基于代謝組學研究TetR家族轉錄因子SPA7074對密旋鏈霉菌Act12代謝的影響

摘 要" 為了闡明TetR家族轉錄因子SPA7074影響密旋鏈霉菌Act12的具體機制，利用超高效液相色譜-質譜聯用的非靶向代謝組學方法，檢測了SPA7074缺失突變株（Δspa7074）與野生型Act12之間的胞內代謝物圖譜，并進行多元篩選統計分析。結果表明：在正離子模式下Δspa7074中相較于野生型顯著差異代謝物共有55種，為氨基酸及其衍生物、核黃素、S腺苷甲硫氨酸和低碳有機酸等物質，這些化合物多為寡霉素等大環內酯類抗生素生物合成的前體或中間產物，以及能量代謝相關物質；通過胞內相關的次級代謝中間產物的結構分析，對寡霉素的生物合成途徑進行了初步的闡述。以上結果說明SPA7074敲除后胞內寡霉素生物的合成顯著提高并及時轉運出胞外，消耗了大量的氨基酸代謝相關產物，增加了細胞的能量供應，改變了胞內的代謝流。

關鍵詞 密旋鏈霉菌；非靶向代謝組學；寡霉素D

密旋鏈霉菌Act12（Streptomyces pactum）是西北農林科技大學薛泉宏教授課題組分離得到的一株生物防治菌，其能抑制真菌病原體、促進植物生長[1-2]、改變植物根際微生物群落[3]、促進植物次生代謝產物積累[4]。

TetR家族是一類在原核生物中廣泛分布的轉錄因子，由保守的螺旋-轉角-螺旋DNA結合結構域和C端的配體調節結構域組合而成。其可調節微生物滲透壓及生理平衡、促進抗生素的生物合成、影響不同代謝通路中蛋白的活性。前期研究發現，TetR家族轉錄因子SPA7074敲除突變株Δspa7074可顯著提高多種植物對病原真菌的拮抗能力，HPLC結果表明，與Act12野生型相比，Δspa7074中多種代謝物質發生了較大改變，特別是抑菌物質寡霉素D的產量最高，是野生型的7倍多[5]。

作為一種新興組學工具，代謝組學借由高效液相色譜[6]、核磁共振波譜[7]和質譜技術的發展，廣泛應用于食品科學[8-9]、植物學[10-11]以及醫學研究[12-13]，與轉錄組、蛋白組學一起成為研究生物體代謝表達活動的重要手段之一[14]。然而，目前借助代謝組手段對微生物的研究更多應用于植物微生態[15]和人體微生態[16]等方面，針對單一菌株突變體代謝組變化的研究相對較少。為此，本研究利用基于超高效液相色譜-質譜聯用的非靶向代謝組學方法[17-18]，分析了TetR家族轉錄因子SPA7074敲除突變株（Δspa7074）與Act12野生型之間整體差異代謝物，并利用層次聚類分析、差異代謝物相關分析、KEGG富集分析等方法，篩選了突變株與野生型之間的差異代謝通路，可為揭示寡霉素的合成途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

密旋鏈霉菌Act12（Streptomyces pactum）野生型（WT）、SPA7074敲除突變株（Δspa7074），均來源于西北農林科技大學放線菌分子生物學實驗室保藏菌株；TSB培養基：大豆蛋白胨3 g/L，胰蛋白胨17 g/L，NaCl 5 g/L，K2HPO4 2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L，121 ℃滅菌25 min。

1.2 主要試劑

10×binding buffer，50%甘油，0.1" mol/L MgCl2，1% NP40，20 mmol/L EDTA，10×TBE，10%過硫酸銨（APS），均由本實驗室配置；SYBR safe DNA凝膠染料，購自thermo fisher；6×DNA loading buffer，購自擎科生物。

1.3 胞內代謝物的制備和提取

將活化的密旋鏈霉菌Act12野生型（WT），SPA7074敲除突變株（Δspa7074）接種到TSB培養基中，28 ℃、150 r/min培養9 d后取樣，3種菌株樣本設置6個重復。4 ℃、5 000 r/min離心 "5 min收集菌體3次，使用預冷的PBS懸浮菌體；棄去全部上清液，將菌體分裝為0.1 mL收集在離心管中，液氮速凍，-80 ℃保存。

取一管分裝后的菌體樣本，加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇溶液（均為質量分數），渦旋混勻，冰浴靜置5 min，4 ℃、15 000 r/min離心10 min，收集上清液到新離心管中，加入150 μL超純水，渦旋混勻后，轉移到帶有0.22 μm濾膜的離心管中，4 ℃、15 000 r/min離心10 min，收集濾液到進樣瓶進行質譜聯用分析。

1.4 Δspa7074與野生型間差異代謝物篩選

在液質聯用測定后，先將得到的代謝組數據進行圖譜匹配和搜庫，擬合分析相應的代謝物種類及含量；再進行質控以保證數據的準確性，篩選統計相關數據。通過變量投影重要度（VIP值）和每個代謝物在2個處理中所有生物重復定量值的均值之比（FC值），結合t檢驗進行篩選，并繪制展示比較對（WT vs Δspa7074）間的差異代謝物整體分布火山圖。

1.5 Δspa7074與野生型間代謝物差異分析

1.5.1 差異代謝物相關性分析 計算比較對WT vs Δspa7074間差異代謝物間皮爾遜相關系數，進行代謝物相關性分析，并進行顯著性統計檢驗[19]，Plt;0.05即為顯著性差異。

1.5.2 差異代謝物功能分析 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是進行生物體內代謝分析、代謝網絡研究的重要方法[20-23]。對鑒定到的代謝物利用KEGG進行功能和分類注釋，并在KEGG富集圖的基礎上進一步解析代謝物所參與的生化途徑以及信號轉導路線，使用超幾何檢驗計算閾值（P-value），進一步分類找出胞內關鍵代謝物所在通路。

2 結果與分析

2.1 Δspa7074與野生型Act12間的差異代謝物分析

篩選VIPgt;1且Plt;0.05的代謝物，視為差異代謝物。由圖1可知，在正離子模式下，Δspa7074與Act12間的差異代謝物共有55種，其中47種顯著下調，8種顯著上調。表1列出了其中差異最顯著的10種化合物。

2.2 Δspa7074與野生型Act12間代謝物相關性分析

為進一步探究代謝物之間的關聯性，對得到的差異代謝物進行相關性分析（圖2）。結果顯示，上調的8種代謝物差異代謝物具有強正相關性；下調的47種差異代謝物間也具有正相關性，且上、下調的差異代謝物兩兩間具有較強的負相關性。另外，顯著上調的差異代謝物主要是次生代謝產物及其前體化合物，而顯著下調的代謝物主要是初生代謝產物與細胞能量代謝相關化合物。因此，初步推斷在敲除 "SPA7074基因后，胞內初生代謝產物與能量代謝產物消耗速度加快，轉化為次生代謝產物，并使其積累量增加。

2.3 KEGG富集分析

在正離子模式下分析差異代謝物的富集通路，發現次生代謝產物種類較多，但大部分未能富集在通路上（圖3）。在上調的差異代謝物中有6種未能被富集在通路中，包括：磷脂酰甘油（16：1（9Z）/18：1（9Z））、15-脫氧-Δ12，14-前列腺素A1、松脂多辛、人參皂苷 Rg2、1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油、2，3-二甲氧基-5-甲基-6-（3-甲基-2-丁烯-1-基）-1，4-苯二醇；其他上調差異代謝產物富集在C5支化二元酸代謝與丙酸鹽代謝通路中；在下調的差異代謝物中有10種差異代謝化合物未能富集在通路中，包括：3-甲氧基-2-（3-甲基丁-2-烯基）-5-戊基苯酚、CHEMBL465325、2-花生四烯酰甘油、3-甲氧基-2-（3-甲基丁-2-烯基）-5-戊基苯酚、19（R）-HETE、5′-氨基甲酰胺-5′-脫氧腺苷、脯氨酰亮氨酸、L-α-亞麻酸-γ-D-Glu-內消旋二氨基庚二酸、N（2）-琥珀酰-L-鳥氨酸和2-庚基-4-羥基喹啉n-氧化物。除卻未被富集的差異代謝物，被富集的通路大多為次生產物、各類氨基酸以及能量的代謝通路。與野生型相比，突變株中氨基酸、部分次生代謝產物、能量相關化合物相關中間體的合成與代謝表達量均有明顯變化。

3 討" 論

鏈霉菌Act12野生型的基因簇大部分都是沉默或低表達的，前期高效液相色譜檢測結果顯示[5]，敲除SPA7074后突變株產生的寡霉素D的含量與野生型相比上升了7倍（圖4）。而通過轉錄組分析發現寡霉素生物合成基因簇內多個基因表達量提高，與SPA7074在染色體上相鄰的通道蛋白RS00415的轉錄水平也提高了10倍左右[24]，因此寡霉素D生物合成量的增加可能與SPA7074敲除后，解除了對這些基因的轉錄抑制有關，寡霉素生物合成基因簇內相關合成基因的表達水平可以提高寡霉素的合成量，通道蛋白表達水平的提高可以及時將寡霉素轉運出胞外，從而解除寡霉素生物合成的產物反饋抑制。

而在本研究中，相較于野生型，突變株Δspa7074中氨基酸代謝產物、部分次生代謝物質、能量代謝中間體表達量下降。這可能是寡霉素生物合成的顯著提高消耗了這些化合物，因為氨基酸代謝相關產物可作為寡霉素等聚酮類化合物的合成原料，寡霉素的大量合成也需要細胞更的供給能量；而部分代謝物質的產量下降則一方面可能也是作為寡霉素的合成原料被消耗，也可能是由于寡霉素的合成增加消耗了這些共同前體化合物，從而降低了其他次級代謝產物的合 "成量。

另外，研究者前期研究表明，寡霉素D由1，7-二氧雜螺[5.5]十一烷環的螺縮酮加一個十七碳的聚酮的結構組成[25]，而此聚酮結構的形成只需要活化的乙酸鹽，甲基丙二酰或者其活化的形式（丙二酰輔酶A），活化的丁酸鹽就可以不斷縮合，形成不斷增長的聚酮類化合物鏈[26]，而在此縮合過程中，只需要十一碳大小的二羥基酮即可合成所需的1，7-二氧雜螺[5.5]的螺縮酮[27]。因此推測在此過程中，多種氨基酸產物，部分次生代謝物質、能量代謝中間體的合成可能與此有一定聯系，且其中8種顯著上調的差異代謝物可能與寡霉素D合成有較強相關性。然而目前寡霉素D的生物合成通路并未闡明，且多數次生代謝產物合成通路也缺乏完整報道，目前還無法準確揭示顯著上調代謝物影響寡霉素D合成的相關 "機制。

本試驗通過超高相液相色譜-質譜聯用的非靶向代謝組學方法，研究發現鏈霉菌Act12在在敲除轉錄因子SPA7074后，其代謝產物與野生型相比發生顯著變化，其中8種顯著上調，47種顯著下調，且上、下調差異代謝物之間有較強的負相關性。上調富集通路主要集中在C5支化二元酸通路、丙酸鹽代謝通路兩個通路中，他們可能與寡霉素D合成存在聯系。本研究可為揭示寡霉素D的生物合成途徑奠定基礎，為生防鏈霉菌Act12在農業生產中的應用提供理論參考。

參考文獻 Reference：

［1］ 申光輝，薛泉宏，陳 秦，等.硅酸鉀與密旋鏈霉菌Act12菌劑配施對連作草莓生長、果實產量及品質的影響[J].中國生態農業學報，2012，20（3）：315-321.

SHEN G H，XUE Q H，CHEN" Q，et al.Effects of combined application of potassium silicate and Streptomyces pactum bio-control agents on growth，yield and quality of strawberry under continuous cropping in greenhouse [J].Chinese Journal of Eco-Agriculture，2012，20（3）：315-321.

[2]周金華，楊晶晶，惠 珂，等.3株放線菌對白菜根腫病的防治效果及機制研究[J].西北農業學報，2020，29（4）：641-651.

ZHOU J H，YANG J" J，HUI K，et al.Effects of 3 biocontrol strains on clubroot disease-resistant and" mechanism in Chinese cabbage [J].Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2020，29（4）：641-651.

[3]LI Y，GUO Q，LI Y，et al.Streptomyces pactum Act12 controls tomato yellow leaf curl virus disease and alters rhizosphere microbial communities[J].Biology and" Fertility of" Soils，2019，55（2）：149-169.

[4]閻 巖，趙 欣，張順倉，等.活性氧在密旋鏈霉菌Act12誘導丹參毛狀根中丹參酮積累中的作用[J].中國中藥雜志，2014，39（11）：1985-1991.

YAN Y，ZHAO X，ZHANG SH" C，et al.Roles of reactive oxygen species in Streptomyces" pactum Act12-induced tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy roots [J].China Journal of Chinese Materia Medica，2014，39（11）：1985-1991.

[5]段雪梅，趙飛揚，顏 霞，等.生防菌密旋鏈霉菌Act12中SPA7074缺失突變株的構建及其次級代謝產物鑒定[J].微生物學報，2016，56（12）：1883-1891.

DUAN X M，ZHAO F Y，YAN" X，et al.Construction of SPA7074-deficient mutant of biocontrol strain Streptomyces pactum Act12 and characterization of its secondary metabolites [J].Acta microbiologica Sinica，2016，56（12）：1883-1891.

[6]WOLFENDER J，NUZILLARD J，VAN D H J，et al.Accelerating metabolite" identification in natural" product research：toward an ideal combination of" liquid chromatography-high-resolution tandem mass spectrometry and NMR" profiling，in silico databases，and chemometrics[J].Analytical Chemistry，2019，91（1）：704-742.

[7]LETERTRE M P M，DERVILLY G，GIRAUDEAU P.Combined nuclear magnetic resonance spectroscopy and" mass spectrometry approaches for metabolomics [J]. "Analytical Chemistry，2021，93（1）：500-518.

[8]AUGUSTIN S，LORRAINE B，CLAUDINE M，et al.The food metabolome：a window over dietary exposure [J].The American Journal of Clinical Nutrition，2014，99（6）：1286-1308.

[9]GONZALEZ-UARQUIN F，KENZ ，RODEHUTSCORD M，et al.Dietary phytase and myo-inositol supplementation are associated with distinct plasma metabolome profile in broiler chickens [J].Animal，2020，14（3）：549-559.

[10] WANG J X，ZHANG X Q，SHI M L，et al.Metabolomic analysis of the salt-sensitive mutants reveals changes in" "amino acid and fatty acid composition important to long-term salt stress in Synechocystis sp.PCC 6803 [J].Funct Integr Genomics，2014，14（2）：431-440.

[11]FUKUSHIMA A，KUSANO M，MEJIA R F，et al.Metabolomic characterization of knockout mutants in Arabidopsis：development of a metabolite profiling database for knockout" mutants in Arabidopsis[J].Plant Physiolagy，2014，165（3）：948-961.

[12]YU Y，TAN P，ZHUANG Z，et al.Untargeted metabolomic approach to study the serum metabolites in women with polycystic ovary syndrome [J].BMC Med Genomics，2021，14（1）：206.

[13]NASCENTES M，LESNER NP，SABATIER M，et al. "Emerging metabolomic tools to study cancer metastasis [J].Trends Cancer，2022，8（12）：988-1001.

[14]INDHUPRIYA S，SRIKANT V，SHIVA K，et al.Multi-omics data" integration，interpretation，and its application[J].Bioinformatics and Biology Insights，2020，14：1-24.

[15]SNEHA G，MARTINO S，UTE R.Metabolomics as an" "emerging tool to study plant-microbe interactions [J]. "Emerging" Topics in" Life Sciences，2022，6（2）：175-183.

[16]KUMAR R，SINGH N，BALAKRISHNAN S，et al.Metabolic modeling of the" international space station microbiome reveals key microbial interactions [J].Microbiome，2022，10（1）：102.

[17]DUNN W B，DAVID B，PAUL B，et al.Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry [J].Nature Protocols，2018，67（7）：1060-1083.

[18]ELIZABETH J W，IAN D W，HELEN G，et al.Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS [J].Nature Protocols，2010，5（6）：1005-1018.

[19]RAO G，SUI J，ZHANG J.Metabolomics reveals significant variations in metabolites and correlations regarding the maturation of walnuts （Juglans regia L.） [J].Biology Open，2016，5（6）：829-836.

[20]KANEHISA M，GOTO S.KEGG：kyoto encyclopedia of genes and genomes [J].Nucleic Acids" Research，2000，28（1）：27-30.

[21]RAO J，CHEN F，HU C，et al.Metabolic map of mature maize kernels [J].Metabolomics，2014，10（5）：775-787.

[22]LIN H，RAO J，SHI J，et al.Seed metabolomic study reveals significant metabolite variations and correlations" "among different soybean cultivars [J].Journal of Integrative Plant" Biology，2014，56（9）：826-836.

[23]JIA S S，WANG Y，HU J，et al.Mineral and metabolic profiles in tea leaves and flowers during flower development [J].Plant Physiology and Biochemistry，2016，106：316-326.

[24]董萌萌.密旋鏈霉菌Act12中兩個TetR家族轉錄因子調控寡霉素生物合成的研究[D].陜西楊凌：西北農林科技大學，2020.

DONG M M.The regulation of" TetR family transcription factors on the biosynthesis of oligomycin in Streptomyces pactum "Act12 [D].Yangling" Shannxi：Northwest Aamp;F University，2020.

[25]ZHANG F M，ZHANG S Y，TU Y Q.Recent progress in the isolation，bioactivity，biosynthesis，and total synthesis of natural spiroketals [J].Natural Product Reports，2018，35（1）：75-104.

[26]LIANG D，YANG X，LIU J，et al.Global evolution of glycosylated polyene macrolide antibiotic biosynthesis [J].Molecular Phylogenetics and Evolution，2018，127：239-247.

[27]ZHENG Q，TIAN Z，LIU W.Recent advances in understanding the enzymatic reactions of [4+2] cycloaddition and spiroketalization [J].Current Opinion in Chemical Biology，2016，31：95-102.

Impact of TetR Family Transcription Factor SPA7074 on Metabolism of

Streptomyces pactum Act12 Based on Metabolomics Research

Abstract To elucidate the specific mechanism by which the TetR-family transcription factor SPA7074 affects the Streptomyces pactum Act12. a non-targeted metabolomic approach using ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was used to detect the intracellular metabolite profiles between the SPA7074 deletion mutant （ Δspa7074 ） and the wild-type Act12， followed by multivariate screening statistical analysis. Ultimately， 55 metabolites were found to be significantly differentially expressed in "Δspa7074" compared to the wild-type in positive ion mode， including amino acids and their derivatives， riboflavin， S-adenosylmethionine， and low-carbon organic acids， which are mostly precursors or intermediates of oligomycin-like macrolide antibiotics biosynthesis， as well as energy metabolism-related substances. The structural analysis of the intermediate products of secondary metabolites related to intracellular biosynthesis pathway of oligomycin D was conducted， which provided a preliminary description of the biosynthesis pathway of oligomycin D. These results indicate that knocking out of SPA7074 significantly increased the intracellular biosynthesis of oligomycin and timely transported it out of the cell， consuming a large amount of amino acid metabolism-related products， increasing the energy supply of cells， and changing the metabolic flow in cells.

Key words Streptomyces pactum; Non-targeted metabolomics; Oligomycin D