金蕎麥轉錄組SSR位點分析及分子標記開發

摘 要 金蕎麥具有較高的醫療保健價值，目前缺乏相應的分子工具用于系統評價金蕎麥資源以保護及利用種質資源，SSR標記能夠應用于植物多樣性評價、品種鑒定以及遺傳圖譜構建等領域。為揭示金蕎麥根系轉錄組SSR分布特征，開發更多有價值的SSR標記，本研究利用Krait軟件對其46 923個Uingenes序列的SSR位點進行檢索和標記開發。結果顯示，在1 783個Unigenes序列中包含1 961個SSR位點，SSR分布頻率為3.80%，平均分布間距為1/17.00 kb；其中三核苷酸重復基序數量最多（54.92%），其次是單核苷酸重復基序（23.36%）和二核苷酸重復基序（10.76%）；共發現104種重復基序，其中A/T的出現頻率最高 "（23.10%），其次是AAG/CTT（16.32%）和AG/CT（5.61%）。隨機合成了115對SSR引物，基于12份金蕎麥種質資源檢測其多態性，結果得出98對引物（85.2%）能擴增出目標條帶，其中36對引物有多態性。單個SSR引物平均能檢測到3.83個變異位點，多態信息含量（PIC）為0.15～0.96，平均為0.53；12個金蕎麥之間的遺傳相似系數為0.47～0.76，平均值為0.55，表明12個金蕎麥種質具有一定的遺傳多樣性。本研究鑒定金蕎麥根系轉錄組SSR標記，有效增加了金蕎麥遺傳多樣性評價、品種鑒定和重要性狀遺傳機制的解析等研究中可用的分子標記，為金蕎麥分子育種的深入研究奠定了基礎。

關鍵詞 金蕎麥種質；轉錄組；SSR分子標記；聚類分析

金蕎麥（Fagopyrum cymosum）為蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum）多年生半灌木植物，又有苦蕎頭、野蕎麥及紅三七等別稱，是多年生野生大粒型蕎麥的總稱[1]。金蕎麥原產于中國西南地區，現廣泛分布于尼泊爾、不丹、印度以及中國西藏、云南、貴州等地[2]。金蕎麥富含多酚類、甾體、萜類、有機酸類、黃酮類等物質，常以干燥的根莖入藥，因其有較強的抗菌活性以及增強機體免疫能力等功能而被載入《中華人民共和國藥典》和《中國獸藥典》[3-5]。近年來，金蕎麥人工栽培種產量和品質難以滿足日漸增加的市場要求，而野生資源因過度采伐瀕臨滅絕，已被列為了國家二級保護植物。目前，由于缺乏系統的金蕎麥資源評價體系，極大地限制了對金蕎麥種質資源的保護及有效利用。因此，金蕎麥種質資源的鑒定不但對野生金蕎麥資源的保護具有重要作用，也有利于金蕎麥資源的開發利用。

目前，SSR標記已廣泛應用于植物多樣性評價[6-7]、品種鑒定[8]以及遺傳圖譜構建[9]等領域。蕎麥屬的三大栽培種中普通蕎麥和苦蕎基因組及轉錄組SSR分子標記已大規模開發，并已廣泛應用于蕎麥屬植物種質資源遺傳多樣性評價[10-13]、群體結構分析[14]和重要農藝性狀的關聯分析[15-16]等研究中。金蕎麥是苦蕎的野生近緣種，其基因組大小（1.08 Gb）是苦蕎（0.48 Gb）的兩倍多，遺傳信息更為豐富[17]。然而金蕎麥SSR標記的研究及應用還相對匱乏，目前僅趙莎等[18]利用5對金蕎麥基因組SSR分子標記對來自云南、貴州、四川的野生金蕎麥樣本進行遺傳多樣性分析及聚類分析。任奎[19]利用甜蕎10對SSR引物對497份金蕎麥種質資源進行了遺傳多樣性分析，進一步驗證了西南地區是野生蕎麥的多樣性中心。近年來，金蕎麥的轉錄組[20-21]和基因組[17]序列相繼釋放，為大規模開發金蕎麥SSR標記奠定了基礎。

本研究分析了金蕎麥根系轉錄組Uingenes序列SSR的信息和分布特征，利用12份金蕎麥種質篩選多態性SSR引物，并進行遺傳多樣性分析，研究結果將為金蕎麥親緣關系鑒定、種質資源評價以及遺傳圖譜構建等研究提供多態性豐富的SSR標記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及DNA提取

隨機選取12份金蕎麥種質作為轉錄組SSR引物多態性研究的材料（表1）。材料常年種植于貴州師范大學蕎麥產業技術研究中心安順研究基地（106°12′E，26°9′N）金蕎麥種質圃，于2022年3月采取其幼嫩葉片，采用CTAB法提取基因組DNA[22]，使用B-500超微量分光光度計（中國上海元析儀器）測定DNA濃度和純度。將檢測合格的DNA樣品稀釋至100 ng·μL-1置于 "-20 ℃冰箱保存，備用。

1.2 轉錄組SSR位點搜索及引物合成

利用貴州師范大學生命科學學院貴州省蕎麥工程技術研究中心前期基于高通量測序獲得的金蕎麥根系轉錄組的Unigenes序列[20]，采用Krait軟件搜索其SSR位點并設計引物。SSR位點搜索參數設置為：單至六核苷酸重復的最小重復次數分別為12、7、5、4、4和4次。SSR引物設計參數為：引物長度18～20 bp，目標產物大小100～300 bp，GC含量30%～80%，退火溫度58" ℃～60 ℃。

1.3 SSR引物的擴增和電泳

PCR反應體系為：DNA模板1 μL（100" "ng·μL-1），上下游引物各1 μL（10" "μmol·L-1），Green Taq Mix（中國南京諾唯贊），6 μL，補雙蒸水至12 μL，再加入10 μL石蠟油。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s；最適退火溫度（Tm），退火30 s；72 ℃復性" "45 s，32個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物加入6 μL的6×上樣緩沖液，利用DYCZ-30C雙板夾芯式垂直電泳儀（北京六一儀器廠）進行8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯影后，拍照記錄帶型。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 金蕎麥根系轉錄組SSR位點信息

在金蕎麥轉錄組的46 923個Unigenes序列中共搜索到1 961個SSR位點，分布在1 783條Unigenes上，發生頻率（含有SSR的Unigene個數/Unigene總數）為3.80%。其中，含2個及以上SSR位點的Unigene序列有178條，其余 "1 626條序列均含1個SSR位點；SSR出現頻率（SSR個數/Unigene總數）為4.18%，SSR平均分布間距1/17.00 kb（表 2）。

2.2 金蕎麥根系轉錄組SSR分布特征

金蕎麥轉錄組SSR類型主要集中于單至三核苷酸重復，共占SSR總數的89.04%，其中單核苷酸占23.36%，二核苷酸占10.76%，三核苷酸重復數目最多占54.92%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸SSR分布較少，分別占比5.86%、 "2.29%、2.80%。共有104種重復基元類型，單至六核苷酸重復分別有2、4、9、21、23和45種（表 2）。從重復基元分布比例來看，單核苷酸重復基元 "A/T占SSR位點總數比例最高，為23.10%，其次是三核苷酸重復基元AAG/CTT，分別為16.32%；二核苷酸重復基元以AG/CT占比最高，為 "5.61%（圖 1）。

金蕎麥轉錄組SSR基序長度平均為16.25 bp，單至六核苷酸SSR基序的平均序列長度分別為14.36、16.19、16.33、17.18、20.67及24.98 bp（表 2）。SSR重復長度以15～19 bp最多，占比為67.87%，25～29最少，占比為0.15%；SSR重復次數以5次最多，10次最少；單核苷酸主要重復次數為12～15次，二核苷酸主要重復次數為 "7～11次，三核苷酸主要集中主要重復次數為5～7次，其他3種核苷酸類型主要重復次數為4次（圖 2）。各類型SSR數量均隨著重復長度的增加而減少，其中15 bp重復長度的SSR數量最多，19 bp數量最少；單核苷酸重復長度主要分布在 "12～17 bp，二核苷酸重復長度分布較為分散，主要集中在14 bp和16 bp，三至六核苷酸主要重復長度分別為15 bp、16 bp和20 bp，六核苷酸主要重復長度均為24 bp（圖 3）。

2.3 金蕎麥根系轉錄組SSR標記開發與驗證

用Krait軟件共設計1 961對SSR引物，隨機選擇115對引物對12個金蕎麥種質的基因組DNA進行擴增，共有98對引物能在金蕎麥中有效擴增，擴增效率為85.22%；擴增片段大小范圍為63～800 bp，其中36對SSR引物有多態性，多態性比率為36.73%（圖4）。36對多態性引物在12個金蕎麥種質中共擴增出138條帶，平均每對引物擴增出3.83條，多態性條帶有110條，共擴增出119種帶型，平均1對引物有3種帶型；多態信息含量（PIC）范圍為0.15～0.96，平均值為0.53；其中引物BCuni37047的總條帶數、多態性條帶數、帶型最多（8條、8條、9種）以及BCuni1746的PIC值最高（0.96）（表 3）。

2.4 金蕎麥種質的聚類分析

基于36對多態性SSR引物分析12份金蕎麥種質的遺傳關系（圖 5），從UPGMA聚類圖可以看出，12份金蕎麥種質遺傳相似系數介于 "0.47～0.76，說明這12份金蕎麥種質間存在著一定的遺傳變異。當遺傳相似系數在0.61時，供試種質被分為4類。‘紅心金蕎’與其他在種質遺傳背景較遠，單獨聚為一類；第Ⅱ類包含‘巨大F1’和‘B9-11’兩個種質，二者均收集于貴陽市，遺傳背景較為接近；第Ⅲ類包含4個種質，分別為‘A7-2’‘A6-6’‘A3-1’和‘金酮1號’，說明這 4個種質具有相近的遺傳背景；其余5個種質‘矮金蕎’‘A2-6’‘A11-6’‘A3-4’和‘A1-1’均來自貴州省被聚為第Ⅳ類，說明這5個種質遺傳關系較近，與其他種質遺傳關系較遠（圖5）。

3 討論與結論

源自于轉錄組的SSR標記，比來自基因組的SSR標記具有更強的通用性，也更有利于后期與重要農藝性和品質狀進行關聯分析[25]。本研究從金蕎麥轉錄組的46 923個Unigenes序列中共發現1 961個SSR位點，SSR位點的出現頻率（1/17.00 kb）遠小于甜蕎根系轉錄組（1/1.71 kb）[26]、種子轉錄組（1/1.17 kb）[27]和花序轉錄組（1/8.21 kb）[28]以及苦蕎籽粒轉錄組（1/7.81 kb、1/1.73 kb）[11，29]。SSR位點以三核苷酸重復基序為主，比例為54.92%，與苦蕎轉錄組的研究結果一致[12]，與甜蕎根系轉錄組以單核苷酸重復基序為主（48.13%）的研究結果不符[25]。金蕎麥根系轉錄組SSR以單核苷酸重復基元A/T數量最多，這與甜蕎[26]和苦蕎[12]轉錄組SSR的研究結果相同；二核苷酸重復基元以AG/CT最高，這與防風的研究結果一致[30]。三核苷酸的優勢基元是AAG/CTT，不僅與蕎麥屬轉錄組SSR的特征相同也與川黨參[31]、油茶[32]及黑棗[33]等雙子葉植物的研究結果相同，與水稻、高粱、玉米等單子葉植物CCG/CGG為優勢基序的研究結果存在差異[34]。以上研究結果表明，SSR位點的出現頻率、三核苷酸重復類型和各類型的優勢基序的差異主要與物種、樣品來源、序列數量、序列長度統計對象及SSR搜索標準等因素有關。

蕎麥屬有20余個種[35]，其分子標記相關研究主要集中在甜蕎和苦蕎這兩個栽培種上，金蕎麥的研究較少且僅為基因組SSR標記的開發。本研究根據金蕎麥根系轉錄組高通量測序數據，設計合成了115對引物并進行多態性驗證，其中有98對引物能夠有效擴增，擴增效率為 "85.22%；其中有36對有多態性，多態性比率 "36.73%，高于苦蕎（32.97%）[29]與甜蕎 "（30.00%）[30，36]的多態率。36對多態性引物在12份金蕎麥種質擴增的PIC值為0.15～0.96，其中高度和中度多態性位點的SSR共有33對，占比 "91.7%，表明金蕎麥基于轉錄組序列開發多態性較高的SSR標記經濟可行，能有效地豐富金蕎麥SSRs數據庫。

中國西南地區是世界公認的蕎麥起源和遺傳多樣性中心，許多學者通過不同方法在分子水平上對金蕎麥種質資源進行了評價及鑒定，探索了每個聚類群組的遺傳特征、地理分布及生物學意義，揭示了金蕎麥樣品之間的遺傳關系。趙莎等[18]利用5對SSR標記對不同產地野生金蕎麥SSR標記鑒定，結果表明：云南、貴州居群的金蕎麥種群關系近，四川與云南、貴州兩居群種群關系相對更遠。張春平等[37]利用隨機擴增的多態性DNA（RAPD）標記對重慶市7個野生金蕎麥居群的87個個體進行遺傳多樣性分析和聚類分析，發現金蕎麥種內有豐富的遺傳多樣性。鄧蓉等[38]應用簡單序列重復間區（ISSR）標記對貴州省內11個不同地域的金蕎麥種質進行了遺傳多樣性與親緣關系分析，發現11份種質間遺傳差異較小且相對穩定。程成[39]采用內轉錄間隔區（ITS）、matK分子標記手段對收集的云南省內金蕎麥進行遺傳多樣性和親緣關系分析，得出了海拔是影響其分類的主要因素的結論。本研究利用36對多態性SSR引物對12份金蕎麥種質進行了遺傳多樣性和聚類分析，遺傳相似系數為0.47～ "0.76，遺傳多樣性較好，每個類群間的遺傳相似系數均大于0.60，證明各類群間的親緣關系較近。

綜上所述，本研究揭示了金蕎麥根系轉錄組SSR位點的信息，開發了一批SSR分子標記，獲得36對SSR標記，揭示了金蕎麥種質資源的遺傳多樣性。研究結果對于豐富蕎麥屬植物SSR分子標記種類，促進金蕎麥種質資源的評價與利用、開展品種鑒定和雜交種真實性鑒定以及重要農藝和品質性狀的解析等奠定了基礎。

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Transcriptome SSR Loci Analysis and Molecular MarkerDevelopment" in" Fagopyrum cymosum

Abstract The medical and healthcare value of Fagopyrum cymosum is widely acknowledged.However， the systematic evaluation and conservation of its germplasm resources face challenges due to a lack of molecular tools.SSR markers， crucial for assessing plant diversity， identifying species， and mapping genes， offer a solution.This study explored the distribution of SSR loci within the root transcriptomes of Fagopyrum cymosum to develop valuable SSR markers.Krait software was utilized to analyze 46 923 Unigene sequences，identifying 1 961 SSR loci across 1 783 Unigenes， indicating a 3.80% occurrence rate with an average spacing of 1 per 17.00 kb.Trinucleotide repeats emerged as the predominant form， accounting for 54.92%， overshadowing mononucleotide （23.36%） and dinucleotide （10.76%） repeats.Among 104 distinct repeat motifs， A/T motifs were the most common at" "23.10%， followed by AAG/CTT （16.32%） and AG/CT （5.61%）.The synthesis of 115 SSR primer pairs led to polymorphic screening across 12 Fagopyrum cymosum germplasm samples， resulting in 98 pairs （85.2%） amplifying expected bands and 36 pairs exhibiting polymorphism.The average allelic variation detected by a single SSR primer was 3.83， with polymorphic information content （PIC） ranging from 0.15 to 0.96， averaging 0.53.Genetic similarity coefficients among the 12 analyzed" Fagopyrum cymosum germplasms ranged from 0.47 to 0.76， with a mean of 0.55， demonstrating notable genetic diversity.This study not only identifies SSR markers within the root transcriptome of Fagopyrum cymosum but also significantly enriches the repository of molecular markers for comprehensive genetic diversity studies， species identification， and the investigation of significant trait genetic mechanisms.This foundation supports the advancement of molecular breeding research in Fagopyrum cymosum.

Key words Fagopyrum cymosum germplasms; Transcriptome; SSR molecular marker; Cluster analysis