地衣芽孢桿菌制劑對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠模型肝脂肪變性及腸黏膜屏障功能的影響

摘要：目的通過(guò)建立非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠模型，探討地衣芽孢桿菌制劑對(duì)大鼠肝組織病理學(xué)及腸黏膜屏障功能的影響。方法將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Control組，n=5）、模型組（Mod組，n=15）、地衣芽孢桿菌低劑量組（BLL組，n=5）和地衣芽孢桿菌高劑量組（BLH組，n=5）。Control組給予普通飼料喂養(yǎng)，Mod組、BLL組、BLH組給予高脂飼料喂養(yǎng)16周，其中BLL組、BLH組在高脂飼料喂養(yǎng)8周后，分別予地衣芽孢桿菌制劑灌胃2.5×107 CFU/kg、5.0×107 CFU/kg，每天1次，持續(xù)8周。8周干預(yù)結(jié)束后，檢測(cè)大鼠血清ALT、AST、TC、TG、空腹血糖（FPG）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、IL-6、IL-1β和TNF-α水平。HE染色觀察肝組織病理學(xué)改變并根據(jù)NAFLD活動(dòng)度積分（NAS）評(píng)分。透射電鏡下觀察腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)。免疫組化染色觀察腸黏膜肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腸黏膜MLCK的mRNA水平。高通量16S rRNA測(cè)序法分析腸道菌群組成。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，多重比較采用Bonferroni法。結(jié)果與Mod組相比，BLH組和BLL組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、FPG、IL-1β及TNF-α水平降低，SOD水平升高，肝細(xì)胞脂肪變減輕，NAS評(píng)分降低，腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)恢復(fù)，MLCK蛋白及mRNA表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均lt;0.05）。此外，BLH組較Mod組CAT水平升高，MDA及IL-6水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均lt;0.05）。與BLL組相比，BLH組大鼠血清MDA、IL-6、TNF-α水平降低，CAT水平升高，腸黏膜MLCK蛋白及mRNA表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均lt;0.05）。腸道菌群示BLH組和BLL組厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度均較Mod組有所恢復(fù)，且BLH組厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度更接近Control組。結(jié)論地衣芽孢桿菌制劑可有效減輕NAFLD大鼠的肝脂肪變性，其作用機(jī)制可能與下調(diào)腸黏膜MLCK蛋白的表達(dá)水平、改善腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪性肝病；地衣芽孢桿菌；腸黏膜；肌球蛋白輕鏈激酶

Effect of Bacillus licheniformis preparation on hepatic steatosis and intestinal mucosal barrier function in a rat model of nonalcoholic fatty liver disease

ZHAO Chunyan1，LI Yiqun1，LI Li2.（1.The First Clinical Medical College of Xuzhou Medical University，Xuzhou，Jiangsu 221000，China；2.Department of Gastroenterology，The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University，Xuzhou，Jiangsu 221000，China）

Corresponding author：LILi，lily9711214@126.com（ORCID：0000-0002-9702-4601）

Abstract：Objective To investigate the effects of Bacillus licheniformis on liver histopathology and intestinal mucosal barrier function in rats with nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD）.Methods A total of 30 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group（Control group with 5 rats），model group（Mod group with 15 rats），low-dose Bacillus licheniformis group（BLL group with 5 rats），and high-dose Bacillus licheniformis group（BLH group with 5 rats）.The rats in the Control group were fed with normal diet，and those in the Mod，BLL，and BLH groups were fed with high-fat diet for 16 weeks；after 8 weeks of feeding with high-fat diet，the rats in the BLL and BLH groups were given Bacillus licheniformis preparation by gavage once a day for 8 consecutive weeks at a dose of 2.5×107 CFU/kg and 5.0×107 CFU/kg，respectively.The serum levels ofalanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），total cholesterol（TC），triglyceride（TG），fasting plasma glucose（FPG），superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），malondialdehyde（MDA），interleukin-6（IL-6），interleukin-1β（IL-1β），and tumor necrosis factor-α（TNF-α）were measured after the 8 weeks of intervention；HE staining was used to observe the histopathological changes of rat liver，and NAFLD activity score（NAS）was used for scoring；transmission electron microscopy was used to observe the tight junction of the intestinal mucosa；immunohistochemical staining was used to measure the expression of myosin light chain kinase（MLCK）in intestinal mucosa，and quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expressional level of MLCK in intestinal mucosa；high-throughput 16S rRNA sequencing was used to analyze the composition of intestinal microbiota.A one-way analysis of variance was used for comparison between groups，and the Bonferroni method was used for multiple comparisons.Results Compared with the Mod group，the BLH and BLL groups had significant reductions in the serum levels of ALT，AST，TC，TG，F(xiàn)PG，IL-1β，and TNF-α，a significant increase in the level of SOD，significant alleviation of hepatocyte steatosis，a significant reduction in NAS score，recovery of the tight junction of intestinal mucosa，and significant reductions in the protein and mRNA expression levels of MLCK（all Plt;0.05）.In addition，compared with the Mod group，the BLH group had a significant increase in CAT and significant reductions in MDA and IL-6（all Plt;0.05）.Compared with the BLL group，the BLH group had significant reductions in the serum levels of MDA，IL-6，and TNF-αand a significant increase in CAT，as well as significant reductions in the protein and mRNA expression levels of MLCK（all Plt;0.05）.The analysis of intestinal microbiota showed that compared with the Mod group，the BLH and BLL groups had recovery of the relative abundances of Firmicutes and Bacteroidetes，and the relative abundances of Firmicutes and Bacteroidetes in the BLH group were closer to those in the Control group.Conclusion Bacillus licheniformis preparation can effectively alleviate hepatic steatosis in NAFLD rats，possibly by downregulating the expression level of MLCK and improving the tight junction structure of intestinal mucosa.

Key words：Non-alcoholic Fatty Liver Disease；Bacillus licheniformis；Intestinal Mucosa；Myosin-Light-Chain Kinase

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除外酒精和其他明確肝損傷因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積為主要特征的臨床病理綜合征。NAFLD在普通人群中的全球患病率約為25%［1］，已成為全球慢性肝病的主要原因。然而，目前NAFLD的治療選擇有限，主要圍繞生活方式干預(yù)。由于其傾向于進(jìn)展為終末期肝硬化及肝細(xì)胞癌，因此必須及早治療。目前的研究［2-4］表明，NAFLD患者普遍存在腸道菌群失調(diào)。有研究者［5］認(rèn)為，腸道菌群失調(diào)通過(guò)破壞腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致腸黏膜通透性增加，即腸黏膜屏障功能損害。肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）通過(guò)磷酸化肌球蛋白Ⅱ調(diào)節(jié)輕鏈（myosin light chain，MLC）以激活肌球蛋白ATP酶活性，隨后導(dǎo)致細(xì)胞旁緊密連接的通透性增加［6］。最近的研究［7-8］表明，益生菌可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，降低腸道通透性和炎癥來(lái)改善NAFLD，這為治療NAFLD提供了有希望的靶點(diǎn)。地衣芽孢桿菌是臨床上常用的益生菌，已有臨床研究［9］表明其用于輔助治療NAFLD療效可靠，但具體的作用機(jī)制尚未完全明確。本研究通過(guò)建立NAFLD大鼠模型，觀察地衣芽孢桿菌制劑對(duì)大鼠體質(zhì)量、肝功能、血脂、血糖、抗氧化酶、炎癥因子及肝組織病理學(xué)改變的影響，探討地衣芽孢桿菌制劑是否影響NAFLD大鼠腸黏膜屏障功能和改善腸道菌群。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只8周齡無(wú)特定病原級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量170～190 g，購(gòu)自徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)別屏障設(shè)施中，12 h/12 h光周期，恒溫恒濕（23℃，40%～70%濕度），可自由采食食物和水。高脂飼料（含60%脂肪，20%碳水化合物，20%蛋白質(zhì)）購(gòu)于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，主要成分為豬油、大豆油、蔗糖、麥芽糖糊精、酪蛋白、L-胱氨酸、混合維生素及礦物質(zhì)。

1.2主要試劑地衣芽孢桿菌活菌膠囊購(gòu)于東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司；ALT、AST、TC、TG、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒均購(gòu)自中國(guó)南京建成生物工程研究所；空腹血糖（FPG）含量測(cè)定試劑盒和大鼠IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)于中國(guó)上海酶聯(lián)生物科技有限公司；大鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒、大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒和MLCK多克隆抗體購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；TRIzol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒和TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）購(gòu)于日本TaKaRa公司；糞便DNA提取試劑盒（Mag-Bind Soil DNA Kit）購(gòu)于美國(guó)OMEGA公司。

1.3動(dòng)物模型建立及分組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為兩組。5只給予普通飼料喂養(yǎng)，作為正常對(duì)照組（Control組）；25只給予高脂飼料喂養(yǎng)，持續(xù)8周。8周后隨機(jī)處死高脂飼料喂養(yǎng)的10只大鼠，進(jìn)行肝組織切片HE染色確認(rèn)制備模型成功，剩余的大鼠進(jìn)一步分組：模型組（Mod組，n=5）、地衣芽孢桿菌低劑量組（BLL組，n=5）和地衣芽孢桿菌高劑量組（BLH組，n=5）。造模成功后，在第8～16周，各組大鼠飼料與造模期間完全相同，BLL組、BLH組每天分別灌胃2.5×107 CFU/kg、5.0×107 CFU/kg的地衣芽孢桿菌制劑，Control組和Mod組每天灌胃等量的蒸餾水，持續(xù)8周。

1.4大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)末次給藥后所有大鼠禁食禁水12 h，進(jìn)行稱(chēng)重，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，心腔取血，離心分離血清。根據(jù)相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，用全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測(cè)大鼠血清中ALT、AST、TC、TG、FPG、SOD、CAT、MDA、IL-6、IL-1β和TNF-α含量。

1.5組織切片染色（1）蘇木精-伊紅（HE）染色：每只大鼠選取相同部位肝組織，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)過(guò)脫水、石蠟包埋、切片，用蘇木精-伊紅染液進(jìn)行染色，中性樹(shù)膠封片后于光鏡下觀察；（2）按照NAFLD活動(dòng)度評(píng)分（NAFLD activity score，NAS）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分［10］。

1.6透射電鏡觀察腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)在距離回盲瓣2 cm處取材并及時(shí)切小至1 mm3，經(jīng)固定、脫水、包埋、固化后行超薄切片，然后用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，最后在透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.7免疫組化染色觀察小腸黏膜上皮MLCK的表達(dá)在距回盲瓣約2 cm處取材，經(jīng)預(yù)處理后石蠟切片，然后依次經(jīng)抗原修復(fù)、滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、封閉、抗原-抗體反應(yīng)、一抗二抗反應(yīng)、顯色，隨后終止顯色、復(fù)染、脫水封片保存。應(yīng)用Image pro plus 6.0軟件分析結(jié)果。

1.8實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小腸組織MLCK的mRNA水平引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司設(shè)計(jì)合成（表1）。TRIzol試劑用于從腸道組織樣品中提取總RNA。然后經(jīng)過(guò)檢測(cè)調(diào)整RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，MLCK采用美國(guó)ABI Steponeplus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq 10μL，RCR正向引物1μL，RCR反向引物1μL，雙重蒸餾水7μL，cDNA 1μL；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min后，95℃保持30 s使模板變性，60℃保持20 s使引物與模板充分退火，72℃保持40 s使引物在模板上延伸，循環(huán)40次。每樣品進(jìn)行3孔平行反應(yīng)，以2?ΔΔCT計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照。

1.9腸道菌群分析收集大鼠新鮮糞便標(biāo)本并立即儲(chǔ)存在無(wú)菌管中，置于?80℃冰箱保存以供后續(xù)分析。采用美國(guó)OMEGA公司的商業(yè)DNA提取試劑盒從糞便樣本中提取總微生物DNA，隨后使用NanoDrop設(shè)備測(cè)量所得DNA的濃度和純度，選用細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將純化的PCR產(chǎn)物用于文庫(kù)構(gòu)建，隨后在Illumina NovaSeq平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后，將對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施、序列過(guò)濾、操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）聚類(lèi)、物種注釋、多樣性分析和物種差異分析，這些綜合分析有助于研究腸道微生物群所表現(xiàn)出的多樣性。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 9.5軟件進(jìn)行圖表繪制。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni法，Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠體質(zhì)量、肝功能、血脂、血糖、抗氧化酶及炎癥因子檢測(cè)結(jié)果各組初始體質(zhì)量無(wú)明顯差異，飼養(yǎng)16周后Mod組體質(zhì)量高于Control組，BLL組、BLH組體質(zhì)量均低于Mod組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均lt;0.05）。與Control組相比，Mod組血清ALT、AST、TC、TG、FPG、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高，SOD和CAT水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均lt;0.05）。與Mod組相比，BLH組血清ALT、AST、TC、TG、FPG、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均降低，SOD和CAT水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均lt;0.05）；BLL組血清ALT、AST、TC、TG、FPG、IL-1β、TNF-α水平均降低，SOD水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均lt;0.05）。與BLH組相比，BLL組血清MDA、IL-6、TNF-α水平升高，CAT水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均lt;0.05）（表2）。

2.2肝組織病理學(xué)改變HE染色顯示，Control組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞無(wú)脂肪變性，肝竇無(wú)充血，肝實(shí)質(zhì)無(wú)明顯炎癥細(xì)胞分布。Mod組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞有脂肪變性，出現(xiàn)氣球樣變性，肝竇無(wú)充血，肝實(shí)質(zhì)有炎癥細(xì)胞散在或局灶樣分布。BLL組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞脂肪變性較輕，偶見(jiàn)氣球樣變，肝竇無(wú)充血，肝實(shí)質(zhì)有炎癥細(xì)胞散在或局灶樣分布。BLH組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞脂肪變性較輕，無(wú)氣球樣變，肝竇無(wú)充血，肝實(shí)質(zhì)有炎癥細(xì)胞散在分布（圖1a～d）。NAS評(píng)分顯示，與Control組相比，Mod組NAS評(píng)分升高（Plt;0.05）；與Mod組相比，BLL組、BLH組NAS評(píng)分均降低（P值均lt;0.05）（圖1e）。2.3透射電鏡下觀察小腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)的變化透射電鏡下，Control組上皮細(xì)胞表面微絨毛豐富，排列整齊，緊密連接結(jié)構(gòu)清晰、完整，間隙小；Mod組上皮細(xì)胞表面微絨毛豐富，排列欠規(guī)則，緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，間隙寬度較Control組明顯增寬；BLL組和BLH組緊密連接結(jié)構(gòu)均在很大程度上恢復(fù)，間隙寬度均較Mod組變窄（圖2）。2.4免疫組化檢測(cè)小腸組織MLCK蛋白的表達(dá)MLCK主要在腸黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。Control組著色淺，腸黏膜MLCK呈弱表達(dá)；Mod組著色深，腸黏膜MLCK相對(duì)表達(dá)量較Control組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；BLL組、BLH組腸黏膜MLCK相對(duì)表達(dá)量較Mod組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均lt;0.05）；BLL組腸黏膜MLCK相對(duì)表達(dá)量較BLH組升高（Plt;0.05）（圖3）。

2.5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小腸組織MLCK的mRNA水平如圖4所示，與Control組相比，Mod組小腸組織MLCK的mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；與Mod組相比，BLL組和BLH組小腸組織MLCK的mRNA水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均lt;0.05）；與BLH組相比，BLL組小腸組織MLCK的mRNA水平升高（Plt;0.05）。

2.6腸道菌群檢測(cè)結(jié)果采用高通量16S rRNA基因測(cè)序分析腸道菌群組成。采用α多樣性Chao 1指數(shù)和Observed?species指數(shù)評(píng)價(jià)各組腸道菌群的物種豐富度。與Control組相比，Mod組大鼠Chao 1指數(shù)和Observed species指數(shù)均降低（P值均lt;0.05）。此外，與Mod組相比，BLL組及BLH組顯示出Chao 1指數(shù)和Observed species指數(shù)升高的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖5a、b）。主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示，BLL組腸道菌群多樣性與BLH組最為相似；其次，BLL組、BLH組腸道菌群多樣性均與Mod組較為相似；與上述三組相比，Control組腸道菌群多樣性差異顯著（圖5c）。韋恩圖巧妙地說(shuō)明了在差異群體中普遍存在的共同和獨(dú)特的OTU（圖5d）。為了進(jìn)一步探究韋恩圖中各個(gè)區(qū)域的物種豐度組成，在門(mén)水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)區(qū)域相應(yīng)OTU的豐度，結(jié)果顯示了厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）及放線菌門(mén)（Actinobacteria）在門(mén)水平上的優(yōu)勢(shì)。值得注意的是，與Control組相比，Mod組Firmicutes的相對(duì)豐度上調(diào)，Bacteroidetes的相對(duì)豐度下調(diào)；BLL組Firmicutes和Bacteroidetes的相對(duì)豐度在一定程度上趨向于Control組；BLH組Firmicutes和Bacteroidetes的相對(duì)豐度在很大程度上趨向于Control組。此外，BLH組還表現(xiàn)出梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）的明顯上調(diào)（圖5e）。通過(guò)LEfSe（LDA Effect Size）分析顯示每個(gè)組內(nèi)顯著富集的物種，結(jié)果顯示，Control組、Mod組、BLL組和BLH組分別有13、7、9和11種細(xì)菌物種的相對(duì)豐度發(fā)生了重大變化（圖5f）。總之，測(cè)序結(jié)果顯示了地衣芽孢桿菌制劑在調(diào)節(jié)腸道菌群方面的潛力。

3討論

由于全球肥胖率的顯著增加，NAFLD的發(fā)病率也有所增加。目前還缺乏針對(duì)NAFLD的有效藥物。既往臨床前及臨床研究［11-14］均表明，益生菌可有效緩解NAFLD，其作用通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群、改善腸黏膜屏障功能及減輕炎癥實(shí)現(xiàn)。然而，先前的研究大都圍繞雙歧桿菌、乳桿菌等，同樣作為我國(guó)臨床上常用益生菌的地衣芽孢桿菌卻少有人研究。一項(xiàng)臨床研究［15］探討了地衣芽孢桿菌制劑對(duì)NAFLD患者的治療作用，結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌制劑可減少NAFLD患者胰島素抵抗，降低腸源性內(nèi)毒素血癥，改善肝功能。另一項(xiàng)研究［9］評(píng)價(jià)了地衣芽孢桿菌制劑治療NAFLD的臨床療效，發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌制劑用于輔助治療NAFLD療效確切，可有效改善患者癥狀、血脂及肝功能。由此可見(jiàn)，地衣芽孢桿菌制劑用于輔助治療NAFLD有一定療效，然而具體的機(jī)制未明。為了探討地衣芽孢桿菌制劑對(duì)NAFLD大鼠的治療作用及機(jī)制，本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠建立NAFLD動(dòng)物模型，Mod組大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量增加、肝功能受損、糖脂代謝紊亂及肝細(xì)胞脂肪變性，BLL組和BLH組大鼠的體質(zhì)量、肝功能、糖脂代謝紊亂及肝細(xì)胞脂肪變性均得到改善，這與先前的相關(guān)研究一致［16］。此外，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為，細(xì)胞因子作為NAFLD發(fā)生、發(fā)展的介質(zhì)起著關(guān)鍵作用。其中，IL-1β、IL-6和TNF-α濃度的增加與NAFLD風(fēng)險(xiǎn)的增加顯著相關(guān)［17-19］。既往研究［20］表明，氧化應(yīng)激在NAFLD的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用。氧化應(yīng)激是指抗氧化劑和自由基之間的不平衡狀態(tài)，此過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧（ROS）以羥基自由基和超氧陰離子的形式存在。過(guò)量的ROS會(huì)破壞蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，產(chǎn)生大量的MDA，最終導(dǎo)致組織損傷和疾病的發(fā)展。包括SOD和CAT在內(nèi)的抗氧化酶可以去除多余的ROS并使機(jī)體保持穩(wěn)定的健康狀態(tài)［21］。

腸黏膜屏障功能是維持黏膜穩(wěn)態(tài)所必需的。該屏障由包含緊密連接、黏附連接和橋粒在內(nèi)的一系列連接組成，其中最重要的是緊密連接。緊密連接是由跨膜蛋白、外周膜蛋白和包括激酶在內(nèi)的調(diào)節(jié)分子組成的多蛋白復(fù)合物［22］。研究［23］表明，在許多情況下，腸黏膜屏障功能障礙表現(xiàn)為MLCK激活和MLC磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞旁緊密連接的通透性增加。盡管關(guān)于MLCK激活的一些細(xì)節(jié)仍有待定義，但很明顯，這會(huì)觸發(fā)連接周?chē)?dòng)球蛋白環(huán)收縮，導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)和組成的分子重組，包括閉塞蛋白內(nèi)吞作用。最新研究［24］表明，腸黏膜屏障功能障礙與NAFLD的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌制劑可以恢復(fù)NAFLD大鼠的緊密連接結(jié)構(gòu)及間隙寬度并下調(diào)小腸黏膜MLCK蛋白的表達(dá)水平，從而改善小腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)。

腸道菌群失調(diào)是高脂飲食驅(qū)動(dòng)的NAFLD進(jìn)展的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素［25］。本研究結(jié)果表明，Mod組大鼠的Chao 1指數(shù)和Observed?species指數(shù)均明顯降低，說(shuō)明NAFLD表現(xiàn)出腸道菌群物種豐富度的降低，這與相關(guān)研究［26-27］一致。然而，地衣芽孢桿菌制劑并未顯著改善微生物物種的豐富度，主坐標(biāo)分析結(jié)果與α多樣性指數(shù)一致。進(jìn)一步探究了門(mén)水平上各組的物種豐度組成，結(jié)果顯示，Mod組Firmicutes的相對(duì)豐度明顯上調(diào)，Bacteroidetes的相對(duì)豐度明顯下調(diào)，這與相關(guān)研究［28］一致。有趣的是，BLL組和BLH組均在一定程度上逆轉(zhuǎn)了這種趨勢(shì)，且BLH組Firmicutes和Bacteroidetes的相對(duì)豐度與Control組更接近。此外，BLH組還表現(xiàn)出Fusobacteria的明顯上調(diào)，既往相關(guān)研究顯示Fusobacteria具有很高的丁酸鹽生產(chǎn)潛力［29］，而丁酸鹽已被公認(rèn)為全身能量穩(wěn)態(tài)中腸道菌群調(diào)節(jié)的重要介質(zhì)，由于條件有限，本研究未進(jìn)行腸道菌群代謝物檢測(cè)。上述結(jié)果顯示了地衣芽孢桿菌制劑在糾正高脂飲食驅(qū)動(dòng)的NAFLD相關(guān)腸道菌群失調(diào)方面的潛力。

綜上所述，地衣芽孢桿菌制劑可有效減輕NAFLD大鼠的肝臟脂肪變性，其作用機(jī)制可能與下調(diào)腸黏膜MLCK蛋白的表達(dá)水平、改善腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)有關(guān)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2023年12月27日經(jīng)由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：202312T041，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：趙春燕負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，撰寫(xiě)文章；趙春燕、李逸群負(fù)責(zé)資料分析；趙春燕、李逸群、李莉參與修改論文；李莉負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。

參考文獻(xiàn)：

[1]ZHANG XY，LIU Y，WANG WL，et al.Diagnosis and evaluation of non?alcoholic fatty liver disease[J].J Clin Hepatol，2023，39（8）：1780-1788.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2023.08.003.

張馨元，劉宇，王文玲，等.非酒精性脂肪性肝病的診斷與評(píng)估[J].臨床肝膽病雜志，2023，39（8）：1780-1788.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2023.08.003.

[2]FANG J，YU CH，LI XJ，et al.Gut dysbiosis in nonalcoholic fatty liver disease：Pathogenesis，diagnosis，and therapeutic implications[J].Front Cell Infect Microbiol，2022，12：997018.DOI：10.3389/fcimb.2022.997018.

[3]TILG H，ADOLPH TE，DUDEK M，et al.Non-alcoholic fatty liver disease：The interplay between metabolism，microbes and immunity[J].Nat Metab，2021，3（12）：1596-1607.DOI：10.1038/s42255-021-00501-9.

[4]WU JY，WANG K，WANG XM，et al.The role of the gut microbiome and its metabolites in metabolic diseases[J].Protein Cell，2021，12（5）：360-373.DOI：10.1007/s13238-020-00814-7.

[5]MOHAMAD NOR MH，AYOB N，MOKHTAR NM，et al.The effect of probiotics（MCP?BCMC?strains）on hepatic steatosis，small intes?tinal mucosal immune function，and intestinal barrier in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J].Nutrients，2021，13（9）：3192.DOI：10.3390/nu13093192.

[6]HE WQ，WANG J，SHENG JY，et al.Contributions of myosin light chain kinase to regulation of epithelial paracellular permeability and mucosal homeostasis[J].Int J Mol Sci，2020，21（3）：993.DOI：10.3390/ijms21030993.

[7]FILIPOVIC B，LUKIC S，MIJAC D，et al.The new therapeutic ap?proaches in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease[J].Int J Mol Sci，2021，22（24）：13219.DOI：10.3390/ijms222413219.

[8]HONG Y，SHENG LL，ZHONG J，et al.Desulfovibrio vulgaris，a po?tent acetic acid-producing bacterium，attenuates nonalcoholic fatty liver disease in mice[J].Gut Microbes，2021，13（1）：1-20.DOI：10.1080/19490976.2021.1930874.

[9]WEI M，XIA L，PING J，et al.Effects of Bacillus Licheniformis cap?sule on non-alcoholic fatty liver disease[J].Chin J Integr Tradit West Med Dig，2018，26（1）：54-57.DOI：10.3969/j.issn.1671-038X.2018.01.10.

魏敏，夏露，平晶，等.地衣芽孢桿菌活菌膠囊治療非酒精性脂肪性肝病的療效評(píng)價(jià)[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2018，26（1）：54-57.DOI：10.3969/j.issn.1671-038X.2018.01.10.

[10]TINCOPA MA，LOOMBA R.Non-invasive diagnosis and monitoring of non-alcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis[J].Lancet Gastroenterol Hepatol，2023，8（7）：660-670.DOI：10.1016/S2468-1253（23）00066-3.

[11]LIANG YJ，LIANG S，ZHANG YP，et al.Oral administration of com?pound probiotics ameliorates HFD-induced gut microbe dysbiosis and chronic metabolic inflammation via the G protein-coupled re?ceptor 43 in non-alcoholic fatty liver disease rats[J].Probiotics Anti?microb Proteins，2019，11（1）：175-185.DOI：10.1007/s12602-017-9378-3.

[12]WANG W，XU AL，LI ZC，et al.Combination of probiotics and Salvia miltiorrhiza polysaccharide alleviates hepatic steatosis via gut micro?biota modulation and insulin resistance improvement in high fat-in?duced NAFLD mice[J].Diabetes Metab J，2020，44（2）：336-348.DOI：10.4093/dmj.2019.0042.

[13]SINGH RP，SHADAN A，MA Y.Biotechnological applications of pro?biotics：A multifarious weapon to disease and metabolic abnormality[J].Probiotics Antimicrob Proteins，2022，14（6）：1184-1210.DOI：10.1007/s12602-022-09992-8.

[14]KAUFMANN B，SEYFRIED N，HARTMANN D，et al.Probiotics，prebi?otics，and synbiotics in nonalcoholic fatty liver disease and alcohol-associated liver disease[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2023，325（1）：G42-G61.DOI：10.1152/ajpgi.00017.2023.

[15]LI HT，WANG W，ZHANG ZJ.The effect of Bnfillus licheniformis on nonalcoholic fatty liver disease[J].China Med Her，2012，9（3）：154-155.DOI：10.3969/j.issn.1673-7210.2012.03.070.

李海濤，王雯，張志堅(jiān).地衣芽孢桿菌對(duì)非酒精性脂肪性肝病的治療作用[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（3）：154-155.DOI：10.3969/j.issn.1673-7210.2012.03.070.

[16]SONG XM，WU XD，SHI K，et al.Effect of Bacillus licheniformis on non-alcoholic fatty liver disease and intestinal permeability in rats[J].J Pract Med，2018，34（24）：4056-4059.DOI：10.3969/j.issn.1006-5725.2018.24.010.

宋獻(xiàn)美，吳曉東，石科，等.地衣芽孢桿菌對(duì)非酒精性脂肪肝病的干預(yù)作用及對(duì)腸黏膜通透性的影響[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2018，34（24）：4056-4059.DOI：10.3969/j.issn.1006-5725.2018.24.010.

[17]DUAN YM，PAN XF，LUO JY，et al.Association of inflammatory cyto?kines with non-alcoholic fatty liver disease[J].Front Immunol，2022，13：880298.DOI：10.3389/fimmu.2022.880298.

[18]CHEN JH，ZHOU H，JIN HW，et al.Role of inflammatory factors in mediating the effect of lipids on nonalcoholic fatty liver disease：A two-step，multivariable Mendelian randomization study[J].Nutrients，2022，14（20）：4434.DOI：10.3390/nu14204434.

[19]VACHLIOTIS ID，POLYZOS SA.The role of tumor necrosis factor-al?pha in the pathogenesis and treatment of nonalcoholic fatty liver dis?ease[J].Curr Obes Rep，2023，12（3）：191-206.DOI：10.1007/s13679-023-00519-y.

[20]KARKUCINSKA-WIECKOWSKA A，SIMOES ICM，KALINOWSKI P，et al.Mitochondria，oxidative stress and nonalcoholic fatty liver disease：A complex relationship[J].Eur J Clin Invest，2022，52（3）：e13622.DOI：10.1111/eci.13622.

[21]ALLAMEH A，NIAYESH-MEHR R，ALIARAB A，et al.Oxidative stress in liver pathophysiology and disease[J].Antioxidants，2023，12（9）：1653.DOI：10.3390/antiox12091653.

[22]CAMILLERI M.Leaky gut：Mechanisms，measurement and clinical implications in humans[J].Gut，2019，68（8）：1516-1526.DOI：10.1136/gutjnl-2019-318427.

[23]JIN Y，BLIKSLAGER AT.The regulation of intestinal mucosal barrier by myosin light chain kinase/rho kinases[J].Int J Mol Sci，2020，21（10）：3550.DOI：10.3390/ijms21103550.

[24]LIU L，YIN MY，GAO JW，et al.Intestinal barrier function in the patho?genesis of nonalcoholic fatty liver disease[J].J Clin Transl Hepatol，2023，11（2）：452-458.DOI：10.14218/JCTH.2022.00089.

[25]HU HM，LIN AZ，KONG MW，et al.Intestinal microbiome and NAFLD：Molecular insights and therapeutic perspectives[J].J Gastro?enterol，2020，55（2）：142-158.DOI：10.1007/s00535-019-01649-8.

[26]SUN JY，F(xiàn)AN JM，LI TT，et al.Nuciferine protects against high-fat diet-induced hepatic steatosis via modulation of gut microbiota and bile acid metabolism in rats[J].J Agric Food Chem，2022，70（38）：12014-12028.DOI：10.1021/acs.jafc.2c04817.

[27]LI XL，SUN FX，ZHANG YX，et al.Analysis of intestinal flora in rats with non-alcoholic fatty liver disease based on 16S rRNA gene sequencing[J/CD].Chin J Liver Dis Electron Version，2023，15（4）：39-46.

李曉玲，孫鳳霞，張瑩雪，等.基于16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)分析非酒精性脂肪性肝病大鼠的腸道菌群[J/CD].中國(guó)肝臟病雜志（電子版），2023，15（4）：39-46.

[28]SONG W，WANG TY，CUI XL，et al.Lactobacillus coryniformis subsp.torquens T3 alleviates non-alcoholic fatty liver disease via re?construction of the gut microbiota and redox system[J].J Sci Food Agric，2023，103（14）：6814-6825.DOI：10.1002/jsfa.12774.

[29]PAN XF，WEN SW，KAMINGA AC，et al.Gut metabolites and inflam?mation factors in non-alcoholic fatty liver disease：A systematic review and meta-analysis[J].Sci Rep，2020，10（1）：8848.DOI：10.1038/s41598-020-65051-8.

收稿日期：2024-03-06；錄用日期：2024-04-11

本文編輯：王瑩

引 證 本 文 ： ZHAO CY， LI YQ， LI L. Effect of Bacillus licheniformis preparation on hepatic steatosis and intestinal mucosal barrier function in a rat model of nonalcoholic fatty liver disease[J]. J Clin Hepatol， 2024， 40（10）： 2000-2007.

趙春燕， 李逸群， 李莉. 地衣芽孢桿菌制劑對(duì)非酒精性脂肪性肝病 大鼠模型肝脂肪變性及腸黏膜屏障功能的影響[J]. 臨床肝膽病 雜志， 2024， 40（10）： 2000-2007.