辣木葉γ-氨基丁酸富集方法研究

摘" 要" 為了提高辣木葉的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA） 含量，通過辣木枝條的導(dǎo)管向葉片細(xì)胞補(bǔ)充外源L-谷氨酸（L-glutamic acid，L-Glu），以干葉的GABA含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，從辣木葉谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）的酶學(xué)特性、 L-Glu溶液pH和濃度、浸吸時(shí)間、轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間、轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度等方面對(duì)植物導(dǎo)管法富集辣木葉GABA的適宜條件進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：辣木葉GAD的最適反應(yīng)溫度和pH分別為40 ℃和6.0，在4～30 ℃和pH 5.6～6.4相對(duì)較穩(wěn)定；與破碎法（破碎葉片釋放GAD轉(zhuǎn)化外源L-Glu合成GABA）相比較，植物導(dǎo)管法（通過植物導(dǎo)管補(bǔ)充外源L-Glu）由于GAD存在細(xì)胞的保護(hù)而富集效果更佳，植物導(dǎo)管法富集的GABA含量是破碎法的1.71倍；當(dāng)將鮮辣木枝條切口端插入pH 5.5、50 mmol/L"" L-Glu溶液于室溫放置浸吸1 h，然后摘取辣木葉于35 ℃保溫7 h，辣木葉GABA含量由初始（1.86±0.13）" mg/g增加至（5.97±0.36）mg/g，提高了2.21倍。植物導(dǎo)管法富集辣木葉GABA的工藝簡(jiǎn)單，在富GABA辣木葉產(chǎn)品開發(fā)方面具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞" 辣木；γ-氨基丁酸；谷氨酸脫羧酶；植物導(dǎo)管；富集

doi：10.7606/j.issn.1004-1389.2024.08.019

https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2024.08.019

收稿日期：2023-08-24" 修回日期：2023-11-06

基金項(xiàng)目：廣東省重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科科研能力提升項(xiàng)目（2022ZDJS079）；廣東省普通高校特色創(chuàng)新項(xiàng)目（2022KTSCX073）；廣東省自然科學(xué)基金（2022A1515010360）；廣東省本科高校教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程特色專業(yè)項(xiàng)目（2022KTSCX073）。

第一作者：楊勝遠(yuǎn)，男，博士，教授，研究方向?yàn)榫G色生物制造。E-mail：yangsy1972@163.com

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）具有降血壓［1］、鎮(zhèn)靜［2］、改善睡眠［2-3］、增強(qiáng)免疫力［4］、預(yù)防心血管疾病［5］、調(diào)節(jié)新陳代謝［6］、改善氧化應(yīng)激與甲狀腺功能［7］、抑癌［8-9］等多種生理功能，是一種新型食品功能性因子。GABA合成主要有化學(xué)合成法和生物合成法，化學(xué)合成法由于化學(xué)原料具有毒性和腐蝕性，反應(yīng)條件劇烈，副產(chǎn)物多，缺乏安全性，不適宜作為食品添加劑，而生物合成法是以生物內(nèi)源酶催化合成GABA，反應(yīng)條件溫和、安全性高，以生物合成法生產(chǎn)食品或醫(yī)藥級(jí)GABA 是一條較理想途徑［10］。生物合成法主要以微生物［11-12］和植物［13-21］及其內(nèi)源酶合成GABA，其中利用植物內(nèi)源酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)富集GABA，無需提取GABA即可直接開發(fā)為富GABA食品，顯著增加農(nóng)副產(chǎn)品的附加值，已引起研究人員極大關(guān)注。一些研究表明，通過缺氧、高鹽、熱激、冷激、機(jī)械損傷等脅迫應(yīng)激反應(yīng)，可以增加植物的 GABA含量，已成功開發(fā)富GABA的茶葉［13］、發(fā)芽糙米［14］、發(fā)芽小米［15］、大豆［16］、蠶豆［17］、豌豆［18］、蕓豆［19］、桑葉［20］、咖啡葉［21］等食材。然而，利用脅迫應(yīng)激反應(yīng)富集GABA的脅迫處理操作繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)，容易對(duì)食材的結(jié)構(gòu)和風(fēng)味產(chǎn)生不利影響。因此，如何更簡(jiǎn)便而高效地利用植物內(nèi)源酶富集食材中的GABA，對(duì)富GABA植物產(chǎn)品的開發(fā)仍具有重要意義。

辣木（Moringa" oleifera Lam.）為原分布于印度北部的亞喜馬拉雅地區(qū)的抗旱速生樹種［15］，其嫩葉含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、黃酮類、苯丙素類、多酚類、異硫氰酸酯類、甾體類、萜類、生物堿類以及多種礦物質(zhì)［22-25］，具有較好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及抗氧化［26-27］、降血糖［27-28］、調(diào)血脂［28］、降尿酸［29］、降血壓［30］、抗炎［31-32］、改善鉛中毒的肝腎功能［33］、抗腫瘤［34-35］、潤(rùn)腸通便［36］等生理活性。中國(guó)衛(wèi)生部《關(guān)于批準(zhǔn)蛋白核小球藻等4種新資源食品的公告》（衛(wèi)生部公告2012年第19號(hào)）已將辣木葉列為新資源食品。楊勝遠(yuǎn)等［25］研究表明辣木嫩葉含有（2.07±0.07） mg/g（以干質(zhì)量計(jì)）天然GABA。因此，辣木葉也是補(bǔ)充GABA的新食材。Okada 等［37］采用口服GABA米胚芽食品進(jìn)行研究表明，GABA的總攝入量為每人26.4 mg/d，GABA對(duì)婦女更年期綜合癥和老年初期精神障礙的總改善率為75%。按每人26.4 mg/d攝入量計(jì)，每人每天需要食用12.75 g干辣木葉，說明辣木葉天然GABA含量［25］仍偏低，不利于富GABA辣木葉產(chǎn)品的開發(fā)，亟待進(jìn)一步通過富集技術(shù)提高辣木葉GABA含量。然而，目前關(guān)于利用辣木葉內(nèi)源酶富集GABA的研究鮮見報(bào)道。

谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15）是生物體催化L-谷氨酸（L-glutamic acid，L-Glu）發(fā)生α-羧基脫羧作用生成GABA的唯一酶［38］，而辣木葉同時(shí)存在L-Glu和GABA［25］，由此推測(cè)辣木葉GABA的合成途徑是通過內(nèi)源GAD催化L-Glu脫羧作用而實(shí)現(xiàn)，即辣木葉存在GAD。本試驗(yàn)基于這一推斷通過利用辣木枝條的導(dǎo)管作用向葉片細(xì)胞補(bǔ)充外源" L-Glu，結(jié)合辣木葉GAD酶學(xué)特性，從L-Glu溶液pH和濃度、浸吸時(shí)間、轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間、轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度等方面對(duì)辣木葉GABA的富集條件進(jìn)行研究，構(gòu)建辣木葉富集GABA的導(dǎo)管法。利用導(dǎo)管法制備的富GABA辣木葉的葉片完整、GABA含量高，在富GABA辣木茶的開發(fā)方面具有很好的應(yīng)用前景，也可為其他葉類植物GABA富集技術(shù)開發(fā)提供參考。

1" 材料與方法

1.1" 材料與試劑

辣木鮮枝葉采自嶺南師范學(xué)院校園自種辣木苗（lt;3 a齡）頂部枝葉，枝條長(zhǎng)度約30～50 cm，均為3—7月新長(zhǎng)嫩枝葉，葉片呈淺綠色。

異硫氰酸苯酯（Phenylisothiocyanate，PITC）和γ-氨基丁酸（含量≥99%），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙腈、乙酸、三乙胺（均為色譜純），美國(guó)TEDIA公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)市售分析純?cè)噭┗蛏噭?/p>

1.2" 儀器與設(shè)備

P1201高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司；AUW120電子分析天平，日本Shimadzu公司；TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；VX-200渦旋混合儀，美國(guó)Labnet公司；FE28 pH計(jì)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州榮華儀器制造有限公司。

1.3" 辣木葉GAD性質(zhì)研究

1.3.1" 辣木葉GAD的提取" 稱辣木葉180 g，于―20 ℃冷凍2 h，用研缽在冰浴上研磨至糜爛，加入石英砂60 g、4 ℃的pH 6.0、0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，PBS，含0.1 mmol/L PLP和2 mmol/L巰基乙醇） 60 mL，繼續(xù)充分研磨至漿狀，靜置浸提30 min，濾布?jí)簽V，收集濾液于4 ℃、8 500 r/min、離心15 min，取上清液，冰浴下加入（NH4）2SO4干粉至飽和度為90%，靜置沉淀30 min，4" ℃、10 000 r/min離心15 min，取沉淀溶于 20 mL pH 6.0、0.2"" mol/L PBS緩沖液（含0.1 mmol/L PLP和" 2 mmol/L巰基乙醇），即為辣木葉GAD粗酶液， 4 ℃保藏備用。

1.3.2" 辣木葉GAD活力測(cè)定" 取辣木葉GAD粗酶液1 mL與0.20 mol/L L-Glu溶液（pH"" 6.0，溶于0.2 mol/L PBS緩沖液，含0.2"" mmol/L PLP） 1 mL混合，40 ℃水浴反應(yīng)5 h，加入無水乙醇8 mL，混勻，8 500 r/min離心15 min，采用HPLC測(cè)定上清液GABA含量。將辣木葉GAD粗酶液1 mL、蒸餾水1 mL、無水乙醇8 mL混合，8 500 r/min離心15 min，采用HPLC測(cè)定上清液GABA，作為空白。GAD活力單位定義：在測(cè)定條件下1 h生成1 μmol GABA所需要的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。以活力最高的實(shí)驗(yàn)組平均GAD活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活（%）。

GAD活力=［（A×B－C×D）×5×2］/t

式中：A為試驗(yàn)組反應(yīng)終止液GABA濃度，單位為μmol/mL；B為試驗(yàn)組反應(yīng)終止液GABA測(cè)定稀釋倍數(shù)；C為空白組反應(yīng)終止液GABA濃度，單位為μmol/mL；D為空白組反應(yīng)終止液GABA測(cè)定稀釋倍數(shù)；5為無水乙醇終止反應(yīng)產(chǎn)生的稀釋倍數(shù)；2為反應(yīng)液的總體積，單位為mL；t為反應(yīng)時(shí)間，單位為h。

1.3.3" 溫度對(duì)辣木葉GAD的影響" 溫度對(duì)GAD反應(yīng)活力的影響：按照GAD活力測(cè)定方法考察GAD分別在30、35、40、45、50、55、60、65 ℃的反應(yīng)活力。溫度對(duì)GAD穩(wěn)定性的影響：先將GAD粗酶液分別于4、30、35、40、45、50、55 ℃保溫3 h，然后再按照GAD活力測(cè)定方法測(cè)定各溫度處理的GAD粗酶液在反應(yīng)溫度為40 ℃的殘余活力。

1.3.4" pH對(duì)辣木葉GAD的影響" pH對(duì)GAD反應(yīng)活力的影響：按照GAD活力測(cè)定方法考察GAD在反應(yīng)pH分別為5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2的反應(yīng)活力。pH對(duì)GAD穩(wěn)定性的影響：先將GAD粗酶液通過超濾將溶劑換為生理鹽水，然后取GAD酶液與pH分別為 5.2、5.6、6.0、" 6.4、6.8、7.2的0.05 mol/L的PBS緩沖液（含0.2 mmol/L PLP和2 mmol/L巰基乙醇）等體積混合，于40" ℃ 保溫3 h，然后再按照GAD活力測(cè)定方法測(cè)定經(jīng)不同pH下保溫處理的GAD粗酶液在反應(yīng)pH為6.0的殘余活力。

1.4" 辣木葉GABA富集條件研究

1.4.1" 辣木葉GABA提取" 辣木葉于（103±2）℃烘干至恒量，粉碎過40目篩，稱取辣木葉粉1 g于250 mL錐形瓶中，加蒸餾水40 mL，混勻，沸水浴浸提45 min，冷卻后定容至250 mL，4 ℃、8 500 r/min離心20 min，上清液即為辣木葉GABA提取液。

1.4.2" GABA分析" 辣木葉提取液GABA含量分析參照文獻(xiàn)［39］，采用HPLC測(cè)定。辣木葉GABA含量（mg/g）均以干質(zhì)量計(jì)。

1.4.3" 不同方法對(duì)辣木葉GABA富集的影響" 破碎法：稱取鮮辣木葉10 g，用研缽在冰浴上研磨至糜爛，加入pH 6.0、50 mmol/L L-Glu溶液2 mL，混勻，40 ℃保溫6 h，（103±2）℃烘干至恒量，提取并分析GABA含量。導(dǎo)管法：將鮮辣木枝條切口端插入pH 6.0、50 mmol/L L-Glu溶液液面10 cm以下，室溫放置12 h，摘取辣木葉，將葉片于 40 ℃保溫6 h，（103±2）℃烘干至恒量，提取并分析GABA含量。空白對(duì)照組：將未經(jīng)富集處理而直接于（103±2）℃烘干至恒量的辣木葉作為空白對(duì)照。

1.4.4" L-Glu溶液pH對(duì)辣木葉GABA富集的影響" 將鮮辣木枝條切口端分別插入pH為"" 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的 50 mmol/L L-Glu溶液液面10 cm以下，室溫放置12 h，摘取辣木葉，將葉片于 40 ℃保溫6 h，（103±2）℃烘干至恒量，提取并分析GABA含量。將未經(jīng)富集處理而直接于（103±2）℃烘干至恒量的辣木葉作為空白" 對(duì)照。

1.4.5" L-Glu濃度對(duì)辣木葉GABA富集的影響" 將鮮辣木枝條切口端分別插入pH 6.0的10、30、50、70、90 mmol/L L-Glu溶液液面10 cm以下，室溫放置12 h，摘取辣木葉，將葉片于 40" ℃保溫6 h，（103±2）℃烘干至恒量，提取并分析GABA含量。將未經(jīng)富集處理而直接于（103±2）℃烘干至恒量的辣木葉作為空白對(duì)照。

1.4.6" 浸吸時(shí)間對(duì)辣木葉GABA富集的影響" 將鮮辣木枝條切口端插入pH 6.0、50 mmol/L L-Glu溶液液面10 cm以下，分別于室溫放置1、2、3、4、5、12 h，摘取辣木葉，將葉片于 40 ℃保溫6 h，（103±2） ℃烘干至恒量，提取并分析GABA含量。將未經(jīng)富集處理而直接于（103±2）℃烘干至恒量的辣木葉作為空白對(duì)照。

1.4.7" 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)辣木葉GABA富集的影響" 將鮮辣木枝條切口端插入pH 6.0、50 mmol/L L-Glu溶液液面10 cm以下，于室溫放置1 h，摘取辣木葉，將葉片于 40 ℃分別保溫0、2、4、6、" 8 h，（103±2） ℃烘干至恒量，提取并分析GABA含量。將未經(jīng)富集處理而直接于（103±2）℃烘干至恒量的辣木葉作為空白對(duì)照。

1.4.8" 轉(zhuǎn)化溫度對(duì)辣木葉GABA富集的影響 "將鮮辣木枝條切口端插入pH 6.0、50 mmol/L L-Glu溶液液面10 cm以下，于室溫放置1 h，摘取辣木葉，將葉片分別于30、35、40、45、50 ℃保溫6 h，（103±2）℃烘干至恒量，提取并分析GABA含量。將未經(jīng)富集處理而直接于（103±2） ℃烘干至恒量的辣木葉作為空白對(duì)照。

1.4.9" 正交試驗(yàn)" 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇L-Glu溶液pH、轉(zhuǎn)化溫度和轉(zhuǎn)化時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平見表1，L9 （34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表和結(jié)果見表2。按照表2的試驗(yàn)組合，將鮮辣木枝條切口端插入不同pH的50 mmol/L的L-Glu溶液液面10 cm以下，于室溫放置1 h，摘取辣木葉，將葉片分別于不同溫度下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)不同時(shí)間，置于（103±2）℃烘干至恒量，提取并分析GABA含量。

1.4.10" 驗(yàn)證試驗(yàn)" 將鮮辣木枝條切口端插入pH 5.5、50 mmol/L L-Glu溶液液面10 cm以下，于室溫放置浸吸1 h，摘取辣木葉，將葉片于35 ℃保溫7 h，（103±2）℃烘干至恒量，提取并分析GABA含量。以未經(jīng)富集處理而直接于" （103±2）" ℃烘干至恒量的辣木葉作為空白對(duì)照。

1.5" 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以3次平行試驗(yàn)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，通過IBM SPSS Statistics 19.0軟件，運(yùn)用單因素方差分析（ANOVA）的Duncan（D）法和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Microsoft excel 2010軟件繪圖。圖表中用相同英文字母代表兩組間差異不顯著（P＞0.05），不同英文字母代表兩組間差異顯著（P＜0.05）。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 辣木葉GAD性質(zhì)研究

2.1.1" 溫度對(duì)辣木葉GAD反應(yīng)活性及穩(wěn)定性的影響" 圖1-A顯示，辣木葉GAD活力在30～" 40 ℃隨著溫度升高而增加，超過40 ℃則GAD活力快速下降，最適反應(yīng)溫度為40 ℃。圖1-B顯示，當(dāng)辣木葉GAD在pH 6.0、0.2 mol/L PBS緩沖液中于4～30 ℃保溫3 h，活力無顯著差異" （P＞0.05），保存溫度超過30 ℃則GAD逐漸失活，殘余GAD活力隨保存溫度升高而下降，說明辣木葉GAD在4～30 ℃相對(duì)較穩(wěn)定。結(jié)果表明，辣木葉GAD對(duì)溫度依賴性較高，GAD的表觀活力是溫度對(duì)GAD的催化反應(yīng)活力和穩(wěn)定性綜合影響的結(jié)果。在一定溫度范圍內(nèi)，GAD活力隨溫度升高而增強(qiáng)，但溫度升高則會(huì)造成GAD穩(wěn)定性下降，這可能是溫度超過40 ℃則GAD活力快速下降（圖1-A）的原因。

2.1.2" pH對(duì)辣木葉GAD反應(yīng)活性及穩(wěn)定性的影響" 經(jīng)對(duì)辣木葉GAD的pH依賴性進(jìn)行分析，結(jié)果表明辣木葉GAD活力在pH 5.2～6.0隨著pH升高而增加，超過pH 6.0則GAD活力快速下降，最適反應(yīng)pH為6.0（圖2-A）；pH對(duì)辣木葉GAD 穩(wěn)定性影響較大，當(dāng)在不同pH條件下于" 40 ℃保溫3 h，pH 6.0組的殘余GAD活力最大，偏離pH 6.0則GAD失活較顯著（P＜0.05），當(dāng)pH 小于5.6或pH 大于6.4時(shí)，殘余GAD活力降低到pH 6.0組GAD活力的80%以下，說明辣木葉GAD穩(wěn)定pH范圍較窄，在pH 5.6～6.4相對(duì)較穩(wěn)定（圖1-B）。辣木葉GAD的最適反應(yīng)pH（6.0）與GAD穩(wěn)定pH（6.0）一致，結(jié)果也表明辣木葉GAD的穩(wěn)定性是酶催化反應(yīng)活力的基礎(chǔ)。

2.2" 辣木葉GABA富集條件研究

2.2.1" 不同方法對(duì)辣木葉GABA富集的影響" 圖3表明，破碎法富集GABA并不夠理想，GABA含量?jī)H由（1.93±0.11） mg/g增加到了" （2.51±0.21） mg/g，只提高了30.05%。而通過導(dǎo)管法富集，辣木葉GABA的含量達(dá)到了" （4.28±0.24） mg/g，GABA含量是富集前的" 2.22倍、破碎法的1.71倍，有望通過條件優(yōu)化進(jìn)一步提升GABA含量。因此，選擇導(dǎo)管法作為辣木葉GABA的富集方法。

2.2.2" L-Glu溶液pH對(duì)辣木葉GABA富集的影響" 從圖4可見，當(dāng)L-Glu溶液pH為5.5時(shí)，辣木葉GABA含量最高，為（5.87±0.32） mg/g；當(dāng)L-Glu溶液pH低于或高于5.5時(shí)，辣木葉GABA含量均呈顯著下降（P＜0.05）。因此，選擇L-Glu溶液的pH為5.5。

2.2.3" L-Glu濃度對(duì)辣木葉GABA富集的影響" 圖5表明隨著L-Glu濃度增加，辣木葉GABA含量呈現(xiàn)先增加而逐步趨于平穩(wěn)，當(dāng)L-Glu濃度超過50 mmol/L時(shí)，辣木葉GABA含量增加不顯著（P＞0.05）。因此，選擇L-Glu濃度為50 mmol/L較為適宜。

2.2.4" 浸吸時(shí)間對(duì)辣木葉GABA富集的影響" 從圖6可見，浸吸時(shí)間在1～12 h，辣木葉GABA含量隨著浸吸時(shí)間增加而略有增加，但差異不顯著（P＞0.05）。因此，選擇浸吸1 h即可。

2.2.5" 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)辣木葉GABA富集的影響" 圖7顯示，辣木葉GABA含量隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間增加而增加，但轉(zhuǎn)化反應(yīng)6 h后，繼續(xù)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間，辣木葉GABA含量增加不顯著（P＞0.05）。因此，從工藝成本角度考慮，選擇轉(zhuǎn)化時(shí)間為6 h。

2.2.6" 轉(zhuǎn)化溫度對(duì)辣木葉GABA富集的影響" 圖8顯示，當(dāng)富集溫度為35" ℃時(shí)，辣木葉GABA含量最高；超過35" ℃，辣木葉GABA含量則隨溫度升高而減少，各試驗(yàn)組GABA含量差異顯著（P＜0.05）。因此選擇辣木葉富集GABA的溫度為35 ℃較為適宜。

2.2.7" 正交試驗(yàn)" 正交試驗(yàn)結(jié)果如表2。極差分析表明各因素的R均大于空列R，說明各因素的水平效應(yīng)存在差異，各試驗(yàn)因素的效應(yīng)可靠，各因素與辣木葉GABA含量的關(guān)系如圖9。表2表明影響辣木葉富集GABA的主次因素為Agt;" Bgt;C，最優(yōu)水平為A1B2C3，即L-Glu溶液pH為5.5、轉(zhuǎn)化溫度為35" ℃、轉(zhuǎn)化時(shí)間為7 h。

2.2.8" 驗(yàn)證試驗(yàn)" 按照單因素和正交試驗(yàn)的優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明：經(jīng)過富集，辣木葉GABA含量由初始（1.86±0.13） mg/g增加至（5.97±0.36） mg/g，提高了2.21倍，差異顯著（P＜0.05）（圖10）。以優(yōu)化條件（即A1B2C3）富集的辣木葉GABA含量［（5.97±0.36） mg/g］略高于正交試驗(yàn)中GABA含量最高的試驗(yàn)組［試驗(yàn)號(hào)2，即A1B2C2（5.73±0.37） mg/g］，但差異不顯著（P＞0.05）。圖7顯示，雖然轉(zhuǎn)化反應(yīng)6～8 h的辣木葉GABA含量差異不顯著，但均值仍呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與圖7相符。雖然轉(zhuǎn)化反應(yīng)6 h和7 h的GABA差異不顯著，但GABA含量均值仍以7 h較高，為了保證富集產(chǎn)品GABA含量的穩(wěn)定性，選擇轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間" 7 h較為適宜。由此確定辣木葉富集GABA的適宜條件為：L-Glu溶液pH為5.5，L-Glu濃度" 50 mmol/L，浸吸時(shí)間1 h，轉(zhuǎn)化溫度35 ℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間7 h。

3" 討論與結(jié)論

可食植物富集GABA的根本目的是增加食材GABA含量，以利于開發(fā)富GABA食品，提升食品的功能性。辣木葉含有GAD，因此可以補(bǔ)充外源L-Glu，利用辣木葉內(nèi)源GAD的催化作用實(shí)現(xiàn)GABA的富集。理論上，將辣木葉破碎（破碎法），可以釋放細(xì)胞內(nèi)的GAD，直接轉(zhuǎn)化外源" L-Glu。然而，本研究表明破碎法富集GABA并不理想，GABA含量?jī)H提高了30.05%（圖3）。辣木葉破碎后，破壞了葉片組織的天然屏障，GAD更易與氧氣、蛋白酶接觸而受到破壞，而且組織的破壞也釋放了下游代謝GABA的酶（如γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶），增加了GABA的代謝損失，這可能是GABA富集效果欠佳的主要原因，具體原因尚待進(jìn)一步研究。

由于破碎法破壞了葉片結(jié)構(gòu)，因此只適合開發(fā)富GABA的辣木葉粉或以辣木葉粉為基料的產(chǎn)品，在需保持原有食材的外貌特征、結(jié)構(gòu)和風(fēng)味類的產(chǎn)品（如辣木茶）開發(fā)方面存在較大局限。植物導(dǎo)管是植物體內(nèi)木質(zhì)部中主要輸導(dǎo)水分和無機(jī)鹽的管狀結(jié)構(gòu)［40］。辣木葉表皮氣孔和維管束較發(fā)達(dá)，葉柄和莖導(dǎo)管種類繁多，具有強(qiáng)大的輸導(dǎo)功能［41］。采用扦插方式可以通過枝條的導(dǎo)管將溶液中的L-Glu分布到辣木葉細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)外源L-Glu的無損補(bǔ)充，從而可以利用葉細(xì)胞的保護(hù)作用，充分發(fā)揮GAD催化作用，實(shí)現(xiàn)GABA富集。通過導(dǎo)管法進(jìn)行富集，辣木葉GABA的含量得到大幅提升，富集效果優(yōu)于破碎法（圖3）。

由于L-Glu發(fā)生α-脫羧作用生成GABA會(huì)消耗H+，從而造成pH升高［42］，進(jìn)而降低GAD的轉(zhuǎn)化活力。在GAD活力測(cè)定中可以使用PBS緩沖液進(jìn)行pH內(nèi)源控制，然而如在辣木葉中引入PBS緩沖液將因增加葉片磷酸鹽含量而影響辣木葉的品質(zhì)。由于缺乏緩沖體系，需要更低的初始pH抵消轉(zhuǎn)化反應(yīng)消耗的H+，才能保證GAD在高活力依賴的反應(yīng)pH范圍內(nèi)發(fā)揮催化作用，因此辣木葉富集GABA的適宜初始pH（pH 5.5，圖4）低于辣木葉GAD最適反應(yīng)pH（pH 6.0，圖2-A）。

除了酶的反應(yīng)活性，酶的穩(wěn)定性也是影響酶應(yīng)用效率的關(guān)鍵因素。酶法合成效率是酶反應(yīng)活力和酶穩(wěn)定性綜合效應(yīng)作用的結(jié)果。由于富集轉(zhuǎn)化時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，溫度對(duì)GAD穩(wěn)定性的影響將更為突出。圖1-B顯示當(dāng)溫度超過30 ℃則GAD逐漸失活，辣木葉富集GABA的最適轉(zhuǎn)化溫度（35 ℃，圖8）低于辣木葉GAD最適反應(yīng)溫度" （40 ℃，圖1-A），與溫度對(duì)GAD穩(wěn)定性的影響相關(guān)。

動(dòng)物、植物和微生物均存在催化GABA代謝的γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶［43-45］，植物γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶最適反應(yīng)pH一般高于GAD［44］，隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間延長(zhǎng)，消耗H+增加［42］，葉片內(nèi)環(huán)境pH升高，如pH達(dá)到γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶催化活力范圍，將加快GABA的代謝。因此，γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的酶學(xué)性質(zhì)對(duì)植物GABA的富集也具有很好的參考價(jià)值，但目前尚鮮見關(guān)于辣木葉γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶酶學(xué)性質(zhì)的研究報(bào)道。

本研究利用植物導(dǎo)管功能，可有效將外源L-Glu均勻分布到辣木葉細(xì)胞，并結(jié)合辣木葉內(nèi)源GAD的酶學(xué)性質(zhì)，在不破壞辣木葉原有形態(tài)和結(jié)構(gòu)的條件下實(shí)現(xiàn)了辣木葉GABA無損富集。適宜富集方法為：將鮮辣木枝條切口端插入" pH 5.5、50 mmol/L L-Glu溶液液面10 cm以下，于室溫放置浸吸1 h，摘取辣木葉，將葉片于35 ℃保溫7 h。通過該法富集，辣木葉GABA含量由初始（1.86±0.13） mg/g增加至（5.97±" 0.36） mg/g，提高了2.21倍。本研究的富集方法操作簡(jiǎn)單，能耗和設(shè)備要求低，工藝條件容易滿足，在富GABA辣木葉產(chǎn)品和其他茶品的開發(fā)方面具有很好的應(yīng)用前景。該富集方法對(duì)其他富GABA葉莖類產(chǎn)品開發(fā)也具有很好的參考價(jià)值。

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Enrichment Method for γ-Aminobutyric Acid in Moringa oleifera" Leaves

YANG Shengyuan，PENG Yuanhuai，ZHANG Shiqi，YANG Juan， JIANG Min and WANG Biaoshi

（College of Food Science and Engineering，Lingnan Normal University，Zhanjiang Guangdong" 524048，China）

Abstract" To increase the content of γ-aminobutyric acid （GABA） in Moringa oleifera" leaves，exogenous L-glutamic acid （L-Glu） was supplied to the leaf cells through the vessel of Moringa oleifera" branches.Using the GABA content in dried leaves as the evaluation indicator，the optimal conditions for the GABA enrichment in Moringa oleifera" leaves using plant vessel method were investigated，taking into account the enzyme characteristics of glutamate decarboxylase （GAD） of Moringa oleifera" leaf，pH and concentration of L-Glu solution，soaking time，conversion reaction time and temperature.The results indicated that the Moringa oleifera" leaf GAD exhibited the highest reactivity at 40 ℃ and pH 6.0，and remained relatively stable in the range of 4-30" ℃ and pH 5.6-6.4.Due to the protection provied by cell，the enrichment efficiency of the plant vessel method （supplementing exogenous L-Glu through the plant vessel） was better than that of the crushing method （crushing the leaves to release GAD for converting exogenous L-Glu to GABA）.The GABA content in Moringa oleifera" leaves enriched by plant vessel method was 1.71 times higher than that obtained with the crushing method.When the cut ends of fresh branches were inserted into pH 5.5 L-Glu solution （50 mmol/L） at room temperature for 1 h，the Moringa oleifera" leaves were plucked and then incubated at 35 ℃ for 7 h，the GABA content of Moringa oleifera" leaves increased from the initial level of （1.86 ± 0.13） mg/g to （5.97 ± 0.36） mg/g，which was increased 2.21 times.Considering the simplicity of the GABA enrichment process through plant vessel method，it has a good application prospect in the development of GABA-rich Moringa oleifera" leaf products.

Key words" Moringa oleifera; Gamma-aminobutyric acid; Glutamate decarboxylase; Plant vessel; Enrichment

Received"" 2023-08-24""" Returned" 2023-11-06

Foundation item" Research Capacity Enhancement Project for Key Construction Discipline of Guangdong Province （No.2022ZDJS079）; the Characteristic Innovation Project for Universities of Guangdong Province （No.2022KTSCX073）; the Natural Science Foundation of Guangdong Province"" （No.2022A1515010360）; Characteristic Specialty Project for Teaching Quality and Teaching Reform Engineering in Universities of Guangdong Province （No.2022KTSCX073）.

First author" YANG Shengyuan，male，Ph.D，professor.Research area： green biological manufacturing.E-mail：yangsy1972@163.com

（責(zé)任編輯：史亞歌" Responsible editor：SHI Yage）