參與蔗糖分解代謝、糖酵解和TCA循環(huán)的關(guān)鍵蛋白下調(diào)表達(dá)（表2，圖6和圖7），表明在W/P嫁接苗中，砧木根系的碳水化合物代謝減弱，供生長所需的能量減少，從而生長變緩。

接穗光合產(chǎn)物的供給減少導(dǎo)致砧木根系中能量匱乏，表明砧木根系處于一種碳饑餓的脅迫狀態(tài)［31-32］。本研究發(fā)現(xiàn)，在W/P嫁接苗中，西瓜接穗可引起根系中脅迫相關(guān)蛋白顯著上調(diào)，如MLP、TIP、PIP、PAL等。MLP蛋白廣泛參與植物對生物逆境和非生物逆境的響應(yīng)［33］。干旱和鹽脅迫條件下，MLP基因受ABA誘導(dǎo)，提高植物抗逆性［34-35］。擬南芥MLP43響應(yīng)干旱脅迫，" MLP43基因在幼苗子葉、初生根和頂端分生組織等幼嫩組織中表達(dá)， MLP43過量表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性，而 mlp43突變體對干旱脅迫的敏感性增強(qiáng)［31］。此外，在南瓜中的研究發(fā)現(xiàn)，MLP蛋白在根系中可與一些有機(jī)分子結(jié)合形成復(fù)合體，然后這一復(fù)合體被轉(zhuǎn)移至木質(zhì)部導(dǎo)管中，并被運(yùn)輸?shù)街参锏牡厣喜浚?6-37］。W/P嫁接苗根系中多個CmMLP蛋白豐度上調(diào)、基因表達(dá)升高，推測在提高嫁接苗對干旱等脅迫的耐受性的同時，還可促進(jìn)根系對物質(zhì)的吸收和向地上部的運(yùn)輸。PIP、TIP均屬于水孔蛋白，是植物中水分子、CO2及其他一些小分子溶質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)闹匾ǖ溃诰S持植物細(xì)胞水分平衡中起重要作用，其中PIP位于質(zhì)膜上，而TIP位于液泡膜上［38］。水通道蛋白參與植物韌皮部裝載和卸載、氣孔運(yùn)動調(diào)節(jié)、根系構(gòu)型等多個生理過程［39］。在水稻中，根系水孔蛋白的表達(dá)有助于全株的抗寒性［40］。嫁接可顯著提高西瓜的抗旱能力［41］，在W/P嫁接苗根系中，檢測到多個CmPIP和CmTIP蛋白豐度和基因表達(dá)上調(diào)（表3，圖8），這可能也是嫁接苗抗旱性提高的原因之一。但是更加準(zhǔn)確地闡明這些基因在西瓜/南瓜嫁接苗抗性形成中作用，尚有待進(jìn)一步的生化或分子證據(jù)的支持。

本研究基于iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析了西瓜接穗對嫁接苗根系的蛋白豐度變化，這些差異蛋白主要富集于碳水化合物代謝、逆境脅迫響應(yīng)等途徑，上述研究結(jié)果深入揭示了西瓜接穗影響嫁接苗根系生理和分子基礎(chǔ)，并進(jìn)一步豐富了嫁接苗砧穗間互作機(jī)理。地上部接穗通過何種信號途徑影響地下部砧木根系的基因表達(dá)將是下一步研究的重點(diǎn)。

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Effects of Watermelon Scions on Root Growth in Grafted Seedlings by Proteomic Analysis

ZHAO" Jiaxin，XIE Lulu，WEN Zhengyang，SUN Jingbo，ZHANG Feng，ZHANG Mengxia" and DONG Chunjuan

（State Key Laboratory of Vegetable Biobreeding，Institute of Vegetables and Flowers，

Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing" 100081，China）

Abstract" In order to explore the effects of watermelon scions on root growth of pumpkin rootstocks，the watermelon cultivar ‘Zaojia 8424’and pumpkin cultivar ‘Weizhen No. 1’were used as materials.Pumpkin seedlings without grafting （P） were used as control，and two grafting combinations （watermelon/pumpkin （W/P） and pumpkin/pumpkin （P/P）） were set，using the one-cotyledon splice grafting method. iTRAQ method was used to compare the proteome of roots of W/P，P/P and P. The results showed that scions and rootstocks of W/P and P/P grafted seedlings could be united well. However， after the healing period，both shoot and root growth of the W/P grafted seedlings were the slowest." This suggests that although the scions and rootstocks of W/P and P/P grafted seedlings in this study could unite effectively，the W/P grafted seedlings exhibited slower shoot and root growth after the healing period. iTRAQ proteomic analysis identified 194 differential"" abundance proteins in W/P vs P，including 135 up-related proteins and 39 down-regulated proteins. Additionally， 54 differential"" abundance proteins were identified in W/P vs P/P，consisting of 20 up-related proteins and 34 down-regulated proteins. These differential abundance proteins were mainly enriched in carboxylic acid metabolic processes，carbohydrate metabolic processes，stress response processes，and so on. The abundance of enzymes involved in sucrose metabolism，glycolysis，and TCA cycle in the roots of W/P grafted seedlings，such as sucrose synthase，fructose kinase，pyruvate kinase，and phosphoenolpyruvate carboxylase，was significantly lower than that of P/P and P. The abundance of stress-related proteins in the roots of W/P grafted seedlings was significantly increased，including major latex protein （MLP）-like proteins，phenylalanine ammonia-lyases and aquaporins. These results indicate that watermelon scion in W/P grafted seedlings can repress carbohydrate metabolism，but promote stress responses in the roots of pumpkin rootstock.

Key words" Watermelon；Pumpkin；Grafting；Proteomic；iTRAQ；Root

Received"" 2023-07-22""" Returned" 2023-10-10

Foundation item" The National Key Ramp;D Program of China （No. 2019YFD1001901）; Science and Technology Innovation Program of the Chinese Academy of Agricultural Sciences（No.CAAS-ASTIP-IVFCAAS，No.CAAS-ZDRW-202302）; China Agriculture Research System" of MOF and MARA" （No.CARS-25）.

First author" ZHAO" Jiaxin，female，master student. Research area：cultivation of watermelon grafted seedlings. E-mail：yywjiaxin@163.com

Corresponding"" author" DONG Chunjuan，female，associate research fellow.Research area：regulation of vegetable seedling growth and development. E-mail：dongchunjuan@caas.cn

（責(zé)任編輯：史亞歌" Responsible editor：SHI Yage）