紅花玉蘭嫩枝扦插生根的轉錄組和內源激素變化分析

摘 要 為探究紅花玉蘭嫩枝扦插不定根發生的分子機制，利用1" 000 mg/L的萘乙酸（NAA）處理當年生嫩枝進行扦插，分別對新采回枝條及插穗生根過程中不同階段進行取樣，開展RNA-Seq與內源激素水平分析。結果表明，（1）通過RNA-Seq總共組裝了186 303個Unigene，其中88 161條Unigene得到注釋，總注釋率達到了47.32%。通過差異表達基因分析可知，相較于新采回插穗的階段S0，在經NAA處理6" h后的S1、根原基突破表皮的S2和不定根伸長的S3階段上調表達基因分別有5 796、3 205和4 262個，下調表達基因分別有3 795、5 248和6 305個；KEGG 富集分析顯示這些基因大多聚集于苯丙素生物合成、植物激素信號轉導、淀粉和蔗糖代謝等通路中，其差異表達可能與紅花玉蘭的扦插生根密切相關。（2）內源激素水平分析表明：與新采回插穗S0相比，S1階段插穗中IAA、ABA、GA3和CTKs（IP和Zeatin）濃度均顯著上升；在S2階段IAA和ABA濃度顯著降低，但IAA/ABA比值顯著升高，GA3和IP濃度升至最高且與其他階段相比差異顯著，而Zeatin變化不明顯；至不定根伸長的S3階段IAA和ABA濃度顯著回升，而GA3和CTKs濃度則顯著下降。綜合分析表明，生長素、脫落酸和細胞分裂素等內源激素的動態變化及其比值促進了根原基形成和不定根的伸長生長，植物激素信號轉導相關基因的差異表達與內源激素水平的升降相一致，最終誘導紅花玉蘭嫩枝插條生根。

關鍵詞 紅花玉蘭；扦插生根；轉錄組測序；內源激素；差異表達基因

紅花玉蘭（Magnolia wufengensis L.YMa et L.R.Wang）是近些年來在湖北省宜昌市五峰縣被發現的木蘭科（Magnoliaceae）木蘭屬（Magnolia）植物新種[1]，為高大落葉喬木。紅花玉蘭性狀原始，外形優美，氣味芬芳，花朵大且顏色鮮艷，自然變異豐富，具有極高的觀賞與利用價值，被認定為林木良種，是深受歡迎的園林綠化優良樹種[2]。由于該物種的分布范圍有限，加之野生資源的過度采挖和生長環境的嚴重破壞，導致其數量急劇減少，目前已陷入瀕危狀態。近年來，對紅花玉蘭的研究主要集中在種質資源保護與遺傳多樣性[3-4]、抗逆性[5-7]、扦插技術[8]以及花發育調控[9-11]等方面，而對該物種在扦插過程中的不定根發生機制還未見報道。紅花玉蘭的繁育周期較長，目前常用的繁育手段主要為播種育苗和嫁接。然而，由于其種殼過于厚重，透水透氣性不佳，導致播種育苗過程中發芽率較低。此外萌發的幼苗對水分和光照反應敏感，幼苗成活率不高[12]；同時由于種子雜合性高，實生苗往往不能保持優良株系的特性，使其應用及觀賞價值大打折扣。嫁接繁殖作為一種繁殖技術，其操作難度較高，同時在嫁接完成后對嫁接苗的管理看護條件也較為嚴格，導致成本投入較大，難以實現大規模推廣。相較之下，扦插繁殖作為林木快速繁殖的理想技術，既可以解決因種子萌發困難以及后代實生苗變異大的問題，維持優良品種的遺傳性狀；也可以避免因嫁接等方式帶來的投入成本高、培育時間長以及管理條件嚴苛等難題。

扦插再生過程，實際上是植物處于非生物脅迫狀態下的一種再生過程。扦插中再生不定根的過程概括為3個連續的階段[13]：第一階段，剛剛剪下的外植體會感知傷口和環境等上游信號；第二階段，這些上游信號會在葉肉、維管等細胞中指導生長素的合成，隨后生長素通過極性運輸到達傷口附近的形成層等干細胞；第三階段，傷口附近的形成層等干細胞在較高濃度的生長素作用下進行細胞命運的轉變，從而形成不定根。不定根的發生是植物扦插再生過程中最關鍵的一步，但其機制目前還未被完全揭示。宣磊等[14]利用RNA-seq技術深入研究中山杉（Taxodium ‘Zhongshanshan’）不定根發育過程中SHR-SCR信號途徑的 "ThSHR3和 ThSHR1基因在中山杉扦插生根過程中的調控機理，發現這兩個基因的表達在不定根發生過程呈逐漸上升的趨勢，在根的生長期表達量達到最高。杜小龍等[15]對不同生根階段的桑樹（Morus alba L.）硬枝扦插皮部生根的插穗進行轉錄組與蛋白質組測序，篩選鑒定出21個差異表達基因，其中多酚氧化酶（PPO）、生長素酰胺水解酶（ILL）、肌氨酸氧化酶（SOX）編碼基因、馬鈴薯糖蛋白（Patatin）和脂肪氧合酶（LOX）這5個基因，在生根過程中持續上調表達，調控酚類物質氧化與IAA合成、游離態IAA的釋放等，誘導不定根的發生。

植物激素與扦插生根息息相關，是生長素、赤霉素、脫落酸等植物激素間相互作用的結果。其中，生長素扮演著重要角色，調控植物不定根的發育。大量研究發現生長素對植物不定根的發生與伸長具有顯著的促進作用，使用外源生長素處理插穗既能夠促進根原始體的形成，也可以促進不定根的伸長，進而提高插穗的成活率[16]。目前已經報道了多個參與生長素信號轉導途徑的基因，如TIR1/AFB、Aux/IAA和ARF蛋白家族，能夠控制不定根的發育。研究發現，植物對生長素的感知是通過TIR1/AFB家族中的F-box蛋白與生長素/吲哚乙酸（Aux/IAA）家族中的蛋白結合進而導致其多泛素化和蛋白水解[17]，進而解除其對生長素反應因子ARFs的抑制，開啟生長素下游信號的響應。在擬南芥中，生長素信號轉導途徑的 "SHY2/IAA3和 "SLR1/IAA14及 "MSG2/IAA19等基因會影響側根的生長，而 "AUX1和SHR/SCR信號轉導途徑的 "NAC1等基因的過表達會促進側根的發育[18]。脫落酸（ABA）在植物生長發育的過程中扮演著至關重要的角色，其響應各種脅迫中的功能和信號通路已被廣泛研究，現在公認ABA在植物適應包括干旱、寒冷或高鹽在內的環境脅迫中扮演重要角色，調控植物對環境脅迫的響應和增強抗逆性[19-20]。植物在遭遇非生物脅迫時，其體內ABA的含量變化最為劇烈，這種現象不僅調節了整個植物生命周期中的許多發育過程，還對種子成熟和休眠、種子萌發、營養發育和衰老等方面產生了顯著影響[21]。張錦春等[22]測定沙生檉柳（Tamarix taklamakanensis M.T.Liu）扦插生根過程中的ABA含量，發現其整體呈升高后降低再升高的趨勢，前期升高以增強損傷脅迫的耐受性，中期含量維持較低水平有利于根原基形成，生根后ABA含量升高從而增強自身的抗性。赤霉素（GA）在扦插過程中同樣不可缺少，赤霉素濃度的高低與不定根誘導生成有著密切的關系[23]。DELLA蛋白在GA信號傳導途徑中作為負調控因子，對植物生長發育過程進行調節。此外，DELLA蛋白還具有協同整合其他植物激素和外部環境信號的功能，從而成為調節植物生長發育的重要樞紐蛋白。馮健[24]研究發現，落葉松[Larix gmelinii （Rupr.） Kuzen.]扦插生根過程中，通過降解DELLA蛋白，提升GA信號效應來促進不定根的發生。

本研究以紅花玉蘭不定根發生4個階段的插穗作為試驗材料，利用轉錄組測序分析其在不同生根時期的差異表達基因，結合內源激素水平的動態變化來探討紅花玉蘭扦插生根的分子基礎，為紅花玉蘭樹種資源保護和規模化繁育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在湖北省宜昌市五峰土家族自治縣選取健康無病蟲害的4 a生紅花玉蘭實生苗作為采穗母樹，于2020年7月初剪取靠近頂部的當年生枝條作為插穗。對新采回的枝條、外源激素1 000 mg/L NAA處理6 h后、扦插15 d和35 d的插穗進行取樣，分別命名為S0、S1、S2和S3，每個樣品重復3次，用于轉錄組測序和內源激素含量測定。樣品立即置于液氮中進行快速冷凍，并在 "-80 ℃下保存，備用。

1.2 扦插方法

在清晨進行插穗制備時，選擇長8～12 cm的枝條，保留1～2個節和上部1～2個葉片，并確保切口平滑；完成消毒后，將插穗浸泡于萘乙酸NAA溶液中6 h，同時以清水處理為對照組。扦插深度應控制在3～5" cm；每個處理梯度扦插200株插穗，重復3次[25]。

扦插基質為營養土（丹麥品氏泥炭土）∶河沙（1∶2）混合攪拌，消毒后于智能連棟溫室內備用。

插后管理：通過噴霧和濕簾裝置保證溫室內空氣相對濕度在80%～95%，溫度在25 ℃～ "30 ℃；控制基質含水量在50％～60％。每隔 "15 d噴施0.3%的磷酸二氫鉀。

1.3 轉錄組測序

選取不同階段的紅花玉蘭插穗樣本送往北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉錄組測序。

轉錄組測序所需的RNA提取、建庫均在公司完成，采用高通量測序（Illumina）進行測序分析。利用DESeq2（1.20.0）軟件篩選紅花玉蘭4個階段下表達水平顯著差異的基因，以|log2FC|≥1且P≤0.05作為篩選條件和判定標準，分別對比S1時期與S0時期、S2時期與S0時期和S3時期與S0時期的紅花玉蘭插穗之間的轉錄組數據，篩選出與扦插生根相關的差異表達基因（DEGs）；對DEGs進行GO功能富集分析和KEGG通路分析，在GO富集分析中，認為 "P-valuelt;0.05為顯著富集項；在KEGG富集分析中認為Corrected P-value lt; 0.05的 pathway為顯著富集項；使用Excel 2016進行繪圖。

1.4 內源激素檢測

使用串聯質譜儀測定紅花玉蘭扦插生根過程中4個時期插穗材料的內源激素，主要檢測激素為IAA、GA3、ABA、異戊烯基腺嘌呤（IP）與玉米素（Zeatin），每個樣品重復3次。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序及分析

2.1.1 轉錄組測序及功能注釋 表1為紅花玉蘭插穗4個時期材料的轉錄組測序結果。總有效堿基為80.55 Gb，總有效序列為536" 965 374。除S2_3外，余下組別滿足Q20的序列全部超過98%。測定序列中的鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）核苷酸的GC含量為45.97%～47.06%。使用Trinity程序組裝clean reads轉錄組數據后，拼接得到Unigenes的數量為186 303。將得到的Unigenes在七大數據庫中進行注釋，至少有一個數據庫注釋成功的Unigenes數目有88161，占全部Unigenes的47.32%；而在所有數據庫中均成功注釋的Unigenes有5 557個，占全部Unigene的2.98%（表2）。

2.1.2 差異表達基因分析 采用DESeq[26]進行分析，篩選閾值為padjlt;0.05，結果見圖1。與S0相比，紅花玉蘭扦插生根S1、S2和S3階段轉錄組測序分析獲得的差異表達基因數分別為9 591、8 453、10 567；差異上調表達基因分別有5 796、 "3 205、4 262；差異下調表達基因分別有3 795、 "5 248、6 305。通過維恩分析發現，對比S1 vs S0和S2 vs S0，共有1 883個差異表達基因；S1 vs S0與S3 vs S0之間存在2 315個共有的差異表達基因；而S3 vs S0與S2 vs S0之間則有3 867個相同的差異表達基因。綜合3組數據，共有 "1 035個差異表達基因（圖2）。

2.1.3 差異表達基因的 GO 功能分析 對紅花玉蘭插穗不同時期樣本的1 035個差異基因進行了GO功能分析，發現共有的6個GO功能類別（圖3）。在全部4個時期中，最顯著富集的GO功能類別位于分子功能方面（Molecular function，MF），其中具體功能是氧化還原酶活性（GO：0016491）。此外，在MF方面還包含了葡萄糖基轉移酶活性（GO：0046527）和鈣調蛋白結合（GO：0005516）等功能。在生物過程方面（Biological process，BP），最顯著富集的GO功能類別是磷酸化（GO：0016310）。此外，BP還包括單機體碳水化合物（GO：0044723）和多糖生物合成過程等（GO：0033692）。這些GO功能類別的富集提示，在紅花玉蘭扦插生根過程中，這些特定功能可能發揮著重要的作用。這些發現有助于更深入地理解紅花玉蘭扦插生根的分子機制，為紅花玉蘭的分子育種提供了有價值的研究內容。

2.1.4 差異表達基因的 KEGG 通路分析 對紅花玉蘭插穗不同時期的差異基因KEGG富集分析，發現在S1時期相比S0時期之間存在757個差異基因，這些基因被映射到了前20個KEGG通路中（表3）；經研究發現，在S2時期相比S0時期之間存在639個差異基因，這些基因被歸屬于KEGG前20個通路中（表4）；有803個基因在S3時期相比S0時期的差異基因中被富集到KEGG前20個通路中（表5）。這些通路包括輔助因子和維生素代謝、氨基酸代謝、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、脂類代謝和其他次級代謝產物生物合成等7個類別的代謝途徑。植物體內合成細胞壁與根導管細胞結構的關鍵成分之一是木質素，苯丙素生物合成與植物體內木質素生物合成之間聯系密切。因此，在不定根伸長S3時期相比S0時期的差異基因中，參與苯丙素生物合成的基因數量最多。分別對2個不同時期的差異基因進行了KEGG富集分析，富集到的通路集中在淀粉與糖代謝（Starch and sucrose metabolism）以及植物激素信號轉導（Plant hormone signal transduction）中，因此可以推斷這2個通路與紅花玉蘭扦插生根之間存在較為密切的關聯。

在植物激素信號轉導通路中，參與多種植物激素穩態與代謝通路調節的基因包括GID1、IAA、DELLA、NPR1、PYL和ABF等轉錄因子。富集分析結果顯示，這些DEGs中的一部分參與了生長素（IAA）合成途徑、赤霉素（GA）信號轉導途徑和脫落酸（ABA）信號轉導途徑。

2.2 內源激素含量檢測

2.2.1 紅花玉蘭扦插生根過程中激素含量的變化 在紅花玉蘭插穗生根過程的初始階段（S1），經過NAA處理過的插穗中內源激素IAA和ABA含量顯著高于未處理的新鮮插穗（S0）（圖4-A、4-C），此時ABA濃度在4個階段中最高，可能與其在脫離母體時所遭受的逆境脅迫有關。到根原基形成階段（S2），IAA和ABA的變化趨勢十分相似，呈現出顯著的持續性下降趨勢，反映了低水平的IAA和ABA對根原基形成具有促進作用。與S2階段相比，在不定根伸長階段（S3）IAA和ABA含量顯著升高，但仍顯著低于S0和S1階段，反映不定根的伸長需要生長素的促進，在較高的ABA濃度下，對不定根伸長的抑制作用相對較低，而對根原基形成的影響更為顯著。在S1和S0階段，IAA/ABA值并未表現出顯著差異。然而，在根原基形成階段（S2），IAA/ABA值顯著升高并達到頂峰；而在不定根伸長時期（S3），盡管IAA/ABA值顯著降低，但仍高于S1階段的水平（圖4-E）。反映ABA與IAA之間可能存在著動態平衡，較高的IAA/ABA比值對紅花玉蘭扦插生根過程中的根原基形成和不定根伸長生長具有促進作用。

在紅花玉蘭整個扦插生根過程中，GA3的濃度相較于其他內源激素來說明顯降低（圖4-B）。經過NAA處理后S1階段和根原基形成的S2階段分別與其相鄰的前一階段相比，GA3的含量均顯著上升，并于根原基形成后達到最高，而后在不定根伸長階段（S3）逐漸下降到與初始階段相近，表明較高水平GA3含量對根原基的形成有促進作用，而不定根的伸長生長對GA3的需求有所降低。此外，Zeatin的含量較低，僅0.06～0.13" "ng/g（圖4-F），而IP含量變化較大。與S0階段相比，S1時期IP濃度無明顯差別，在根原基形成的S2階段IP含量急劇上升至最高，不定根伸長的S3階段插穗內IP濃度顯著降至最低水平（圖4-D）。反映較高濃度的細胞分裂素可以促進根原基的形成，而在不定根伸長階段則需要維持在較低水平。

2.2.2 扦插生根相關差異基因的篩選 結合插穗不同時期樣本中內源激素水平的變化和DEGs的KEGG分析，選擇3個可能參與調控紅花玉蘭扦插生根的差異表達基因（表6）。它們分別為Cluster-53.109833（生長素早期響應基因AUX/IAA，圖5-A）、Cluster-53.31619（ABA信號轉導上游受體蛋白基因PYL，圖5-B）和Cluster- "53.95403（GA信號轉導負調控蛋白基因DELLA，圖5-C）。

3 討" 論

扦插繁殖是木本植物最重要的一種無性繁殖方法。植物在扦插繁殖過程中其不定根的發生是由一系列十分復雜的與植物激素信號轉導相關的基因共同作用的結果。通過解剖和生理生化的研究發現，紅花玉蘭扦插過程中不定根的發育是一個十分復雜的過程，有皮部生根和愈傷組織生根兩種[27]。為了進一步發掘紅花玉蘭扦插過程中不定根的發生機制，本研究對其嫩枝扦插生根過程中的差異表達基因及內源激素的動態變化開展 "研究。

本研究發現，參與植物激素信號轉導通路的差異基因數量始終位于前3位。TIR1/AFBs-Aux/IAAs-ARFs核內信號通路是經典的生長素轉錄信號通路，通過降解與生長素響應因子ARF相互作用的AUX/IAA轉錄抑制子來啟動下游生長素信號轉導[28-30]。蘇江等[31]研究發現，AUX/IAA家族相關基因與 "TIR1基因過量表達可以增加馬尾松不定根的產生數量，調控馬尾松不定根的生長。Lakehal等[32]在擬南芥中發現了3個Aux/IAA基因（ "IAA6、 "IAA9和 "IAA17），在生長素存在的情況下，生長素受體TIR1和受體蛋白AFB2與 IAA6、 IAA9和 IAA17形成特異性傳感復合物，以控制不定根的啟動。張煥欣等[33]研究發現IAA生物合成的限速酶編碼基因 OsYUCCA1和生長素輸出載體蛋白At ABCB19在辣椒不定根發生的誘導期和啟動期表達量顯著提高。本研究中AUX/IAA在不定根發生階段顯著上調表達，參與調控IAA合成基因的表達以及生長素極性運輸，提升生長素響應從而促進細胞的分裂與分化，進而誘導根原基的形成。許多研究證明脫落酸與根的發育聯系密切，常被認為是根系生長的抑制因子。在南京椴（Tilia miqueliana Maxim.）嫩枝扦插生根過程中，高含量ABA對不定根的發育產生抑制，此外IAA、ABA具有相互協調作用，IAA/ABA比值可作為衡量扦插生根能力的指標[34]。邢璐[35]研究發現脫落酸的受體蛋白PYL8和PYL9可以與轉錄因子MYB相互作用，由于該轉錄因子是生長素信號通路的一部分，所以PYL蛋白可能通過MYB影響了生長素信號通路，實現了兩種植物激素的交互影響，從而調控擬南芥的側根生長。王青等[36]研究發現麻楝（Chukrasia tabularis" A.Juss.）扦插生根進程中ABA含量變化趨勢為先升高后降低，因此低濃度ABA有利于插穗生根與生長。在ABA信號轉導途徑中，PYL蛋白作為ABA的上游受體蛋白，正調控ABA信號轉導過程[37]。本研究中，PYL基因在根原基形成和不定根伸長階段均下調表達，推測該基因可能通過正調控ABA信號，降低插穗中ABA濃度，減弱其對生根的抑制作用。赤霉素（GA3）參與調控植物側根發育主根生長等發育過程，高水平GA通過加速DELLA降解來抑制黃酮醇的合成，而黃酮醇的含量與生長素含量呈負相關，赤霉素通過調節黃酮醇的含量改變根尖中生長素含量，從而影響根的生長[38]。Simone等[39]研究發現，番茄的自然遺傳變異Rg1可以提高根和芽的形成，該等位基因還能夠逆轉DELLA突變體pro中低水平的體外根和芽形成。DELLA基因是GA3信號負調控因子[40]。本研究中，DELLA基因在根原基形成期（S2）顯著下調，而GA3含量在此階段顯著升高，可能在這一過程中解除了DELLA蛋白對赤霉素信號轉導的阻遏，從而滿足根原基形成階段對赤霉素的需求。

綜上，通過對紅花玉蘭扦插生根過程中4個階段的轉錄組測序和內源激素分析發現，內源植物激素在扦插生根過程中的動態變化以及與其相關的信號轉導基因的差異表達，促進了紅花玉蘭插穗根原基的形成與不定根的生長。本研究初步探索紅花玉蘭嫩枝扦插生根的分子調控機制，為進一步解決其扦插繁殖難題奠定了理論基礎，也為解析紅花玉蘭扦插不定根發生的分子機制和其他近源樹種的研究提供參考依據。

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Analysis of Transcriptome and Endogenous Hormone Changes in" Rooting Process of Shoot Cuttings of Magnolia wufengensis

Abstract To explore the molecular mechanism underlying adventitious rooting in softwood cuttings of Magnolia wufengensis，1 000 mg/L naphthalene acetic acid （NAA） was used to treat softwood cuttings from the current" year’s new growth.The cuttings were sampled were collected at different stages during rooting process of newly collected branches and cuttings.RNA-Seq and endogenous hormone levels were analyzed.The results showed that a total of 186 303 unigenes were assembled with RNA-Seq，and 88" 161 of them were annotated，with an annotation rate of 47.32%.Based on the analysis of differentially expressed genes，significant differences in gene expression were observed between the newly harvested cuttings （referred to as stage S0） and the cuttings at stages S1，S2，and S3.In particular，5 796，3 205 and 4 262 genes were up-regulated and 3 795，5 248 and 6 305 genes were down-regulated in the cuttings at stage S1 （after 6 hours of treatment with NAA），stage S2 （i.e.，root primordium formation phase） and stage S3 （i.e.，adventitious root elongation phase），respectively.KEGG enrichment analysis showed that most of these genes were clustered in pathways such as phenylpropanoid biosynthesis，plant hormone signal transduction，starch and sucrose metabolism.The differential expression of these genes might be closely related to the rooting in the cuttings of Magnolia wufengensis.The analysis of endogenous hormone levels revealed that the concentrations of IAA，ABA，GA3 and CTKs （IP and Zeatin） in the cutting sample at stage S1 were significantly higher than those in the cutting sample at stage S0.At stage S2，the concentrations of IAA and ABA decreased significantly，but the ratio of IAA/ABA increased significantly.Furthermore，at stage S2，the concentrations of GA3 and IP increased and were significantly higher than those at other stages，but the change of Zeatin was not evident.At stage S3，the concentrations of IAA and ABA increased significantly，while the concentrations of GA3 and CTKs decreased significantly.The comprehensive analysis showed that the dynamic changes in endogenous hormones such as auxin，abscisic acid and cytokinin and in their ratios promote the formation of the root primordium and the elongation of adventitious roots.The differential expression of genes related to plant hormone signal transduction is consistent with the change of endogenous hormone levels，finally promoting the rooting of the softwood cuttings of Magnolia wufengensis.

Key words Magnolia wufengensis;Cuttage rooting;RNA-Seq; Endogenous hormone;Differentially expressed genes