根皮苷通過下調(diào)miR-125a-5p減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡

摘要：目的 探討根皮苷對缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9C2凋亡和氧化應(yīng)激的影響及可能機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，用16、32、64 μmol/L根皮苷預(yù)處理或轉(zhuǎn)染anti-miR-125a-5p、anti-miR-NC、miR-125a-5p模擬物、模擬物陰性對照后建立H/R模型。CCK-8法測定細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞凋亡，Western blot測定B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）蛋白和Bcl-2相關(guān)X（Bax）蛋白表達(dá)，比色法檢測乳酸脫氫酶（LDH）釋放量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測細(xì)胞中微小RNA-125a-5p（miR-125a-5p）表達(dá)。結(jié)果 與H/R組比較，低、中及高劑量根皮苷處理后細(xì)胞抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、LDH含量、miR-125a-5p表達(dá)依次降低，SOD活性、Bcl-2蛋白表達(dá)依次增加（P＜0.05）。抑制miR-125a-5p表達(dá)后，H/R處理細(xì)胞的抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達(dá)及LDH含量降低，SOD活性、Bcl-2蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。miR-125a-5p過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了根皮苷對H/R刺激H9C2細(xì)胞凋亡、增殖及氧化應(yīng)激的作用。結(jié)論 根皮苷可能通過降低miR-125a-5p表達(dá)來減輕H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡。

關(guān)鍵詞：心肌再灌注損傷；細(xì)胞低氧；心肌；微RNAS；細(xì)胞凋亡；氧化性應(yīng)激；根皮苷；miR-125a-5p

中圖分類號：R541.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20240846

Phlorizin allevistes oxidative stress and apoptosis of rat cardiac myocytes H9C2 induced by hypoxia/reoxygenation by down-regulating miR-125a-5p

MIAO Chunbo， XU Yingchun△， CHANG Yifang

Department of Cardiology， Liaocheng Second People's Hospital， Liaocheng 252600， China

△Corresponding Author E-mail： xuyingchun5802@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect of phlorizin on the apoptosis and oxidative stress of rat cardiomyocytes H9C2 induced by hypoxia/reoxygenation （H/R） and its possible mechanism. Methods H9C2 cells were cultured in vitro. H/R model was established after pretreatment with different doses （16， 32， 64 μmol/L） of phlorizin or transfection with anti-miR-125a-5p， anti-miR-NC， miR-125a-5p mimics and negative controls. Proliferation was detected by CCK-8， and apoptosis was detected by flow cytometry. The protein expression levels of B lymphoblastoma-2 associated X protein （Bax） and B lymphocytoma-2 （Bcl-2） were detected by Western blot assay. The release of lactate dehydrogenase （LDH） and the activity of superoxide dismutase （SOD） were detected by colorimetric method. Real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression of miR-125a-5p. Results Compared with the H/R group， inhibition rate， apoptosis rate， Bax protein expression， LDH content and miR-125a-5p expression were decreased after low， medium and high doses of phlorizin treatment （P＜0.05）， and SOD activity， Bcl-2 protein expression were increased （P＜0.05）. After inhibiting the expression of miR-125a-5p， the inhibition rate， apoptosis rate， Bax protein expression and LDH content of H9C2 cells induced by H/R were decreased （P＜0.05）， and SOD activity， Bcl-2 protein expression were increased （P＜0.05）. Overexpression of miR-125a-5p reversed the effect of phloridin on H/R-induced proliferation， apoptosis and oxidative stress of H9C2 cells. Conclusion Phlorizin may reduce H/R-induced apoptosis and oxidative stress in H9C2 cells by decreasing the expression of miR-125a-5p.

Key words： myocardial reperfusion injury; cell hypoxia; myocardium; microRNAs; apoptosis; oxidative stress; Phlorizin; miR-125a-5p

急性心肌梗死是常見的冠心病中的急危重癥，治療方案主要是采用溶栓等方法恢復(fù)心肌血流供應(yīng)［1］。缺血再灌注可引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷［2］。根皮苷是一種黃酮類物質(zhì)，也是蘋果樹體內(nèi)的酚類物質(zhì)，具有降脂保肝、抗氧化、抗炎等多種藥理活性［3］。根皮苷可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12氧化損傷［4］，降低心肌缺血再灌注損傷后的心肌葡萄糖攝取［5］。根皮素及富含多酚的蘋果皮提取物均可減弱心肌細(xì)胞損傷［6-7］。根皮苷和根皮素同屬于蘋果皮提取物，故筆者推測根皮苷可能有保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷的作用。miR-125a-5p是一種微小RNA（miRNA），其抑制劑可減少大鼠心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激［8］；敲減miR-125a-5p可保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷［9］。有研究顯示，根皮苷可通過下調(diào)miR-135b表達(dá)，增加角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力［10］。蘋果酚提取物通過miR-22-3p改善鉛誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知和行為缺陷［11］。因此，根皮苷可以通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)影響細(xì)胞行為和疾病進(jìn)展。此外，根皮苷可調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hif-1α）/B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）/腺病毒E1B相互作用蛋白3（Bnip3）軸［12］，而miR-125a-5p對Hif-1α也有調(diào)控作用［13］。本研究旨在探討根皮苷對H/R誘導(dǎo)的心肌梗死細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響及可能機(jī)制，為治療心肌缺血再灌注損傷提供潛在的靶向藥物。

1 材料與方法

1.1 主要材料 H9C2細(xì)胞（上海中喬新舟生物）；根皮苷，純度≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）試劑盒、CCK-8試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司；miR-125a-5p模擬物（mimics）、抑制劑（anti-miR-125a-5p）及陰性對照序列（anti-miR-NC/miR-NC）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Bcl-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）和磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體購自英國Abcam公司；乳酸脫氫酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA提取試劑盒和PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。常規(guī)培養(yǎng)箱（型號Heracell 150i GP）購自美國賽默飛公司；流式細(xì)胞儀（型號ACCURI C6）購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；酶標(biāo)儀（型號ST-360）購自上海掌動(dòng)醫(yī)療科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和H/R模型構(gòu)建 H9C2在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液（基礎(chǔ)培養(yǎng)液）、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱（常規(guī)培養(yǎng)箱）中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。參照文獻(xiàn)［14］構(gòu)建H/R模型：H9C2細(xì)胞用不含血清的無糖DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2、95%N2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)2 h。

1.2.2 CCK-8法測定細(xì)胞增殖 于96孔細(xì)胞板每孔接種0.2 mL H9C2細(xì)胞（2.5×104個(gè)/mL）。培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液。參考文獻(xiàn)［4］和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別用含根皮苷16 μmol/L（H/R+根皮苷L組）、32 μmol/L（H/R+根皮苷M組）、64 μmol/L（H/R+根皮苷H組）的基礎(chǔ)培養(yǎng)液在常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為對照（con）組。24 h后，各組均添加10 μL CCK-8孵育2 h，酶標(biāo)儀在450 nm處測光密度（OD）值。抑制率=［（OD對照組-OD實(shí)驗(yàn)組）/（OD對照組-OD空白組）］×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞凋亡 于6孔板中每孔接種2.5 mL H9C2細(xì)胞（2.5×104個(gè)/mL），依據(jù)1.2.2分組處理。然后將細(xì)胞重懸于500 μL結(jié)合緩沖液中，加入Annexin V-FITC 10 μL，避光孵育10 min；再補(bǔ)充5 μL PI，避光處理5 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 Western blot測定Bcl-2和Bax蛋白相對表達(dá)水平 接種H9C2細(xì)胞（2.5×104個(gè)/mL）至6孔板，每孔2.5 mL，依1.2.2分組處理。提取總蛋白，用BCA試劑盒測量蛋白濃度。蛋白通過SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜和封閉，在4 ℃下Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）一抗與膜孵育過夜。山羊抗兔二抗（1∶2 000）在37 ℃孵育1 h。ECL檢測系統(tǒng)檢測條帶，采用Image J軟件評估目的蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 比色法測定LDH釋放量及SOD活性 于6孔板中每孔接種2.5 mL H9C2細(xì)胞（2.5×104個(gè)/mL），按照1.2.2分組處理后收集細(xì)胞。半徑10 cm、3 500 r/min離心10 min后收集上清液，參照試劑盒說明書分別檢測LDH含量和SOD活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-125a-5p表達(dá) 于6孔板中每孔接種2.5 mL H9C2細(xì)胞（2.5×104個(gè)/mL），按照1.2.2分組處理。用miRNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，行PCR擴(kuò)增，序列見表1。PCR體系：12.5 μL SYBR Green Mix，各0.5 μL正、反向引物，0.5 μL ddH2O，2 μL cDNA。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)。U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法分析miR-125a-5p水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和處理 H9C2細(xì)胞2.5 mL接種至6孔板（2.5×104個(gè)/mL），24 h后采用LipofectamineTM 2000將anti-miR-NC（序列5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'）、anti-miR-125a-5p（序列5'-UCACAGGUUAAAGGGUCUCAGGG A-3'）、miR-NC（序列5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'）、miR-125a-5p mimics（序列5'-UCCCUGAGACCCUUU AACCUGUGA-3'）轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞24 h，qRT-PCR法測量miR-125a-5p水平，鑒定轉(zhuǎn)染效果。將轉(zhuǎn)染anti-miR-NC（H/R+anti-miR-NC組）、anti-miR-125a-5p（H/R+anti-miR-125a-5p組）的H9C2進(jìn)行H/R處理；轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-125a-5p mimics的H9C2根據(jù)H/R+根皮苷H組的方法處理，并記為H/R+根皮苷+miR-NC組、H/R+根皮苷+miR-125a-5p組。然后根據(jù)1.2.2—1.2.5的方法測定各指標(biāo)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用[[x] ±s]表示，2組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若不滿足方差齊性，則行校正t檢驗(yàn)；多組間比較行單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與con組比較，H/R組細(xì)胞抑制率、凋亡率、LDH含量、Bax表達(dá)增加，而SOD活性、Bcl-2表達(dá)降低（P＜0.05）。與H/R組比較，H/R+根皮苷L組、H/R+根皮苷M組和H/R+根皮苷H組細(xì)胞抑制率、凋亡率、LDH含量、Bax表達(dá)依次降低，SOD活性、Bcl-2表達(dá)依次增加（P＜0.05），見圖1、2，表2。

2.2 各組miR-125a-5p表達(dá)水平比較 與con組比較，H/R組miR-125a-5p表達(dá)水平增加（P＜0.05）。與H/R組比較，H/R+根皮苷L組、H/R+根皮苷M組和H/R+根皮苷H組miR-125a-5p表達(dá)依次下降（P＜0.05），見圖3。lt;D：＼龍?jiān)矗?2.18＼天津醫(yī)藥202412PDF＼天津醫(yī)藥202412＼image8.tifgt;[0][A：con組；B：H/R組；C：H/R+根皮苷L組；D：H/R+根皮苷M組；E：H/R+根皮苷H組。n=9，F(xiàn)=1 703.769，P＜0.05；a與con組比較，b與H/R組比較，c與H/R+根皮苷L組比較，d與H/R+根皮苷M組比較，P＜0.05。

2.3 miR-125a-5p轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證 與anti-miR-NC組（1.00±0.00）比較，anti-miR-125a-5p組（0.30±0.03）miR-125a-5p相對表達(dá)水平降低（t=70.000，P＜0.01）。與miR-NC組（1.00±0.00）比較，miR-125a-5p mimics組（2.57±0.10）miR-125a-5p相對表達(dá)水平增加（t=47.100，P＜0.01）。

2.4 miR-125a-5p轉(zhuǎn)染對細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與H/R+anti-miR-NC組比較，H/R+anti-miR-125a-5p組抑制率、凋亡率、LDH含量、Bax蛋白表達(dá)下降，而SOD活性、Bcl-2蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），見圖4、5，表3。

2.5 根皮苷處理聯(lián)合miR-125a-5p轉(zhuǎn)染對細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與H/R+根皮苷+miR-NC組比較，H/R+根皮苷+miR-125a-5p組細(xì)胞抑制率、凋亡率、LDH含量及Bax蛋白表達(dá)增加，而SOD活性及Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖6、7，表4。[103][103][A][B][Bax][Bcl-2][GAPDH][A：H/R+根皮苷+miR-NC組；B：H/R+根皮苷+miR-125a-5p組。

3 討論

研究顯示，H/R過程中心肌細(xì)胞易發(fā)生缺血再灌注損傷［15］。心肌細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷的直接標(biāo)志和關(guān)鍵影響因素［15］。近期研究顯示，H/R誘導(dǎo)后H9C2細(xì)胞活力下降，凋亡率及LDH釋放量增加，SOD活性降低［16-17］。本研究結(jié)果亦顯示，與正常心肌細(xì)胞比較，H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表現(xiàn)出較低的細(xì)胞活力和較高的細(xì)胞凋亡率，且與凋亡相關(guān)的蛋白Bax表達(dá)增加、Bcl-2表達(dá)減少，同時(shí)細(xì)胞LDH釋放量增加，而細(xì)胞中SOD活性降低，證實(shí)了H/R誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，提示模型建立成功。不同濃度根皮苷預(yù)處理能夠增強(qiáng)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞活力，減少細(xì)胞凋亡，提高SOD活性，降低LDH含量，表明根皮苷可減輕心肌H/R損傷，提示根皮苷尤其是高濃度根皮苷具有治療心肌缺血再灌注損傷的潛在價(jià)值。

在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中，miRNA可通過靶向調(diào)控靶基因的表達(dá)發(fā)揮重要作用。研究顯示，缺血再灌注心肌組織中miR-23a［18］、miR-486［19］異常表達(dá)，而這些miRNA與心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)，是治療心肌缺血再灌注損傷的潛在靶點(diǎn)。有研究顯示，下調(diào)miR-125b-5p表達(dá)可抑制心肌細(xì)胞凋亡［20］。本研究結(jié)果顯示，大鼠心肌細(xì)胞H9C2經(jīng)H/R處理后，細(xì)胞中miR-125a-5p表達(dá)增加，而下調(diào)miR-125a-5p表達(dá)則增強(qiáng)了H/R處理的H9C2細(xì)胞增殖活性，減少了細(xì)胞凋亡，并抑制了細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，表明下調(diào)miR-125a-5p可減輕H/R引起的H9C2細(xì)胞損傷，與趙蔭濤等［9］研究結(jié)果一致。因此，筆者認(rèn)為miR-125a-5p可能參與調(diào)控根皮苷減輕H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷過程，而濃度梯度的根皮苷處理依次降低了H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中miR-125a-5p表達(dá)，證實(shí)了上述猜測。進(jìn)一步恢復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-125a-5p表達(dá)降低了根皮苷對H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激及增殖、凋亡的影響，提示根皮苷的抗H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷作用可能與下調(diào)miR-125a-5p表達(dá)有關(guān)，然而miR-125a-5p的下游具體靶基因仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定。

綜上所述，根皮苷可能通過下調(diào)miR-125a-5p表達(dá)來提高H/R誘導(dǎo)的缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞的增殖活性，降低氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，有望成為治療缺血再灌注損傷的潛在藥物，后續(xù)將進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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（2024-07-01收稿 2024-09-23修回）

（本文編輯 陸榮展）