番茄BURP 結構域基因家族全基因組鑒定及表達分析

摘要：BURP結構域蛋白為植物所特有，在植物生長發育和脅迫響應中起著重要作用。為鑒定番茄BURP結構域基因（SlBURP）及分析其表達，從番茄基因組中鑒定出12個SlBURP 基因，系統進化分析將其分為7個亞族，不同亞族的保守基序和基因結構有明顯差異。SlBURPs 啟動子序列中廣泛存在脅迫、生長、激素、光響應元件，表明該家族基因在對非生物脅迫的響應中有重要作用。共線性分析表明，番茄SlBURP 基因和擬南芥BURP 基因家族成員來自同一祖先。RT-qPCR表明，SlBURP6、SlBURP7、SlBURP8、SlBURP12 在葉中大量表達；SlBURP2、SlBURP6、SlBURP7、SlBURP8 在鹽處理后轉錄水平上升；在植物調節劑處理下SlBURP5、SlBURP8、SlBURP9、SlBURP12 基因在果實發育期的轉錄水平均有上升。綜上所述，SlBURP 基因在番茄生長發育和逆境脅迫中起著重要作用。

關鍵詞：番茄；BURP 基因家族；果實發育；鹽脅迫；表達分析

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0311

中圖分類號：S641.2 文獻標志碼：A 文章編號：1008‐0864（2024）08‐0051‐12

BURP 結構域蛋白是植物所特有的一種蛋白，在植物生長發育和脅迫響應中起重要作用[1]。BURP結構域蛋白家族以高度保守的C端氨基酸基序為特征，其名稱來源于油菜花粉蛋白BNM2、蠶豆胚蛋白USP、擬南芥干旱響應蛋白RD22和番茄多聚半乳糖醛酸酶PG1β這4個蛋白名稱的首字母[2‐3]。一般來說，含有BURP結構域的蛋白質包含幾個保守模塊：①在N端疏水結構域有1個假定的信號肽；②C端為BURP結構域，包括幾個保守的氨基酸位點和4個重復的半胱氨酸組氨酸（CH）基序，即CHX10CHX23-37CHX23-26CHX8W （X為任意氨基酸殘基）；③每個BURP蛋白中間都有1個可變區，包括1個短的保守片段或其他短片段；④由重復單元組成的可選段[4]。BURP結構域的差異導致其蛋白功能不同，且其亞細胞定位可能也截然不同。

近年來，在眾多植物中都發現BURP結構域基因（BURP）具有響應逆境脅迫功能。大豆（Glycinemax L.）BURP 基因SALI5-4a 和SALI3-2 被鋁誘導在根尖中的表達量上調，且SALI3-2 的過表達可提高酵母細胞的耐鹽性[5‐6]。玉米（Zea mays）BURP基因家族在脫落酸（abscisic acid，ABA）處理下表達上調，在冷脅迫下表達下調，并且也受鹽脅迫的影響[7]。油菜（Brassica napus）腋芽特異表達基因BnBDC1 在鹽、ABA和滲透性脅迫下表達水平上調[8]。BURP 基因在植物生長發育中也起著重要作用。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）和甘藍型油菜（Brassica napus）中，一些BURP 蛋白參與種子發育[9‐10]，其蛋白定位于高爾基體和液泡中[11]。大豆BURP蛋白可能參與調節合子胚胎發生的早期發育[12]。棉花（Gossypium spp）GhRDL1 基因可與GhEXPA1 基因互作，且它們共表達可顯著提高產量[13]。葡萄（Vitis vinifera）VvBURP1 基因在早期果實形態發育中發揮關鍵作用[14]。綜上所述，BURP 基因不僅在植物生長發育和脅迫響應中起重要作用，還可能參與植物激素信號通路。

番茄（Solanum lycopersicum）在我國蔬菜生產中占有重要地位，具有營養豐富、產量高等特點[15‐16]。但番茄在生長發育過程中面臨著各種環境脅迫[17]，從而影響番茄經濟產量。目前多數植物的BURP 基因家族被鑒定，并進行了詳盡的家族分析[4，18‐19]，但番茄中僅分離純化了PG1β 基因，該基因在番茄果實的果膠代謝中發揮重要作用[20]。而關于番茄BURP 基因家族的系統鑒定與分析尚未見報道。因此，本研究通過生物信息學方法在全基因組水平上鑒定番茄BURP 基因，分析其理化性質、基因結構、共線性、啟動子元件等，并結合RT-qPCR驗證其在果實發育以及鹽脅迫、噴施植物生長調節劑后果實中的表達模式，為深入解析番茄BURP 基因家族在抗逆、果實發育及對外源植物生長調節劑的響應機理提供理論基礎，同時為番茄屬優良基因資源發掘及品種抗逆改良提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

以加工番茄模式品種‘M82’為試驗材料，由新疆農業科學院園藝作物研究所番茄遺傳育種課題組提供。將其種植在新疆特色果蔬基因組研究與遺傳改良重點實驗室，培養條件為：光照16 h/黑暗8 h，溫度（22±4） ℃，光照強度100 μmol·m?2·s?1，相對濕度60%。待4葉期時，挑選長勢一致的番茄苗，取其根、莖、葉樣，液氮速凍?80 ℃保存備用。將4葉期的番茄苗進行200 mmol·L?1的NaCl脅迫處理，于處理0.0、0.5、2.0、4.0、6.0、8.0 和12.0 h取樣備用，每個處理設置3個生物學重復。

以櫻桃番茄‘京番粉星1號’品種為試驗材料研究BURP 基因在噴施植物生長調節劑后果實中的表達模式。分別在果實膨大期（expansionperiod，EP）、綠熟期（mature green period，MG）、轉色期（breaker period，BP）、紅熟期（red ripeningperiod，RRP）噴施不同水平的2，4-表油菜素內酯（2， 4-epibrassinolide， EBR）、褪黑素（melatonin，MT）、萘乙酸（naphthaleneacetic acid， NAA），以蒸餾水為對照（CK），詳見表1。每個處理設置3個生物學重復。

1.2 數據來源

從茄科基因組數據庫（http：//solomics.agis.org.cn/tomato/）下載番茄和馬鈴薯（Solanum tuberosum）基因組注釋文件，水稻（Oryza sativa）的基因組注釋文件下載自EnsemblPlants（http：//plants.ensembl.org/info/data/ftp/index.html），擬南芥的基因組注釋文件下載于TIAR （http：//www.arabidopsis.org），玉米的基因注釋文件下載于玉米遺傳和基因組數據庫（http：//maizegdb.org/genmoe）。

1.3 番茄BURP 基因的鑒定

從Pafm數據庫（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/text/）下載BURP結構域的隱馬爾可夫文件（PF03181）[21]，以擬南芥、水稻、馬鈴薯和玉米BURP 基因的蛋白序列作為種子序列，本地構建BLAST庫，從番茄基因組中比對提取出BURP 候選基因（E-value=1×10-10）。利用Smart （http：//smart.embl.de/）和NCBI CDD （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）在線軟件分析驗證番茄BURP 基因的結構域，最終確定番茄BURP 基因[22‐23]。通過在線Expasy （https：//web.expasy.org/protparam/）工具預測番茄BURP 基因的理化性質[24]，通過WoLFPSORT （https：//www.genscript.com/wolf-psort.html？src=leftbar）在線軟件進行番茄BURP蛋白的亞細胞定位[25]。

1.4 多物種BURP 系統進化樹構建

利用MEGA7 軟件將擬南芥、水稻、玉米、馬鈴薯和番茄的BURP 蛋白的氨基酸序列進行比對分析，并通過鄰接法（neighbour-joining，NJ）和最大似然法（maximum likelihood，ML）構建系統發育樹，Bootstrap檢驗設定為2 000次重復[26]。

1.5 番茄BURP 基因結構和保守基序分析

基于已有的番茄gff文件和番茄BURP 基因家族，利用TBtools 軟件繪制番茄BURP 基因結構。利用Docker得到SlBURP 基因家族的meme.xml文件，然后利用TBtools軟件預測分析SlBURP蛋白序列的結構域[27]，搜尋motif值設置為20，其他為默認參數。

1.6 番茄BURP 基因染色體定位

根據基因組注釋文件得到染色體長度和番茄所有BURP 基因位點，再利用TBtools 軟件進行構圖。

1.7 番茄BURP 基因啟動子-順式作用原件和共線性分析

利用番茄基因組注釋文件提取番茄BURP 基因上游和下游2 000 bp的序列作為候選啟動子序列。通過PlantCare （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網站進行順式作用元件分析[28]，使用TBbool 軟件繪制順式作用元件圖[27]。利用TBtools 軟件進行多物種的基因共線性分析，最后使用Multiple Synteny Plot進行繪圖。

1.8 番茄BURP 基因的RT-qPCR 驗證

使用天根生化科技（北京）有限公司的RNA-prep純植物試劑盒（DP441）提取總RNA，再用All-In-One 5X RT MasterMix 反轉錄試劑盒（ABM）進行反轉錄，獲得cDNA。利用DNAMAN6軟件設計SlBURPs 家族成員RT-qPCR 引物（表2）。RT-qPCR 反應體系（20 μL）包含：10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix （諾唯贊）、8.2 μL ddH2O、上下游引物各0.4 μL、1 μLcDNA模板。PCR程序為94 ℃預變性120 s；94 ℃變性5 s，退火15 s，72 ℃延伸10 s，40個循環。以番茄Actin 為內參基因，3個生物重復。采用2-△△Ct法[29]計算相對表達量。

2 結果與分析

2.1 番茄BURP 基因鑒定及理化性質分析

通過番茄全基因組鑒定，最終確定番茄BURP 基因家族成員12個，分別命名為SlBURP1～SlBURP12。由表3可知，番茄BURP 基因家族成員編碼的氨基酸序列長度差異較大，為322～1 200 aa，分子量為30 030.04～131 593.70 Da。其中，SlBURP6的氨基酸序列長為322 aa，分子量為30 030.04 Da；SlBURP2 的氨基酸序列長為1 200 aa，分子量為131 593.7 Da。等電點為6.05～9.22，其中2/3的基因等電點大于7，說明大多屬于堿性蛋白。脂肪指數和親水性表明，番茄BURP蛋白較為穩定，為疏水性蛋白。亞細胞定位主要定位在細胞質、細胞核、葉綠體和胞外。

2.2 番茄BURP 蛋白的系統進化分析

為研究BURP蛋白進化關系，對擬南芥（4個）、水稻（17個）、玉米（10個）、馬鈴薯（26個）、番茄（12個）和4個BURP蛋白家族（AtRD22、VfUSPs、BNM2和LePG1β）共73個BURP蛋白進行系統發育分析，結果（圖1）表明，它們被聚為7個亞族：BNM2-like、USP-like、RD22-like、PG1-like、BURP Ⅴ、BURP Ⅵ和BURP Ⅶ。12個番茄SlBURP 基因成員分布在BNM2-like、RD22-like、PG1β-like 這3 個亞族；馬鈴薯的26 個BURP 基因也分布在這3 個亞族。由于馬鈴薯和番茄都屬于茄科雙子葉植物，因此推測茄科中的BURP 基因功能較為相似。BURPⅤ、BURP Ⅵ和BURP Ⅶ這3 個亞族全是水稻和玉米的BURP 基因家族成員，或許這3個亞族是單子葉植物特有的BURP 基因家族。綜上所述，這些亞家族的BURP蛋白可能在單子葉、雙子葉植物中向不同的方向進化，并表現出不同的功能。

2.3 番茄BURP 編碼蛋白的保守基序與基因結構分析

由圖2 可知，SlBURP3～SlBURP5、SlBURP10、SlBURP12相似性較高，都屬于RD22-like亞族，具有motif 1、motif 2、motif 3、motif 7、motif 8，其中SlBURP3和SlBURP5的保守基序排列和數目均一樣，SlBURP10和SlBURP12的保守基序排列和數目一樣；SlBURP1 和SlBURP2 相似性較高，均為BNM2-like 亞族，具有motif 1、motif 2、motif 3、motif 7，且保守基序的排列一樣；SlBURP6～SlBURP9和SlBURP11相似性較高，屬于PGlβ-like亞族，它們都具有motif 1～motif 6、motif 9 和motif10。綜上所述，同一亞族成員的保守基序十分相似。

進一步分析番茄12 個BURP 基因的編碼區（coding sequence， CDS）和非翻譯區（untranslated"region，UTR），結果（圖2B）表明，BNM2-like亞族的SlBURP1 和SlBURP2 有1個內含子和2個外顯子；USP-like 亞族的SlBURP3 和SlBURP5、SlBURP10和SlBURP12 有3個外顯子；而SlBURP4 有8個外顯子。由此表明，同一亞族的基因結構也較為相似。

2.4 番茄BURP 基因的染色體定位分析

12個番茄BURP 基因不均勻地分布在6條染色體上（圖3）。Chr3、Chr6、Chr8這3條染色體的長臂末端各有1個BURP 基因，分別是SlBURP6、SlBURP11、SlBURP12。Chr5染色體有4個BURP基因，分別是SlBURP7～SlBURP10，多聚集在其長臂的頂端。Chr2分布有3個BURP 基因，分別是SlBURP3～SlBURP5。Chr1 有2 個BURP 基因，分別是SlBURP1 和SlBURP2，分布在長臂末端。

2.5 番茄BURP 基因啟動子中的順式作用元件分析

在SlBURPs 啟動子中，發現了6 種植物激素響應作用元件，分別為生長素（AuxRR-core 和TGA-element）、赤霉素（P-box、TATC-box和GAREmotif）、乙烯（ERE）、甲基茉莉酸（CGTAC-motif和TGACG-motif）、水楊酸（TCA-element）和脫落酸（ABRE）；4種脅迫響應作用元件，分別為厭氧誘導（ARE）、干旱（MBS）、防御和應激響應（TC-richrepeats）、冷應激（LTR）；18種光響應作用元件，分別為ACE、G-box、GT1-motif、MRE、Box4、ATCTmotif、I-box、GATA-motif、TCT-motif、AE-box、TCCC-motif、AE-box、GA-motif、Box Ⅱ、chs-CMA2a、chs-CMA1a、LAMP-element、AT1-motif；7種生長發育調控元件，分別是細胞周期（MSA-like）、生長（Circadian）、種子調控（RY-element）、代謝（O2-site）、分生組織（CAT-box）、胚乳（GCN4_motif）、柵欄葉肉細胞（HD-Zip 1）。挑選脅迫、生長、激素、光響應中數量最多的控制元件生成熱圖，結果（圖4）表明，從整體來看，4 類順式作用元件在SlBURPs 啟動子序列都有分布。其中，光響應元件在每個基因中都大量存在，激素響應元件ABRE、TGACG-motif 在每個基因中也存在較多，其中SlBURP4 基因屬于RD22-like亞族，有大量的ABRE。CAT-box 僅存在于SlBURP3、SlBURP4、SlBURP7、SlBURP8 中，且主要在SlBURP7、SlBURP8 中。SlBURP7、SlBURP8 為PG1β-like 亞族，說明SlBURP7、SlBURP8 主要控制植物生長發育。ARE 在11 個SlBURP 中都有分布，表明SlBURPs 基因在氧脅迫上也有重要作用。TC-richrepeats分布于9個SlBURP 中。LTR 和MBS分布于5個SlBURP 中。以上結果表明，BURP 基因在番茄中的生長發育與脅迫響應中起重要作用。

2.6 多物種間BURP 基因共線分析

為揭示番茄BURP 基因家族的進化及和直系同源的關系，對番茄、擬南芥、馬鈴薯、玉米和水稻BURP 基因家族進行共線性分析，結果（圖5）表明，4個擬南芥BURP 基因與番茄的12個BURP 基因有5個同源基因對，說明番茄和擬南芥BURP 基因家族成員具有較高的共線性，可能來自同一祖先；番茄和馬鈴薯有7個同源基因對；而水稻和玉米BURP 基因與番茄BURP 基因沒有同源基因對，說明水稻、玉米的BURP 基因與番茄BURP 基因在進化中存在分離，水稻、玉米BURP 基因可能屬于單子葉特有的1個亞族。

2.7 番茄BURP 基因的組織特異表達分析

檢測SlBURP 在番茄不同組織器官中的表達模式，結果（ 圖6）表明，SlBURP2、SlBURP3、SlBURP6、SlBURP7、SlBURP8、SlBURP10、SlBURP11、SlBURP12 在番茄根、莖、葉中均有表達；SlBURP6、SlBURP7、SlBURP8、SlBURP12 在葉中高表達，其中SlBURP8、SlBURP12 在葉中表達量分別是根中的17.0、25.0倍，是莖中的3.4、14.0倍；SlBURP2 在根、莖、葉中的表達水平較一致；SlBURP10 在根中表達量較高。

2.8 番茄BURP 基因在鹽脅迫和植物生長調節劑處理下的表達分析

在200 mmol·L-1 NaCl處理下，大部分SlBURP基因均對鹽脅迫產生積極響應（圖7）。SlBURP2、SlBURP6、SlBURP7、SlBURP8 的表達量較0 h均上調。其中，SlBURP7、SlBURP8 屬于PG1β-like 亞族，在脅迫2和4 h達到最高值，在8 h下調，12 h又上調，這2個基因的表達模式較一致。

與對照組相比，在植物生長調節劑處理下，果實發育受到了顯著影響（ 圖8）。在轉色期，SlBURP5 在NAA10、EBR0.05、MT150處理后顯著上調；在紅熟期，SlBURP5 對NAA30、EBR0.05、MT150 處理響應最顯著；SlBURP8 和SlBURP9在NAA、EBR、MT 處理下整均顯著上調，其中，SlBURP8 在NAA30、EBR0.05、MT50 處理下的表達量分別為對照組的108、93、15倍，SlBURP9 在NAA20、EBR0.05、MT100的處理下表達量分別為對照組的94、90、31倍，表明這2個基因受NAA、EBR、MT強烈誘導。在綠熟期，SlBURP12 在3種植物生長調節劑處理下的表達量較對照組顯著上調，其中在NAA30、EBR0.1、MT150處理下最為顯著，且在EBR0.1處理下其表達量是對照組的19倍，說明SlBURP12 可能在果實發育期起調控作用。值得注意的是，SlBURP5 在所有時期3種植物生長調節劑處理下的表達量與對照組相比均有明顯差異，表明其在果實發育全程起著重要的調控作用。

3 討論

BURP 蛋白家族是植物界中廣泛存在的、比較保守的結構基因家族，在胚胎形成和種子發育過程中具有重要功能。BURP 基因家族在植物生長發育、非生物脅迫、激素響應等方面起著不可或缺的作用，但不同植物中的BURP 基因數量有較大差異。番茄中有12個BURP 基因，大約是水稻（17）的2/3、陸地棉（65）的1/5、大豆（23）的1/2，但和玉米（10）相近[4，19，30]。番茄BURP 基因在第2和5號染色體上分別有4和3個；在第1、2、5號染色體上均成簇出現，且這些基因的序列也較相似，其在亞族上的分布和保守基序的排列和數量也基本一致。這種現象在水稻、陸地棉、大豆等作物上也有發現[4，19，30]。此外，在這些成簇的基因中，5號染色體的SlBURP8 和SlBURP9 發生了串聯復制事件。位于毛果楊4號染色體上的PtBURP1和PtBURP2，以及9號染色體上的基因簇也發生了基因復制事件[31]。在陸地棉中，基因復制特別是片段復制在GhBURP 基因家族的形成中起著重要作用[18]。綜上所述，基因復制在BURP 基因對植物生長發育和脅迫響應中起重要作用。

系統發育樹把來自5個物種的BURP 家族成員分為7個亞族。RD22-like、PG1β-like亞族由雙子葉和單子葉植物的BURP 基因組成。BURP Ⅴ、BURP Ⅵ和BURP Ⅶ亞族僅由單子葉植物的BURP 基因組成；而BNM2-like亞族由雙子葉植物的BURP 基因組成。這說明BURP 基因可能起源于單子葉和雙子葉分化之前，且單子葉植物和雙子葉植物間在功能上可能也存在差異。研究表明，單子葉植物和雙子葉植物的部分BURP 基因也會分布在不同亞族 [4，10，18‐19，32‐33]。

BURP 蛋白家族參與脅迫誘導[34-36]。本研究表明，番茄中有7個BURP 基因不同程度的受鹽和植物生長調節劑的誘導或抑制，這與水稻BURP基因響應鹽脅迫的結果一致[4]。擬南芥AtRD22 基因由非生物脅迫（干旱和鹽度）誘導，且該基因隨后被用作脅迫反應的指標[9]。本研究發現，在果實發育過程噴施植物生長調節劑NAA、EBR、MT，SlBURP5、SlBURP8、SlBURP9、SlBURP12 均受到不同程度的誘導，其中，SlBURP8、SlBURP9 在NAA、EBR處理下的表達量顯著高于對照組。在果實發育的4 個時期，SlBURP5 在EBR0.05、SlBURP12 在MT150處理下均上調，說明SlBURP基因在番茄果實發育中起著重要作用。含有BURP結構域的蛋白已在許多植物中被發現，且BURP 基因家族也參與植物營養和生殖發育功能[37]。因此，本研究利用生物信息學方法對番茄BURP 基因家族篩選和鑒定，并根據RT-qPCR檢測其在逆境脅迫和植物生長調節劑處理下的表達模式，為深入研究番茄BURP 基因在非生物脅迫和果實發育中的調控機理提供了理論依據。

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