陸地棉環核苷酸離子通道蛋白基因 GhCNGC8克隆及初步表達分析

摘 要 為明確環核苷酸門控離子通道蛋白基因GhCNCG8對棉花抗逆方面的作用。利用棉花葉片克隆獲得該基因，生物信息學方法分析其理化性質、結構和進化關系，利用qRT-PCR（實時熒光定量）方法分析基因在黃萎病菌、干旱、鹽脅迫以及激素誘導下GhCNCG8表達模式和組織表達特異性；構建該基因VIGS沉默載體，利用農桿菌介導方法轉化該基因到棉花葉片中，熒光定量PCR方法檢測沉默效率。以棉花葉片cDNA為模板成功克隆GhCNGC8基因，該基因開放閱讀框為2 247 bp，編碼748 個氨基酸。進化樹分析結果表明，陸地棉GhCNGC8基因與擬南芥AtCNGC8基因關系較近，多序列結果比對顯示，GhCNGC8蛋白結構符合CNGCs家族蛋白結構特征。qRT-PCR結果表明，該基因對黃萎病、干旱、鹽處理等脅迫及茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）和雙氧水（H₂O₂）處理均有一定程度的響應，qRT-PCR分析結果表明，GhCNGC8基因在根、莖、葉、花、萼片和苞片中均有表達，葉中表達量最高。構建該基因的VIGS沉默載體轉化棉花，qRT-PCR結果表明，該基因在棉花中已經沉默，表達量相比對照植株降低70%左右，表明GhCNGC8沉默載體構建成功并在棉花體內正常運行，GhCNGC8可能在棉花抗逆方面發揮重要作用。

關鍵詞 棉花；GhCNGC8；基因克隆；表達分析；載體構建

環核苷酸門控離子通道（CNGCs）蛋白廣泛存在于動植物體內，是鈣離子傳播途徑之一。鈣離子（Ca²⁺）是一種重要的第二信使，在植物中調節多種信號途徑，如激素、病原菌、鹽脅迫、光信號和晝夜節律。CNGCs是非選擇性陽離子通道蛋白，由2 個或3 個不同類型的亞基形成異四聚體復合體，由環核苷酸（cAMP和cGMP）直接結合打開，并依賴Ca²⁺被鈣調素和磷酸化所調節^[1]。在植物中，CNGC由6 個跨膜（TM）結構域、位于第5和第6跨膜結構域之間的P環和鈣調素結構域（CaMBD）以及環核苷酸結構域（CNBD）構成。環核苷酸（cNMP）是植物體內一種重要的第二信使，可以與CNBD相結合，從而激活CNGCs，促胞外Ca²⁺內流；當細胞內Ca²⁺過多時，CaM會結合到CaMBD處，從而鈍化CNGC蛋白活性，抑制胞外Ca²⁺內流^[2]。

作為一種陽離子通道蛋白，CNGC蛋白介導鈣離子在細胞溶質中的積累以及將外部光學和氣味信號轉化為生物電信號^[3-4]。在擬南芥中，AtCNGCs 參與了各種生物過程，調節生長和發育的不同方面，以及生物和非生物應激反應，如根毛尖生長、葉片生長和衰老、花的轉變、花粉的極化生長、離子攝取和穩態，以及應對病原體和食草動物的攻擊^[5-6]。對低結實率的水稻突變體（sss1-D）研究表明， OsCNGC13可以通過促進花粉管在花柱組織中的生長來促進結實率。GhCNGCs基因家族廣泛參與植物抗逆脅迫適應過程，在調節生物生長發育和環境響應方面發揮重要作用^[7]。在水稻中，對一個天然突變體cds1的分離和鑒定表明， OsCNGC9介導細胞質鈣離子升高，正向調控對稻瘟病的抗性^[8]。在棉花中， GhCNGC1沉默增強了抗黃萎病和耐鹽性， GhCNGC12沉默的植株則降低了對黃萎病和耐鹽性的抗性^[9]。目前對 GhCNGC8在棉花中的抗逆研究較少。病毒誘導的基因沉默技術（Virus-induced gene silencing， VIGS）是近年來發展迅速且應用廣泛的一項RNA沉默技術^[10]。VIGS技術不同于傳統的植物基因功能研究方法，因其無需遺傳轉化及突變體獲取，又具有操作簡單、成本低、速度快、高通量等優勢，已經成為開展基因功能研究最常用的技術手段之一。

棉花在全世界廣泛種植，是天然纖維的主要來源，具有重要的經濟價值。棉花在其生長周期中會遭遇各種生物脅迫和非生物脅迫，對其產量和品質造成巨大影響。發掘棉花抗逆相關基因并利用轉基因手段創制抗性新種質對于棉花抗性育種具有重要意義。本研究從棉花葉片中克隆得到GhCNGC8基因，通過熒光定量PCR法分析該基因在棉花受到不同逆境脅迫和激素處理時的表達模式。同時構建該基因的 VIGS 沉默載體并通過農桿菌介導侵染棉花獲得沉默植株，為進一步驗證棉花 GhCNGC8基因的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為TM-1，由新疆農業科學院核技術生物技術研究所農作物生物技術重點實驗室提供。大腸桿菌菌種DH5α、農桿菌菌種GV3101、BP反應入門載體、VIGS干涉技術載體pTRV1和pTRV2等均屬于商品化菌株或載體。質粒提取試劑盒、oligo（dT）18、RNAase抑制劑、dNTP、pMD18-T Vector、T4-DNA連接酶、內切酶EcoRI和KpnI、ExTaq酶、PCR產物回收試劑盒等均為TaKaRa公司產品，熒光定量PCR試劑盒為TOYOBO公司產品；卡那霉素、慶大霉素、MES、乙酰丁香酮、MgCl₂ 及培養基配制等化學試劑均為國產分析純。

1.2 方 法

1.2.1 棉花種植及脅迫和激素處理

將TM-1棉花種子水中浸泡24 h后播種于營養土中，12 h光照/12 h黑暗，溫度為26" ℃～28" ℃光照培養。濕度保持在60%及以上，7 d澆1次水，在幼苗兩葉一心時選取長勢及大小一致的棉苗，黃萎病菌脅迫處理參照邵武奎等^[11] 的方法，鹽處理參照李月等^[12]的方法，干旱處理參照王娜等^[13]的方法，激素處理分別用200" μmol/L茉莉酸、2 mmol/L水楊酸、1 mmol/L H₂O₂處理10 min、清水（MOCK）浸泡棉苗根系之后將棉苗繼續種植于營養缽中。各組處理均在0.5 h、1 h、 3 h等時間點取棉花根系，提取RNA后反轉錄為cDNA進行表達模式分析。

1.2.2 棉花總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成

將液氮內收集的各組織在研缽中研磨成粉末，使用北京天根公司的RNAperp Pure Plant Kit提取試劑盒提取RNA，提取步驟參照說明書。RNA 的質量和完整性使用 Thermo Scientific（NanoDrop 1000）核酸分析儀和1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。選擇高質量的 RNA 進行反轉錄。使用全式金公司Removal and cDNA Synthesis Super Mix試劑盒進行cDNA第一鏈的合成，具體步驟參照說明書。

1.2.3 陸地棉" GhCNGC8基因的克隆及生物信息學分析

根據筆者前期的轉錄組數據，使用Primer 5軟件設計特異性引物，以上述棉花葉片cDNA作為模板，使用高保真聚合酶TransStart FastPfu DNA Polymerase進行PCR擴增。PCR擴增體系為：高保真聚合酶1 μL、正向引物1 μL、反向引物 1 μL、Buffer 10 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、cDNA 1 μL 和 dd H₂O 補齊至 50 μL。PCR 擴增程序：95" ℃ 2 min；98" ℃ 20 s，57" ℃ 30 s，72" ℃ 120 s，循環 35 次；72" ℃ 5 min；4" ℃ 保存。擴增產物經過1 %凝膠電泳檢測后，回收目的條帶，連接 pEASY-Blunt-Zero 克隆載體，轉化到大腸桿菌感受態細胞中，挑選單克隆提取質粒進行酶切鑒定，將正確陽性質粒送至上海生工公司進行測序。

GhCNGC8蛋白質理化性質預測利用網站（http：//web.expasy.org/protparam/）進行在線程序計算 。蛋白質信號肽預測分析使用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在線程序。跨膜結構利用在線軟件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）進行預測。選取擬南芥AtCNGC8（NP_001323012.1）、陸地棉GhCNGC8（Gh_A05G1012.1）、黃褐棉GmCNGC8（XP_040874262.1）、玉米ZmCNGC8（NP_001152538.2）、小麥TaCNGC8（XP_044377681.1）、水稻OsCNGC8（XP_015612168.1）、海島棉GbCNGC8（KAB2081333.1）、雷蒙德氏棉GrCNGC8（XP_012448061.1）、樹棉GaCNGC8（XP_017605331.1），利用MEGA11和GENE DOC軟件進行序列多重比對，利用MAGA11軟件構建系統進化樹，并利用Bootstrap對各分支可靠性進行檢測。

1.2.4 熒光定量PCR

通過Primer 5軟件設計 GhCNGC8特異性檢測引物。以cDNA為模板，" UBQ7基因^[14]為內參基因，使用ABI Step one 系統，采用北京全式金公司TransScript Green One-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒進行熒光定量PCR，依據目的基因和內參基因Ct值，利用2^-ΔΔCt 法計算基因的相對表達量^[15]。目的基因和內參基因熒光定量引物見表1。

1.2.5 陸地棉GhCNGC8基因片段克隆和VIGS載體構建

載體構建參照李名江等^[16]和胡子曜等^[17]進行。根據棉花 GhCNGC8序列，目的基因靶標序列利用SGN-VIGS 在線軟件（https：//vigs.solgenomics.net）設計完成。在其上下游片段5′端分別引入EcoRI 和 KpnI酶切位點，以棉花cDNA片段為模板，擴增得到目的片段。將目的片段連接到‘B-Zero’克隆載體上，構建重組載體 B-Zero- GhCNGC8，并轉化入大腸桿菌Trans-T1感受態細胞，涂板后挑單克隆進行菌液PCR，然后進行雙酶切鑒定。挑選正確質粒送上海生工進行測序。提取測序正確的質粒和煙草脆裂病毒 pTRV2 空載體質粒，雙酶切后回收目的片段和線性化pTRV2質粒， 目的片段與線性質粒使用T4連接酶進行4 ℃過夜連接，將構建好的載體轉入大腸桿菌Trans-T1 感受態細胞并進行酶切驗證，提取質粒并采用凍融法轉入‘GV3101’農桿菌感受態細胞，挑選單克隆進行PCR驗證。將驗證正確的農桿菌擴繁并加入70%的甘油，保存于-80 ℃，備用。

1.2.6 農桿菌介導的VIGS侵染棉花及沉默效率檢測

參照李秀青等^[18]的方法將重組質粒TVR2- GhCNGC8、陽性對照TVR2-CLA1和陰性對照（TRV2）與TVR1 按照同濃度按體積1∶1混合侵染棉花葉片，侵染棉花葉片15 d左右，陽性對照TVR2-CLA1出現葉綠素缺失導致的白化表型，拍照記錄。取陰性對照和試驗組第二片真葉，每個樣本取3個技術重復。提取RNA并反轉錄為cDNA。利用熒光定量方法檢測沉默效率，檢測引物見表1。

2 結果與分析

2.1 GhCNGC8基因克隆和生物信息學分析

以陸地棉遺傳標準系TM-1的葉片cDNA為模板進行PCR擴增，擴增片段大小符合預期（圖1）。經測序，結果與目標基因轉錄組拼接數據一致，表明該目的片段為目標基因GhCNGC8（Gh_A05G1012）。表2為棉花" GhCNGC8的生物信息學分析，從表中可以看出，該基因開放閱讀框為2 247 bp，編碼748個氨基酸，相對分子質量85.93 ku，理論等電點8.95，平均疏水性為負值，表明該蛋白為堿性親水性蛋白，擁有信號肽的概率為0.002 5，亞細胞定位預測結果顯示該蛋白定位在細胞膜上。由圖2可知， 多重序列比對顯示該蛋白含有6個跨膜（TM）結構域、1個p環，該蛋白質C端含有鈣調素結構域（CaMBD）、環核苷酸結構域（CNBD）和CaM結合位點異亮氨酸-谷氨酸胺IQ，符合CNGCs結構特征。系統進化樹分析結果表明（圖3），GhCNGC8蛋白與其他棉花種關系同源性最高，其次與擬南芥AtCNGC8同源性較高。

[2.2 GhCNGC8基因的表達模式分析

利用qRT-PCR技術檢測 GhCNGC8在不同處理下的表達模式，結果表明，GhCNGC8基因對不同脅迫處理及激素處理均有應答反應。從圖4-A可以看出，在黃萎病菌處理下， GhCNGC8表達量先增加后降低，在2 h處理下最高，極顯著高于對照。在鹽脅迫處理下， GhCNGC8表達量呈現先增高后降低的趨勢，0.5 h處理最高，顯著高于對照，與0 h相比，0.5 h表達量增高1.5 倍（圖4-B）。在干旱處理下，GhCNGC8表達量呈先增高后降低，0.5 h表達量最高，0 h和24 h表達量基本一致，低于其他時間（圖4-C）。水楊酸處理下，隨著處理時間延長， GhCNGC8的表達量顯著增加，與0 h相比，3 h表達量增加2.5倍（圖4-D）。在茉莉酸處理下，GhCNGC8表達量有一定程度下降，與0 h相比，GhCNGC8表達量在3 h下降0.6倍（圖4-E），與對照相比，0.5 h和3 h有顯著性差異。與黃萎病處理相同，H2O2處理下 GhCNGC8表達量先增加后降低，與0 h相比，1 h表達量上升4.3倍（圖4-F）。 GhCNGC8在不同組織中的表達變化表明， GhCNGC8基因在葉、花和苞片中表達量較高，葉中表達量最高，根、莖和萼片中處于低水平表達（圖4-G），表明該基因存在組織表達特異性。

2.3 GhCNGC8沉默載體構建和技術驗證

利用增加酶切位點引物將 GhCNGC8靶序列進行PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證后表明大小符合預期（圖5-A），將目標序列克隆并測序，結果與目標片段一致。經EcoRI和KpnI酶切陽性質粒后將目標片段連接到VIGS沉默載體中，進行雙酶切驗證，出現兩條目標條帶（圖5-B），一條遠超2 000 bp，另一條約在250左右，結果符合預期，說明VIGS載體構建成功。將構建好的VIGS載體轉入到農桿菌中。

待棉花第一片真葉未出現之前，將TRV：GhCNGC8、TRV：CLA1、TRV：RNA2與TRV：RNA1相同濃度等體積混合，用注射器注射到棉花子葉中，兩周后觀察棉花表型，發現新長出的棉花真葉已經白化（圖6-A），此時利用qRT-PCR技術檢測"GhCNGC8在棉花體內的表達量，結果表明，GhCNGC8的表達量已經遠低于對照水平（圖6-B）。證明構建好的VIGS載體已經在棉花體內正常運行，成功獲得了GhCNGC8沉默植株。

3 討" 論

植物CNGC家族在發育和應對外界非生物脅迫方面發揮重要作用，包括冷、熱、干旱、激素、光周期和共生現象^[19]。有關研究證明CNGC家族是控制細胞內鈣庫進入胞質內外的主要途徑，和多種植物抗逆活動相關聯^[20]。前人研究表明，擬南芥CNGC6通過促進高溫脅迫下Ca²⁺流入細胞質，中度高溫會提高細胞質中cAMP（cyclic adenosine monophosphate）水平^[21]。沉默棉花 GhCNGC82和 GhCNGC31的表達減弱了棉花對黃萎病抗性和耐鹽性^[9]。 OsCNGC9能介導胞質鈣升高，正向調控水稻稻瘟病抗性， OsCNGC9過表達增強了水稻PTI（病原體相關分子模式（PAMP）觸發免疫）和稻瘟病抗性^[22]。前人研究表明^[23]，CNGC家族基因在調控棉花抗逆方面具

有差異表達和功能多樣性。有關棉花GhCNGC8相關的抗逆研究較少。本研究從轉錄組數據中獲得一個棉花抗逆基因 GhCNGC8。利用同源克隆技術得到該基因，其開放閱讀框為2 247 bp，編碼748個氨基酸，通過分析其理化性質得到該基因分子質量85.93 ku，理論等電點位8.95，平均疏水性為負值，表明該蛋白為堿性親水性蛋白，利用在線軟件分析得到該蛋白擁有信號肽的概率為0.002 5，推測該蛋白不含信號肽，不屬于分泌蛋白，亞細胞定位預測結果顯示該蛋白定位在細胞膜上。植物CNGC結構包括6個跨膜結構域 （S1～S6），其中S4區域發揮電壓傳感器作用^[24]。環核苷酸結構域（CNBD）位于C末端，由3個α螺旋和2個β折疊構成。植物鈣調素結構域（CaMBD）同樣位于C端，且序列分析證明和CNBD存在一定程度重疊，不同CNGC基因CaMBD數量有所不同，如AtCNGC12發現3個CaMBDs，這可能和CNGC功能有關^[25]。多序列比對顯示該蛋白含有6個跨膜（TM）結構域、一個p環，該蛋白質C端含有CaMBD、（CNBD）和CaM結合位點異亮氨酸-谷氨酸胺IQ，符合CNGCs基本結構特征。進化樹分析表明該基因與擬南芥 AtCNGC8關系較近。

前人研究證明，植物誘導蛋白的表達通常和耐受性相關，基因表達模式通常是功能的指標^[26]。本研究通過qRT-PCR技術探究了 GhCNGC8基因在不同組織以及黃萎病、鹽脅迫和干旱等3種脅迫下的表達模式。GhCNGC8在不同組織特異性表達，在一定程度上可以反應該基因在棉花生長發育中的作用，該基因在棉花根、莖、葉片、花、萼片和苞片中均有表達，推測該基因可能在棉花生長發育中發揮重要作用。前人研究表明擬南芥 AtCNGC2和AtCNGC4在調節花轉變、花粉生長和花粉管伸長發揮重要作用^[27]。該基因在葉和花中表達量顯著高于其他組織，花中表達量較高暗示該基因可能與棉花生殖生長有關。本研究表明 GhCGNC8棉花轉錄本受黃萎病菌、鹽脅迫和干旱等脅迫處理影響，且在不同處理下存在一定差異， CNGC家族作為一種鈣離子通道蛋白，可能在植物調控抗逆信號網絡中存在重要作用，該基因在黃萎病菌處理下反應最為強烈，建議后續研究主要關注該基因與黃萎病的關系。

植物在應對外界脅迫過程中激素起到了重要信號轉導的作用，JA、SA作為核心成員是目前研究最多的兩條防衛途徑。前人研究表明，茉莉酸信號通路中LOX、AOS、 MYC2等基因與黃萎病呈正相關，棉花植株在感染黃萎病后體內也聚集了大量的茉莉酸^[28]。水楊酸通過調節NPR3和NPR4介導的NPR1的降解，將其保持在適當水平調控植物免疫應答反應^[29]。低濃度過氧化氫作為一種信號分子，可以觸發植物對各種外界脅迫的抗性^[30]。本研究分析了3種激素誘導下該基因的表達情況，結果表明，在H2O2處理下，GhCNGC8表達量顯著性增加，與0 h相比，1 h表達量增加5倍。在水楊酸處理下， GhCNGC8表達量同樣顯著性增加。Chen等^[31]發現，陸地棉GhCNGC4表達量受到水楊酸處理時顯著性增加，茉莉酸處理對 GhCNGC4表達量沒有顯著性影響。GhCNGC40受到茉莉酸和水楊酸處理后表達量呈顯著性下降^[9]，上述結果與本研究有所不同，可能與CNGC家族基因功能復雜性有關。CNGC家族不同成員的抗逆分子模式相同，但在抗逆作用中存在冗余現象^[32]。該基因與水楊酸和雙氧水關系較為密切，推測該基因可能通過調節水楊酸和雙氧水激素信號通路途徑調節GhCNGC8抗逆功能。

4 結" 論

本研究克隆得到棉花環核苷酸門控離子通道蛋白基因GhCNGC8，生物信息學分析得到該基因開放閱讀框為2 247 bp，編碼748個氨基酸。系統進化樹分析表明該基因與擬南芥AtCNGC8關系較近，多重序列比對顯示該蛋白含有6個跨膜（TM）結構域、一個p環，該蛋白質C端含有鈣調素結構域（CaMBD）、環核苷酸結構域（CNBD）和CaM結合位點異亮氨酸-谷氨酸胺IQ，符合CNGCs結構特征。GhCNGC8[QX）]在棉花根、莖、葉、花、萼片和苞片中均有表達，且在葉中表達量最高。該基因響應黃萎病菌、鹽和干旱等逆境脅迫，同時對茉莉酸、水楊酸和H2O2等信號分子也有不同程度反應。

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Molecular Cloning and Preliminary Expression Analysis of [QX（Y15] GhCNGC8[QX）] Gene in Gossypium hirsutum

ZHAO Zhun¹，HU Wenran¹，SHAO Wukui^1，2" and" HUANG Quansheng¹

（1.Institute of Nuclear Technology and Biotechnology， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Key Laboratory" of Crop Biotechnology of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830091，China; 2.College of" Life Sciences，Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052，China）

Abstract To investigate the role of the [QX（Y15] GhCNGC8[QX）] gene in cotton stress resistance， we cloned it from cotton leaves using PCR and utilized bioinformatics methods to analyze its physicochemical properties， structure， and evolutionary relationships. We used qRT-PCR to analyze the expression patterns of [QX（Y15] GhCNGC8[QX）]"" under various various stress conditions， including infection by Fusarium wilt pathogen， drought， salt stress， and hormone induction， as well as its tissue-specific expression.We constructed a VIGS vector targeting this gene and transformed it into cotton leaves using Agrobacterium-mediated methods. The gene silencing efficiency was assessed using quantitative fluorescence PCR. The [QX（Y15] GhCNGC8[QX）] gene was successfully cloned from cotton leaf cDNA， possessing an open reading frame of 2 247 bp that encodes 748 amino acids. Phylogenetic analysis indicated a close relationship between the upland cotton [QX（Y15] GhCNGC8[QX）] gene and the Arabidopsis [QX（Y15] AtCNGC8[QX）] gene. Multiple sequence alignment revealed that the [QX（Y15] GhCNGC8[QX）] protein conforms to the structural characteristics of CNGC family proteins. qRT-PCR results showed that the gene responded to Fusarium wilt， drought， salt stress， as well as jasmonic acid， salicylic acid， and hydrogen peroxide treatments to varying degrees. The [QX（Y15] GhCNGC8[QX）] gene expression was detected in roots， stems， leaves， flowers， sepals， and bracts， with the highest expression in leaves. Transformation of the [QX（Y15] GhCNGC8[QX）] gene VIGS silencing vector into cotton resulted in successful silencing， with expression levels reduced by approximately 70% compared to control， confirming the successful construction and normal operation in cotton. GhCNGC8 may play a significant role in cotton stress resistance.

Key words Cotton；GhCNGC8；Gene cloning；Expression analysis；Vector construction

Received" 2023-11-01""" Returned 2024-02-29

Foundation item Open Project for Key Laboratories of Xinjiang Uygur Autonomous Region （No.2022D04008）;Construction Project for the State Key Laboratory for Stress Resistance Genetic Improvement and Germplasm Innovation of Crops in Arid Desert Region （No.ZYYD2022B07）.

First author ZHAO Zhun， male， assistant research fellow. Research area： cotton molecular biology breeding. E-mail： 1790998478@qq.com

Corresponding"" author HUANG" Quansheng， male， research fellow.Research area： crop stress tolerance mechanisms. E-mail： hquansheng@126.com

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）

基金項目：新疆重點實驗室開放課題項目（2022D04008）；省部共建干旱荒漠區作物抗逆遺傳改良與種質創新國家重點實驗室培育建設項目（ZYYD2022B07）。

第一作者：趙 準，男，助理研究員，主要從事棉花分子生物育種。E-mail：1790998478@qq.com

通信作者：黃全生，男，研究員，主要從事作物耐逆機制研究。E-mail：hquansheng@126.com