新疆野蘋果種子 MsWRKY33基因的克隆、亞細胞定位及表達分析

摘 要 WRKY轉錄因子能夠通過調節種子休眠和發芽來適當介導生命周期的啟動。為探究新疆野蘋果種子 WRKY33轉錄因子在低溫層積中的作用機理，通過對新疆野蘋果[Malus sieversii （Ledeb.） M.Roem.]種子 "MsWRKY33進行克隆，生物信息學分析、亞細胞定位及不同低溫層積時期種子的基因表達量水平檢測，初步揭示 "MsWRKY33基因在新疆野蘋果種子低溫層積下的功能。采用沙藏法進行低溫（4 ℃）層積處理，常規保存（室溫）種子作為對照，以0 d、30 d、60 d、90 d處理的新疆野蘋果種子種胚為研究材料，提取種胚RNA，利用同源重組的方法克隆 "MsWRKY33，測序后進行生物信息學分析。并構建表達載體，進行亞細胞定位分析。最后通過實時熒光定量（qRT-PCR）分析新疆野蘋果種子在不同低溫層積時期 "MsWRKY33的表達水平。結果表明， "MsWRKY33全長CDS序列為1 560 bp，編碼520個氨基酸。保守結構域表明， "MsWRKY33為GroupⅠ家族WRKY轉錄因子成員；序列相似性和系統進化樹分析結果顯示：新疆野蘋果MsWRKY33與NP_001281056.1（栽培蘋果Malus domestica）、XP_050143309.1（歐洲野蘋果Malus sylvestris）序列相似性度極高，親緣關系最近；亞細胞定位分析顯示MsWRKY33定位在細胞核中；不同低溫層積時期qRT-PCR表達分析發現， "MsWRKY33基因在低溫層積60 d時表達水平最高，顯著高于未層積時表達量。由此說明，新疆野蘋果種子基因 "MsWRKY33在低溫層積過程對解除種子休眠具有調控功能。

關鍵詞 新疆野蘋果；種子； "MsWRKY33；亞細胞定位；表達分析

新疆野蘋果[Malus sieversii（Ledeb.）Roem]．屬薔薇科（Rosaceae" Juss.），蘋果屬（Malus Mill.），是中亞天山山脈的第三紀孑遺樹種^[1] ，為現代栽培蘋果（Malus domestica）的起源種，種內變異豐富，在種質資源保存及遺傳發育研究中有著不可替代的作用，現已被列為中國的優先保護物種^[2-4]。但由于病蟲害及人類活動的干擾，種群繁衍受到嚴重影響，目前分布面積已不足5 000 hm²，已于1991年在《中國植物紅皮書》中被列為中國瀕危二級保護植物^[5-6]。

新疆野蘋果種群更新繁育方式為實生和根蘗繁殖，實生繁殖方式為主。成熟果實被動物取食后排出、或人為將種子在低溫下層積，于來年春季萌發^[7] 。陳開秀等^[8] 對新疆野蘋果層積的種子研究發現種子休眠的原因是生理后熟；或是種皮包被導致空氣透性不良。而低溫層積處理能夠有效地軟化種皮，增加種子透性，能夠促進完成生理變化和后熟過程，降低內源抑制物，增強新陳代謝活動，將貯藏物質轉換為簡單化合物使胚胎更易吸收，有利于誘導種子解除休眠^[9] ，是目前新疆野蘋果種子休眠解除最常用且最有效的方法。

WRKY家族是一類廣泛分布于植物中的轉錄因子，通過與其他轉錄因子的自主和交叉調控，在植物的生長、發育和逆境信號傳導等過程中發揮作用^[10] ，能夠幫助植物抵御不利條件，在作物育種中具有廣泛的應用前景。如 ClWRKY20的表達量因鹽、干旱和植物激素（ABA、ET和SA）處理而升高，在轉基因擬南芥中過表達 ClWRKY20提高了在低溫、鹽和種子萌發過程中對ABA的敏感性^[11] 。種子休眠作為決定種子性能的重要農藝性狀，其潛在的分子機制仍不完全清楚。在擬南芥中，Ⅰ型 AtWRKY TF識別的兩個W box能夠激活 AtFUS3表達^[12] ，從而結合AtFUS3啟動子并正調控該休眠相關基因的表達。種子中 AtWRKY41的沉默會導致種子初級休眠減少，并下調成熟和吸水種子中AtABI3的轉錄。并且 AtWRKY41能夠直接結合AtABI3啟動子中3個相鄰的W box以正向調節表達^[13] 。在水稻中， "OsWRKY29是休眠的負調控因子。在不存在ABA的情況下， "OsWRKY29結合水稻ABA響應基因VIVIPAROUAl（OsVPl）和脫落酸響應元件結合因子1（OsABFl）的啟動子以下調其表達。但ABA的存在會抑制 "OsWRKY29的表達，使OsVPl和OsABFl轉錄增加，最終導致ABA響應增強和種子休眠增加^[14] 。此外，WRKY轉錄因子的不同類群在不同植物中的分布也存在差異，如擬南芥和水稻中GroupI的WRKY蛋白豐度高于草莓^[15] 。同樣，楊樹基因組中50%的WRKY轉錄因子屬于Group Ⅰ，桑樹中Group Ⅰ成員僅構成Group Ia亞組^[16] 。在所有Ia組成員和IIb組家族中一個成員的C末端都發現了一個明顯的GGDFDDNEPEAKR-WKGE基序^[17] 。谷彥冰等^[18] 發現蘋果（Malus domestica）基因組中有132個WRKY基因，其中Ⅰ類成員24個，Ⅱ類成員79個和Ⅲ類成員29個。蘋果中WRKY基因家族保守性較高，大部分都具有WRKYGQK七肽序列和鋅指結構。其在各個部位中均能表達有12個MdWRKY基因，并且表達模式不同。

目前，新疆野蘋果基因研究主要集中在抗逆性以及抗病性^[19-21]，而種子的休眠及萌發過程中分子調控機理研究相對較少。筆者課題組前期利用RNA Seq測序技術，檢測新疆野蘋果種子在低溫層積處理下不同時期與正常儲存（常溫）的總體差異，對其測序結果進行生物信息學分析。結果顯示， "MsWRKY33在低溫層積過程中差異表達，可能參與調控新疆野蘋果種子休眠。因此，本研究從新疆野蘋果種胚中克隆 "MsWRKY33，并對其理化性質、保守結構、系統進化、亞細胞定位以及在低溫層積的不同時期的表達水平進行分析，旨在為進一步研究其生物學功能及其分子調控休眠機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以塔城額敏縣新疆野蘋果林的當年野生蘋果種子為試驗材料，于2022年10月采集。挑選顆粒飽滿、大小均勻、無機械損傷、無病蟲害的種子作試驗。樣品采用低溫層積沙藏法，將濕沙與種子按3∶1均勻混合，容器底部鋪一層濕沙，裝入種子后其上再覆一層濕沙置于容器內4 ℃處理。層積時間分別為0 d、30 d、60 d、90 d，層積完成后，液氮速凍后于-80" ℃保存。同時以常規保存（室溫）種子作為對照。

1.2 方" 法

1.2.1 MsWRKY33全長CDS序列克隆與基因載體構建

根據新疆野蘋果的同屬物種栽培蘋果（Malus domestica）基因組 "MdWRKY33的參照CDS序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計擴增目標基因的特異引物WRKY33F和WRKY33R（表1）。利用NovoRec^{[HT5”SS]○[KG-*3/4][HT6”SS]R}[HT]" PCR一步定向克隆試劑盒（近岸蛋白Novoprotein），用同源重組的方法，PCR產物一步定向克隆，完成目的片段與載體無縫連接。以新疆野蘋果種子cDNA為模板，通過PCR的方法克隆目的基因。制備1%瓊脂糖凝膠，回收目的片段。用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切質粒CAM-EGFP，酶切后，瓊脂糖凝膠電泳進行結果檢測，切取載體大片段對應條帶的凝膠，試劑盒（百泰克膠回收試劑盒）回收酶切產物；構建出融合表達載體pART-CAM-MsWRKY33-EGFP，轉化大腸桿菌感受態DH5α。轉化子經PCR檢測后，挑選3個單克隆菌株進行測序得到 "MsWRKY33序列。

1.2.2 MsWRKY33生物信息學分析

使用NCBI網站里的ORF finder軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對克隆的序列預測開放閱讀框（ORF）。利用NCBI在線軟件Conserved Domain Search Service分析蛋白質的保守結構域。利用Ex PASy-Prot Prama tool在線軟件（http：//web.expasy.org/prot param/）進行蛋白質理化性質分析;利用Expasy中的Prot Salec在線軟件（http：//web.expasy.org/protscale/）分析親水性和疏水性;利用TMHM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）軟件在線預測跨膜結構，通過SignalP-5.0Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）軟件在線預測信號肽結構。通過Plant-mPLoc Server（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在線軟件進行亞細胞定位預測。用MEGA7.0.21軟件，通過最大似然法（ML）構建MsWRKY33蛋白的系統進化樹，Boot strap值取1 000次。

1.2.3 亞細胞定位

將構建出的融合表達載體pART-CAM-MsWRKY33-EGFP導入農桿菌。利用注射法，將測序結果正確的陽性克隆的質粒轉化到根瘤農桿菌（GV3101）。將農桿菌菌液注射到3～4周齡本氏煙草倒三葉和倒四葉兩葉脈之間，葉片噴水，黑暗放置過夜，弱光培養2～3 d后，切取侵染區域，撕表皮制片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 MsWRKY33在不同低溫層積時期的表達量

分別在低溫層積處理0 d、30 d、60 d、90 d取種胚樣品，每個時期3個生物學重復，液氮冷凍，-80 ℃下儲存，備用。設計 "MsWRKY33的實時熒光定量PCR引物 "MsWRKY33F2和 "MsWRKY33R2（表1）。利用SYBR" Premix Ex TaqTM II試劑盒（TAKARA），以不同低溫層積時期種子cDNA為模板，b-actin為內參基因進行熒光定量分析，檢測 "MsWRKY33在新疆野蘋果種子不同低溫層積時期的表達情況。

2 結果與分析

2.1 MsWRKY33基因的克隆和序列分析

利用基因特異引物，以新疆野蘋果種子cDNA為模板，通過PCR擴增測序到一條約1 600 bp的條帶，與預期條帶大小相似（圖1）。對序列進行生物信息學分析，利用NCBI網站中ORFFinder 在線工具分析該序列開放閱讀框，發現該基因序列開放閱讀框長為1 560 bp，可編碼520個氨基酸。利用NCBI在線軟件分析蛋白質的保守結構域發現新疆野蘋果MsWRKY33蛋白具有2個植物WRKY轉錄因子的典型保守區域，該結構域屬于WRKY超基因家族（superfamily）。

2.2 MsWRKY33蛋白的理化性質分析及二、三級結構預測

對新疆野蘋果MsWRKY33轉錄因子的蛋白質特征分析結果如表2所示。此外， MsWRKY33轉錄因子所編碼蛋白的分子式為C₂₄₉₀H₃₈₄₀N₇₂₄O₈₃₆S₁₂，為疏水性蛋白。不存在信號肽，N端、C端均在膜外，無跨膜結構，其亞細胞定位預測定位在細胞核中。

利用在線網站（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）預測MsWRKY33蛋白的二級結構域發現，該蛋白質主要由4種二級結構組成，即隨機卷曲（random coil）占79.04%；延伸鏈（extended strand）占9.42%；α-螺旋（Alpha helix）占8.65%；β-轉角（Beta turn）占 2.88%。此外，利用SWISS-MODEL對MsWRKY33蛋白進行三級結構預測發現，MsWRKY33蛋白主要由2個α-螺旋元件和2個無規則卷曲元件組成（圖2）。

2.3 不同物種WRKY33蛋白序列比對和系統進化樹分析

為解析MsWRKY33蛋白在植物系統進化中的關系，本研究通過NCBI網站利用blastp工具將MsWRKY33蛋白氨基酸序列與其他物種進行同源比對，獲取了16條與MsWRKY33蛋白同源性較高的蛋白序列（identity＞60%），其他物種蛋白序列為NP_001281056.1（栽培蘋果Malus domestica）、XP_050143309.1（歐洲野蘋果Malus sylvestris）、XP_048431322.1（白梨Pyrus xbretschneideri）、XP_008244800.1（梅Prunus mume）、XP_034218478.1（扁桃Prunus dulcis）、XP_021826437.1（歐洲甜櫻桃Prunus avium）、XP_007205027.1（桃Prunus persica）、XP_024187793.1（月季Rosa chinensis）、XP_004302557.1（野草莓Fragaria vesca subsp.vesca）、XP_021290063.1（長蒴黃麻Herrania umbratica）、XP_015897665.2（棗樹Ziziphus jujuba var.spinosa）、XP_017977471.1（可可樹Theobroma cacao）、XP_023923894.1（西班牙栓皮櫟Quercus suber）、XP_010093567.2（川桑Morus notabilis）、XP_021638156.1（橡膠樹Hevea brasiliensis）。序列比對結果（圖3）顯示：MsWRKY33蛋白與NP_001281064.1（栽培蘋果Malus domestica）、XP_050120190.1（歐洲野蘋果Malus sylvestris）蛋白長度相同，序列相似性高達98%，與薔薇科序列相似度均在50%以上。蛋白序列系統進化分析并構建進化樹（圖4），結果顯示WRKY33被大致分為3組，新疆野蘋果MsWRKY33與NP_001281056.1（栽培蘋果Malus domestica）、XP_050143309.1（歐洲野蘋果Malus sylvestris）親緣關系最近。

2.4 MsWRKY33蛋白亞細胞定位分析

Plant-mPLoc Server在線軟件預測結果顯示：MsWRKY33定位于細胞核。為了進一步驗證預測結果，構建了pART-CAM-MsWRKY33-EGFP載體。將pART-CAM-MsWRKY33-EGFP和pART-CAM-EGFP空載質粒轉化農桿菌菌株GV3101注射到煙草葉片中。鏡檢亞細胞定位結果如圖5所示。pART-CAM-MsWRKY33-EGFP只在煙草葉肉細胞的細胞核觀察到綠色熒光，表明MsWRKY33蛋白亞細胞定位在植物的細胞核中，與在線軟件預測結果一致。

2.5 MsWRKY33基因的表達分析

通過對不同低溫層積時期與未層積的新疆野蘋果 "MsWRKY33熒光定量PCR分析發現，該轉錄因子隨著低溫層積時間增加表達量呈先降低后增高再降低趨勢。第60天達到最高，約為未層積表達量的兩倍（圖6），而未層積種子的表達量隨時間增加無明顯變化。綜上，從基因表達層面上說明 "MsWRKY33可能參與低溫層積過程中新疆野蘋果種子解除休眠的調控。

3 討" 論

WRKY轉錄因子通過與調控基因表達的 W-box（TTGAC（C/T））精確結合，作為關鍵的調控蛋白發揮作用^[22] ，但低溫層積下種子解除休眠的調控機制尚未明確。本研究以新疆野蘋果種子為試驗材料，克隆得到 "MsWRKY33基因序列，其生物信息學分析結果顯示該基因完整開放閱讀框（ORF）大小為1 560 bp，編碼520個氨基酸，含有2個WRKY保守結構域屬于GroupⅠ，多重序列比對發現其與歐洲野蘋果、栽培蘋果、白梨等物種中WRKY保守結構域一致。對MsWRKY33進行序列分析，系統進化樹結果顯示MsWRKY33蛋白與栽培蘋果與歐洲野蘋果親緣關系最近。

各WRKY基因的編碼序列，同源WRKY基因相似性最高，可能在不同的非生物脅迫和物種中具有不同的作用。 WRKY33在WRKY結構域的C端與Sigma因子互作蛋白1 （ Sigma Factor-Interacting Protein1，SIB1 ）和SIB2等多個VQ蛋白互作時，擬南芥表現出對多種非生物脅迫的耐受性。這種相互作用可以誘導 "AtWRKY33的DNA結合活性^[23] 。在棉花中， "GhWRKY33定位于細胞核，作為負調控因子介導干旱脅迫響應，并參與ABA信號通路。過表達 GhWRKY33的擬南芥在干旱脅迫下較野生型，失水快、更易枯萎，在ABA處理下表現出更強的耐受性 ^[24-25]；在小麥葉肉原生質體中， "TaWRKY33（Ⅱ組）定位于細胞核中。 "TaWRKY33基因的啟動子區域，檢測到多個非生物順式作用元件。 "TaWRKY33基因對ABA、茉莉酸甲酯、高溫和低溫均表現出較高的響應。在擬南芥轉基因株系中，過表達的 TaWRKY33基因與激活下游多種脅迫相關基因有關，在各種脅迫條件下的萌發率更高^[26] 。此外，MAPK級聯路徑可以將外界信號傳遞到細胞核中，而WRKY轉錄因子存在于細胞核中，可以與相應的基因結合并調控其表達。MPK3/MPK6在不同的生物學過程中磷酸化不同的WRKY同源蛋白。在擬南芥中MPK3/MPK6通過磷酸化 "AtWRKY33來增強其轉錄激活活性，誘導camalexin的生物合成，而異源基因表達加快了擬南芥種子的萌發 ^[27-28]。本研究中MsWRKY33定位于細胞核，與前人研究結果一致，表明其亞細胞定位相對保守。 "MsWRKY33在低溫層積60 d時表達水平最高，顯著高于未層積時表達量，與課題組前期研究解除休眠萌發時間相似^[29] ，明確了 "MsWRKY33在解除種子休眠的過程中具有一定的調控功能。由此推測 "MsWRKY33可能參與同一細胞中不同生物學過程的2種底物，它們的上游MAPK級聯在響應其中一種刺激時被激活，2種不同底物的磷酸化導致了2種反應的激活。其次，由于復合物的形成或亞細胞定位，只有一種底物被激活，從而產生特定的反應。為明確其功能表達的差異性，需要進一步分析及深入研究。

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Cloning，Subcellular Localization and Expression Analysis of" "MsWRKY33 Gene in Malus sieversii Seeds

LI Jing，FANG Zhen and" YE Chunxiu

（College of Forestry and Landscape Architecture，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830000，China）

Abstract WRKY transcription factors mediate the initiation of life cycle by regulating seed dormancy and germination.In order to explore the mechanism of "WRKY33 transcription factor in low temperature stratification of Malus sieversii （Ledeb.） M.Roem seeds，the function of "MsWRKY33 gene in low temperature stratification of Malus sieversii" seeds was preliminarily revealed by cloning "MsWRKY33 of Malus sieversii seeds，bioinformatics analysis，subcellular localization，and detection of gene expression in seeds at different low temperature stratification stages.In this study，the sand storage method was used for low temperature （4" ℃） stratification treatment，and the conventional preservation （room temperature） seeds were used as control.The seed embryos of Malus sieversii seeds treated for 0 day，30 days，60 days and 90 days were used as materials to extract RNA. MsWRKY33 was cloned by homologous recombination and sequenced for bioinformatics analysis.The expression vector was constructed，and subcellular localization was analyzed.The expression vector was constructed and subcellular localization was analyzed.Finally，the expression level of "MsWRKY33 in Malus sieversii seeds at different low temperature stratification periods was analyzed by real-time fluorescence quantification （qRT-PCR）.The results showed that the full-length CDS sequence of "MsWRKY33 was 1 560 bp，encoding 520 amino acids.The conserved domain indicated that ""MsWRKY33 was a member of Group Ⅰ family WRKY transcription factor.The sequence similarity between MsWRKY33 and NP_001281056.1（Malus domestica） and XP_050143309.1（Malus sylvestris） was very high，and the genetic relationship was closest.Subcellular localization analysis showed that" "MsWRKY33" was located in the nucleus.qRT-PCR expression analysis during different low-temperature stratification periods found that the expression level of" "MsWRKY33 was the highest at 60 days of low-temperature stratification，which was significantly higher than that without stratification.The seed gene ""MsWRKY33 of Malus sieversii has a regulatory function in the release of seed dormancy during low temperature stratification.

Key words Malus sieversii; Seeds; "MsWRKY33; Subcellular localization; Expression analysis

Received" 2023-09-14""" Returned 2023-12-26

Foundation item Talent"" Introduction Project of Xinjiang Agricultural University （No.2521GCCRC）.

First author LI" Jing，female，master"" student.Research area：seed dormancy.E-mail：lj190113@163.com

Corresponding"" author YE Chunxiu，female，associate professor，master supervisor.Research area：forest germplasm resources and molecular breeding.E-mail：yecx2008@163.com

（責任編輯：潘學燕 Responsible editor：PAN Xueyan）

基金項目：新疆農業大學高層次人才引進項目（2521GCCRC）。

第一作者：李 靜，女，在讀碩士，從事種子休眠研究。E-mail：lj190113@163.com

通信作者：葉春秀，女，副教授，碩士生導師，主要從事林木種質資源與分子育種研究。E-mail：yecx2008@163.com