陸地棉GhUGP1基因的克隆與表達分析

摘 要 為進一步了解UGPase在棉花中的作用，根據全基因組測序結果，篩選且克隆了在陸地棉纖維發育過程中的關鍵基因 GhUGP1。利用生物信息學方法對其核苷酸和氨基酸序列進行分析，通過同源重組技術，將 GhUGP1基因的編碼序列構建到原核表達載體pMAL-C4x上，通過IPTG誘導蛋白表達來確定IPTG誘導蛋白的最佳條件，最后利用Western Blot鑒定重組蛋白。結果顯示， GhUGP1（XP_040931642.1）全長序列 "6 572 bp，編碼區1 404 bp，編碼467個氨基酸，預測分子質量約為51.493 ku，等電點為5.86。氨基酸序列比對分析發現在陸地棉、亞洲棉、木槿等不同物種間UGP序列的相似率為90.63%。進化樹分析結果顯示GhUGP1蛋白與亞洲棉UGP蛋白親緣關系最近，同源性最高并在一個分支上。亞細胞定位結果顯示該蛋白為核膜共定位。蛋白誘導時由于IPTG濃度梯度結果差別不明顯，選擇IPTG終濃度為0.3 mmol/L，而溫度梯度和時間梯度結果差異明顯，確定最佳誘導溫度為28 ℃，最佳誘導時間為6 h，蛋白溶解及純化的溫度和時間為28 ℃誘導6 h。Western Blot結果表明重組蛋白的大小正確，最終成功獲得了大小為95.9 ku的pMAL-C4x-GhUGP1重組蛋白，為后期對 GhUGP1功能深度解析提供幫助。

關鍵詞 陸地棉； GhUGP1基因；克??；序列分析；原核表達

棉花（Gossypium spp）是不可或缺的經濟作物，棉花纖維在已知的天然纖維中純度最高，在全球紡織業中具有重要價值，為人類提供了巨大的利益，是全球重要的原材料[1]。雖然國內棉花總產較高，但是纖維品質較差，因此改善纖維品質成為棉花育種的重點。纖維品質包括纖維長度、強度、馬克隆值等。其中纖維強度主要由細胞壁強度決定，植物細胞壁包含纖維素、半纖維素和果膠三大類多糖，以及酚類化合物和細胞壁蛋白。果膠可連接纖維素、非纖維素和其他基質，因此其對改良棉花纖維品質具有重要作用[2]。在果膠合成的三條途徑中，UDP-葡萄糖途徑備受關注。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（UGP）對于多糖生物合成來說十分關鍵[3]，并且對植物生長發育也起到重要作用[4]。其中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）在植物各個組織和器官中均有存在，并且UGPase與糖代謝密切相關[5]。在糖代謝的途徑中，UGPase可逆催化尿苷三磷酸（UTP）和葡萄糖-1-磷酸（Glucose1-phosphate）反應生成尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和焦磷酸（PPi），這是一個可逆反應，反應公式為Glucose-1-phosphate+UTPPPi＋UDPG[6]。其中UDPG可作為胞外信號分子來影響植物生長[7]，也是形成纖維素、半纖維素等重要細胞壁聚合物的前體[8]。UGPase最先于1953年在酵母細胞中被發現[9-10]。研究發現UGPase可分為兩類，分別是UGPase-A和UGPase-B，且各自結構差異明顯沒有同源性[11]。UGPase在自然界中分布較廣，目前已在部分動物[12]、植物[13-15]及微生物[16]中發現并研究，但對于植物來說只有被子植物中含有UGPase[17]。在棉花中UGP基因參與纖維素及糖類化合物的合成，并可能在棉花纖維發育中起重要作用[18-19]。

本研究通過對陸地棉轉錄數據分析并用qRT-PCR進行驗證，篩選到陸地棉纖維發育過程中的關鍵基因 GhUGP1，對其進行生物信息學分析并構建原核表達載體，通過設置異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）濃度、時間及溫度梯度發現利用IPTG誘導蛋白的最佳條件，成功在體外表達，為后續深入研究蛋白互作，UGP基因功能及創制纖維品質優良的種質材料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

高保真酶TransStart FastPfu DNA Polymerase（含2.5 mmol/L dNTPs）、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物公司；DNA Marker（D2000）、快速質粒小提試劑盒（DP105）、（DP441）RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、大腸桿菌DH5α和BL21DE3）均購自天根生化科技（北京）有限公司；GatewayTMBP ClonaseTMII 酶混合物和GatewayTMLR ClonaseTM酶混合物購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；IPTG、4×蛋白上樣緩沖液（含巰基還原劑）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluorid，PMSF）、30%制膠液（29∶1）購自北京索萊寶科技有限公司；MBPSep Dextrin Agarose Resin 6FF（MBP標簽蛋白高度交聯純化樹脂）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司Tween 20/吐溫20（Reagent grade）購自碧云天生物；pDONORZeo（Zeo+）和pMAL-C4x（Amp+）載體由新疆農業科學院核技術生物技術研究所作物分子植物育種課題保存；SL0911農桿菌侵染液（煙草專用）購自北京酷來搏科技有限公司；其他試劑均為化學分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 GhUGP1基因熒光定量驗證 對棉花開花后0、5、10、15、20、25 d時期的纖維進行取樣，利用天根DP441試劑盒提取樣品的RNA，用全式金試劑盒進行RNA反轉錄，獲得cDNA，用15 g/L瓊脂糖檢測條帶。利用Snap Gene軟件設計 GhUGP1基因（Ghir_A08G004240.1）的qRT-PCR引物。使用全式金qPCR SuperMix試劑盒進行qRT-PCR，儀器LightCycler 480 Instrument II，反應體系和儀器程序參照說明書。內參基因為GhUBQ7（該基因在棉花各組織，細胞中穩定表達，且不受外源或內源因素的影響）[20]， "3個重復，運用2-△△Ct法計算。

1.2.2 GhUGP1基因序列的獲得及原核表達載體構建 根據棉花全基因組測序結果以TM-1 cDNA克隆 GhUGP1基因并將其連接到pMAL-C4x（MBP）載體上。根據 GhUGP1基因（Ghir_A08G004240.1）的CDS序列設計并合成添加BP接頭引物進行擴增（表1），擴增體系為50 μL：cDNA 3 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、dNTPS（2.5 mmol/L）10 μL、PCR Stimulant（5×）0.5 μL、5×Fly Buffer 10 μL、Trans Start Fast Pfu Fly Buffer 1 μL、ddH2O 23.5 μL。PCR擴增程序：預變性98 ℃ 5 min，以下程序32個循環（變性98 ℃ 5 min、退火55 ℃ 30 s、延伸72 ℃" "90 s），最終延伸72 ℃ 5 min。用15 g/L瓊脂糖電泳檢測PCR產物。

利用Gateway克隆技術構建載體，利用BP反應將目的片段連入中間載體pDONOR/Zeo，反應體系為：1.5 μL ddH2O、1 μL" pDONER/Zeo（Zeo+）、2 μL PCR產物、0.5 μL Gateway BP Clonase。25 ℃放置4 h轉化至DH5α，涂于含博來霉素（Zeo）抗性的培養皿。挑取單克隆檢測完畢后將陽性菌液送去上海生工生物技術有限公司（http：//www.sangon.com /sangon）測序。測序正確后提取質粒。

利用LR反應構建超表達載體及原核表達載體，反應體系為：1.5 μL ddH2O、1 μL pGWB405（Spe+）/pMAL-C4x（Amp+）、1 μL pDONER/Zeo-GhUGP1質粒、0.5 μL Gateway LR Clonase。室溫放置4 h，轉入DH5α，涂于含氨芐青霉素（Amp）抗性的培養皿，挑取單克隆檢測，提取質粒后將質粒轉入BL21感受態，挑取單克隆陽檢，選擇陽檢正確的菌液，保菌并進行后續 "試驗。

1.3 GhUGP1基因的序列分析

通過多種在線工具對 GhUGP1的序列進行分析。利用Expasy在線工具查找蛋白的分子質量和等電點。利用NCBI中的ORF" finder預測開放閱讀框架。利用NCBI中的Blast對其蛋白序列進行同源性分析、DNAMAN對多重序列進行比對。利用MEGA" 7.0內置的ClustalW程序進行多序列比對后構建系統發生樹。bootstrap值設置為5 000、p-distance模型采用鄰近法（Neighbor-Joining，NJ）構建GhUGP1蛋白與其他物種蛋白的系統進化樹。

1.4 亞細胞定位分析

利用Gateway技術將 GhUGP1的編碼區構建到表達載體中形成融合質粒 pGWB405-GhUGP1，將測序正確的質粒利用電轉法轉入農桿菌GV3101，陽檢后選擇正確的菌液保菌， "-80 ℃保存。取2 mL活化后的農桿菌菌液進行離心收菌，使用煙草侵染液重懸菌體，并調節重懸液的OD600值為0.7～0.8，避光靜置2～3 h后用注射器注射侵染生長5～8周的健康幼嫩的煙草葉片，每株煙草注射2～3個葉片，使菌液在煙草葉片內部擴散，將侵染后的煙草植株標記并在黑暗條件下放置48 h后使用激光共聚焦顯微鏡檢測熒光信號表達情況。

1.5 目的蛋白的誘導及可溶性分析

將轉化BL21感受態后陽檢正確且活化的大腸桿菌菌液按1∶50的比例加入含有Amp抗性的LB液體培養基中37 ℃培養至OD600為0.6～0.8時，取5 mL菌液分裝于5個試管內，再分別加入IPTG使其終濃度達到0.1、0.3、0.5、0.7及0.9 mmol/L即可，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清，向沉淀中加入50 μL的1×磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）重懸菌體，再加入等量的4×蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，在冰上冷卻后取15 μL進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測，根據試驗結果確定IPTG的最佳 "濃度。

根據上述的試驗結果再分別設置時間梯度（0、2、4、6、8 h）和溫度梯度（18 ℃、28 ℃、37 ℃）培養結束后分別收集菌液。將收集的菌液4 ℃、 "8 000 r/min離心10 min，倒掉上清，于沉淀中加入50 μL的1×PBS溶液使其重懸，再加入50 μL 4×蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，在冰上冷卻后取20 μL進行SDS-PAGE檢測，根據試驗結果確定IPTG誘導的最佳時間及溫度。

在重組蛋白pMAL-C4x-GhUGP1成功誘導表達后，再根據摸索出的最佳誘導表達的條件。對目的蛋白進行可溶性分析。誘導表達結束后取600 mL菌液4 ℃、8 000 r/min離心10 min，向沉淀菌體中加入20 mL 1×PBS溶液重懸，采用超聲破碎，頻率60 kHz，超聲處理30 s，每次間隔 "3～5 s，持續6～10 min。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，于上清沉淀中分別加入4×蛋白上樣緩沖液，取20 μL進行SDS-PAGE檢測，分析蛋白的可溶性。

1.6 目的蛋白的純化

pMAL-C4x-GhUGP1重組蛋白純化：將10 mL破碎后的菌液4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清微濾處理并加入裂解液與2 mL 靜置后的MBPSep Dextrin Agarose Resin 6FF（MBP標簽蛋白高度交聯純化樹脂）混勻，4 ℃搖晃1 h使蛋白與樹脂充分結合，過柱收集流出液；用 "5 mL洗脫緩沖液（1 mol/L Tris-Cl" pH=8.0， "10 mmol/L還原型谷胱甘肽）收集洗脫液，用于SDS-PAGE檢測。

1.7 Western Blot檢測重組蛋白

將目的蛋白和純化蛋白經過處理后，進行SDS-PAGE檢測。結束后將蛋白膠放入提前預冷好的轉膜液中浸泡5～10 min，利用Bio-Rad半干轉膜儀將浸泡好的蛋白膠轉到PVDF膜上，20 V恒壓轉膜1 h即可。轉膜結束后將膜夾出，正面朝下放入10 mL含有5%脫脂奶粉的1×PBS溶液常溫搖晃封閉1 h，封閉結束后按照1∶8 000的比例加入一抗，常溫孵育3 h或者4 ℃搖晃過夜。用PBST溶液將膜漂洗3遍，每遍5 min。然后將膜放入5～10 mL 1×PBS溶液中，按 "1∶10 000的比例添加二抗，常溫孵育3 h，用PBST溶液將膜漂洗3～5遍，每遍5～10 min。然后在漂洗干凈的PVDF膜上加入Western發光檢測液A、B。用保鮮膜封好于暗匣內放置 "10～30 min，結束后用蒸餾水輕輕沖洗，待膜晾干后進行觀察。

2 結果與分析

2.1 GhUGP1基因熒光定量驗證

通過qRT-PCR對 GhUGP1在棉纖維不同發育時期的表達模式分析發現（圖1），該基因在棉花纖維發育期的表達量逐漸上升，在花后20 d時表達量最高，說明其可能參與棉花纖維的發育并在纖維發育伸長時起到重要作用。

2.2 pMAL-C4x-GhUGP1原核表達載體的構建

以陸地棉cDNA為模板，BP-GhUGP1-F和BP-GhUGP1-R為引物，擴增獲得1000bp至2 000 bp之間的目的條帶（圖2-A），與 GhUGP1基因片段大小基本相符。回收PCR產物進行BP反應，后將連接產物轉化到DH5ɑ感受態細胞中，涂布于含有Zeo抗性的固體培養基中，經陽檢測序后獲得1 404 bp的片段（圖2-B），表明pDONER/Zeo-GhUGP1入門載體構建成功。提取BP質粒后進行LR反應，陽檢后將正確的質粒轉化到BL21感受態細胞中，涂布于含有Amp抗性的固體培養基中，經陽檢測序后獲得1 404 bp的片段（圖2-C），表明pMAL-C4x-GhUGP1原核表達載體構建成功。

2.3 GhUGP1基因的序列分析

經NCBI網站的ORF finder程序預測發現，這條序列含有完整的閱讀框， GhUGP1全長序列6 572 bp，編碼區長1 404 bp，編碼467個氨基酸，預測分子質量約為51.493 ku，等電點為5.86。將 GhUGP1基因的氨基酸序列與其他植物的UGP1蛋白序列進行了氨基酸序列比對分析，結果如圖3所示，整體相似性較高，為93.61%，說明UGP1在這些植物中較保守。

經NCBI網站的BLAST程序獲得多個物種與GhUGP1的同源蛋白。使用MEGA" 7.0軟件的NJ法構建系統進化樹（圖4）。結果顯示，陸地棉GhUGP1蛋白與亞洲棉（Gossypium arboreum）UGP親緣關系最近，與木槿（Hibiscus syriacus）親緣關系較近，可能是因為陸地棉、亞洲棉及木槿同為被子植物門錦葵科，因此它們之間的親緣關系相比其他物種較近。

2.4 GhUGP1基因的亞細胞定位分析

為進一步研究 GhUGP1的亞細胞定位情況構建了 GhUGP1與GFP的融合載體，轉化農桿菌陽檢后，侵染煙草葉片，觀察 GhUGP1在煙草葉片中的熒光信號，共聚焦熒光顯微鏡檢測顯示， GhUGP1在細胞核和細胞膜上都有熒光信號，表明 GhUGP1基因所編碼的蛋白質共定位于細胞膜和細胞核上（圖5）。

2.5 IPTG誘導蛋白的最佳條件

為了確定IPTG的最佳誘導濃度，在轉化了pMAL-C4x-GhUGP1，且OD600為0.6～0.8的菌液中分別用不同IPTG終濃度（0、0.1、0.3、0.5、0.7及0.9 mmol/L）進行37 ℃誘導3 h，結果顯示，目的條帶的大小約為95.9 ku（圖6-A），與預測結果相符，表明GhUGP1在大腸桿菌中成功表達，且根據條帶的清晰度確定IPTG的最佳誘導濃度為0.3 mmol/L。

為了確定IPTG的最佳誘導時間，在轉化了pMAL-C4x-GhUGP1，且OD600為0.6～0.8的菌液中用相同IPTG終濃度（0.3 mmol/L）分別進行37 ℃誘導0、2、4、6、8 h，結果顯示，pMAL-C4x-GhUGP1能在大腸桿菌中成功表達，且在誘導6 h時的條帶較清晰（圖6-B），因此可以確定IPTG誘導的最佳時間為6 h。

為了確定IPTG的最佳誘導溫度，在轉化了pMAL-C4x-GhUGP1，且OD600為0.6～0.8的菌液中用相同IPTG終濃度（0.3 mmol/L）分別進行18、28、37 ℃，進行SDS-PAGE分析，結果顯示（圖6-C），且IPTG誘導的最佳溫度為28 ℃。

最終，最佳條件為IPTG的終濃度為0.3 mmol/L，誘導溫度為28 ℃，誘導時間為6 h，并用這些結果進行后續的可溶性分析及Western Blot檢測。

2.6 蛋白的可溶性分析、純化及Western Blot檢測于28 ℃誘導pMAL-C4x-GhUGP1的表達，將誘導表達后所得的菌液超聲破碎后分別取上清和沉淀部分進行SDS-PAGE電泳檢測，發現重組蛋白主要存在于沉淀中（圖7），但是上清中也有部分蛋白，因此pMAL-C4x-GhUGP1為可溶性蛋白。SDS-PAGE檢測發現，重組蛋白pMAL-C4x-GhUGP1被成功洗脫，條帶較為單一，表明純化成功（圖7）。將pMAL-C4x-GhUGP1重組蛋白進行Western blotting檢測，結果表明，純化后的GhUGP1重組蛋白，在PVDF膜上約95.9 ku處有一明顯條帶（圖7），與預期結果一致，說明重組蛋白pMAL-C4x-GhUGP1與抗體發生特異性結合。

3 討" 論

UGPase是植物糖代謝途徑中的一個關鍵酶，主要通過偶聯蔗糖磷酸合酶（SPS）和蔗糖合酶（SuSy）來參與植物的糖代謝。蔗糖合酶主要是分解蔗糖形成葡萄糖與果糖[21]，而葡萄糖（Glc）又是棉花纖維伸長過程中的所需物質[22]，有研究發現蔗糖合酶表達量與纖維起始數目多少和纖維伸長度呈線性關系，在棉花纖維起始和伸長過程中具有重要作用[23]。

Wang等[24]發現在棉花中GhUGP基因的表達量受乙烯誘導的影響，在擬南芥中異源表達后植株的淀粉、可溶性糖及纖維素含量增加。本研究中qRT-PCR結果顯示 GhUGP1在棉花纖維發育期的表達量逐漸上升，UGP基因可能參與調節棉花纖維發育，是棉花纖維發育的重要候選基因。Pang等[25]發現UGP1基因的表達量提高后，纖維中寡糖的含量降低，UDPG的合成提高，從而調控細胞壁的合成。還有研究發現UGP基因在植物體內的表達會受外界條件的影響，施加碳源和氮源能有效提高香菇菌絲UGP基因的轉錄表達水平[26]。佟巖等[27]發現在鐵皮石斛中UGP基因的表達量受外界溫度的影響。郭鑫[28]發現興安落葉松中的LgUGPase1和LgUGPase2基因主要參與植物的代謝調控，并對外界環境和植物激素有一定的響應。研究發現低濃度Cd2+促進三角褐指藻生長，并提高三角褐指藻中UGP基因的表達量[29]。張帆等[30]發現在水稻過表達OsUGP后UGPase酶活性，并且胞內多糖含量和胞外多糖含量都上升，表明OsUGP對多糖合成具有正向作用。近年來，研究人員還從黨參[31]、落葉松[32]、海帶[33]中分離克隆出了UGPase基因。這些結果都為UGP基因家族的研究提供了寶貴的材料。

本研究從陸地棉中克隆出 GhUGP1基因編碼區為1 404 bp，編碼467個氨基酸，預測分子質量約為51.493 ku，通過UGP氨基酸序列比對及系統進化樹分析顯示，GhUGP1氨基酸片段與其他植物有較高的同源性（93.61%），表明UGP基因編碼區保守性較高，與前人報道的結果類似[34]。qRT-PCR結果顯示 GhUGP1可能參與棉花纖維發育，與前人結果一致[35]。將其構建到表達載體pWGB405和pMAL-C4x上，亞細胞定位結果顯示該蛋白為核膜共定位，通過蛋白誘導梯度試驗確定了當IPTG終濃度為0.3 mmol/L、誘導溫度為28 ℃、誘導時間為6 h時重組蛋白可被成功誘導且效果最佳，后獲得可溶性的pMAL-C4x-GhUGP1蛋白并進行了純化，Western Blot試驗驗證了純化后蛋白的正確性，所以克隆和鑒定棉花中的UGPase基因對棉花糖代謝途徑及纖維發育研究具有重要意義。

棉花作為新疆的重要經濟，提高棉花產量，改良棉花纖維品質成為棉花產業可續發展的關鍵。本研究根據棉花全基因組測序結果克隆出 GhUGP1基因的編碼區，并構建出了表達載體，利用IPTG成功誘導pMAL-C4x-GhUGP1重組蛋白。為后續在棉花中研究尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在纖維發育中的功能及分子機理奠定基礎。

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Cloning and Expression Analysis of "GhUGP1 Gene" from Gossypium hirsutum

Abstract This study aimed to understand the role of UGPase in cotton further. GhUGP1， a key gene in fibre development of Gossypium hirsutum， was screened and cloned based on whole genome sequencing results.Bioinformatics was then employed to analyze GhUGP1 nucleotide and amino acid sequences， and its coding sequences were subsequently inserted into a prokaryotic expression vector pMAL-C4x through the homologous recombination technique.IPTG-induced protein expression was used to determine the optimal conditions for IPTG-induced protein.Finally， Western Blot was used to identify the recombinant protein.The results showed that the full-length sequence of "GhUGP1 （XP_040931642.1） is 6 572 bp， with a coding region of 1 404 bp， encoding 467 amino acids， a predicted molecular mass" of about 51.493 ku， and an isoelectric point of 5.86.Amino acid sequence comparison analysis revealed that the similarity rate of UGP sequences among different species， such as Gossypium hirsutum， Gossypium arboreum， and Hibiscus syriacus was 90.63%.The results of evolutionary tree analysis showed that the GhUGP1 protein was closest to the UGP protein from Gossypium arboreum， with the highest homology， and on the same branch.The results of subcellular localization showed that the protein was co-localized at the nuclear membrane.The results of protein induction were not obvious due to the IPTG concentration gradient; thus， we chose the condition that the final concentration of IPTG was 0.3 mmol/L.The results of the temperature gradient and time gradient were obvious： the optimal induction temperature was 28 ℃， the optimal induction time was 6 h， and the temperature and time of protein solubilization and purification were 28 ℃ with induction for 6 h.The Western Blot results showed that the size of the recombinant protein was correct， and finally， the pMAL-C4x-GhUGP1 recombinant protein with a size of 95.9 ku was successfully obtained， which will help to analyze the function of GhUGP1 in depth at a later stage.

Key words Gossypium hirsutum； GhUGP1 gene； Cloning;" Sequence analysis;" Prokaryotic expression