對藜高致病活性鏈格孢菌DT-DYLC的液體發酵培養基優化

摘 要 以鏈格孢菌（Alternaria alternata）DT-DYLC為研究對象，以生物量和孢子量（OD600nm）為響應值，采用單因素試驗和Plackett-Burman試驗及響應面試驗對其發酵培養基進行優化。結果表明，察氏固體培養基7 d時的菌落直徑為73.1 mm，菌絲質量達0.049 g，均顯著高于其他培養基。通過Plackett-Burman試驗篩選出無機鹽為影響孢子量的主要因素。運用響應面分析確定最優發酵培養基為：蔗糖68.853 g/L，NaNO3 11.41 g/L、K2HPO4 5.523 g/L、KCl 1.405 g/L、MgSO4·7H2O 1.874 g/L、FeSO4 0.0375 g/L。在此條件下，孢子量達到3.4 ×107 CFU/mL，是優化前的2.72倍。優化培養基可用于液體發酵工廠化生產。

關鍵詞 鏈格孢；孢子量；培養基優化；響應面法

雜草是影響農作物豐產豐收的重要生物因子之一。其與作物爭光、爭水肥、爭空間，阻礙農作物機械化播種及收獲，并在一定程度上傳播病蟲害，降低農作物的產量和質量，是導致農作物產量減少的重要因素。其中藜（Chenopodium album "L.）為藜科（Chenopodiaceae）藜屬（Chenopodium）1 a生闊葉雜草，是青海省危害農田的一種闊葉雜草優勢種[1]。在全世界分布有 250 個種和亞種[2]，危害世界不同地區25種農作物[3]。藜干擾目的作物生長，惡化環境，是影響作物產量和品質的主要生物逆境之一[4]。減少雜草數量可以通過機械除草等綜合管理的方法[5-6]，可是僅使用單一的控制措施不能有效地控制田間雜草的生長，所以效果顯著、使用便捷、便于大面積使用的化學除草劑[7]更容易被選擇，但其最大的缺點便是對環境有污染[8-9]。因此，對環境友好、無污染的微生物除草劑應運而生。

微生物除草劑是指一類直接以微生物個體為對象開發制備的生物農藥。而其中的主要成分為雜草生防微生物（主要為真菌），其多以自然界為來源，具有毒性低和長效防治的特點[10-11]。如“魯保一號”是利用尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）制成的微生物制劑用于防除大豆田里的菟絲子[12]（Cuscuta" sp.），其防效可達70%～95%[13]；1971年，Hasan[14]從意大利維埃斯特引進了一株銹菌，并成功防治了澳大利亞當地泛濫的澳大利亞粉孢苣；Stierle等[15]發現鏈格孢菌（Alternaria alternate）產生的環肽毒素對黑矢車菊（Centaurea maculosa）有極強的毒性；顧瓊楠等[16]在發病牛筋草上分離得到一株牛筋草炭疽菌（Colletotrichum eleusines）NJC-16，對牛筋草鮮重防效達到了73%；劉璐等[17]從野外感病稗草上分離得到的彎孢屬新種（Curvularia" sp.）處理稗草的發病指數最高可達62.53。

具有生防活性的微生物自然生長條件下的生防能力不能夠達到生防要求，故需要人工培養進行生防能力的優化，其中優化生長培養基是一種有效提高生防菌株能力的方式。楊景艷[18]對殺線蟲活性菌株KM2501-1培養基成分進行了優化，優化后培養的菌株的殺線蟲能力提高了 "61.61%；彭上[19]對刺糖多孢菌培養基進行了成分和發酵條件優化，所得多殺菌素較對照組提高了60.74%；黎秋雨等[20]對具有枸杞木虱生防效果的雷斯青霉進行了發酵培養基優化，優化后的產孢量提高了9.84倍，對枸杞木虱三齡若蟲同期防效高了25.56%；可見，優化生防微生物生長培養基有助于優化其生防能力。

本研究團隊前期從青海省西寧市大通縣達隆村農田感病大葉藜葉片中分離到一株鏈格孢菌（Alternaria alternata）DT-DYLC，通過研究發現其對藜具有高致病活性，對小麥、青稞、玉米、番茄和黃瓜安全，具有在以藜為優勢雜草的禾本科、茄科和葫蘆科田中應用潛力[21]。為了篩選低成本、廉價的培養基配方，獲得高濃度的鏈格孢菌的孢子量，本研究以孢子量（OD600nm）為響應值，采用單因素試驗及響應面試驗對Alternaria alternata DT-DYLC的培養基配方進行優化，得出其最優培養基配方，以期為該菌株規模化生產和農業化應用提供理論依據和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

鏈格孢菌（Alternaria alternata） DT-DYLC，從青海省西寧市大通縣達隆村農田中采集到自然感病的大葉藜（Chenopodium hybridum）植株葉片篩選獲得。

1.2 試驗方法

1.2.1 固體培養基的篩選

將于PDA培養基保存并活化好的DT-DYLC菌株接種于7種培養基平板中央（表1），于 25 ℃培養箱中培養7 d后，用游標卡尺以十字交叉法測量菌落直徑，并拍照記錄菌落形態后，將菌絲刮下放到50 ℃烘箱中烘至恒量后于分析天平上準確稱量并記錄數據。每個處理重復3次。

1.2.2 培養基的單因素優化 以“1.2.1”篩選出的最佳固體培養基為基礎培養基，對配方各成分進行單因素試驗。在接種并培養活化的平板中打直徑為8 mm的菌餅接種于裝有基礎培養液的250 mL三角瓶中，于搖床培養7 d（25 ℃、180" "r/min），用紫外分光光度計測定培養液最大吸收波長λ=600 nm的OD值，重復3次。培養基各成分及水平選擇如表2所示。

1.2.3 成分及配比優化 根據中心組合設計原理進行成分配比優化，以單因素結果為中心點，菌株DT-DYLC的OD（λ=600 nm）值為響應值（Y），以碳、氮源及無機鹽含量設計3因素5水平的響應面（RSM）試驗，其因素及水平如表3 "所示。

1.2.4 統計分析 采用SPSS Statistics 27、 "Design Expert 13和Excel對試驗數據進行統計分析，采用Duncan氏新復極差法比較差異顯 "著性。

2 結果與分析

2.1 固體培養基的篩選

綜合分析菌落直徑和菌絲干質量，以水瓊脂培養基作為對照，平板置于25 ℃培養箱7 d后。察氏培養基上的菌落直徑最大，為73.1 mm，其次為PDA和PSA培養基，菌落直徑分別達 "68.54 mm和67.74 mm；菌絲干質量，在PDA和察氏培養基上分別達0.052 g和0.049 g（圖1）。結合二者評價，在察氏培養基中菌落直徑和菌絲干質量均顯著高于其他培養基，故選定察氏培養基為鏈格孢菌DT-DYLC菌株菌絲生長的最適培養基。由圖2可見，DT-DYLC菌株菌落在察氏、PDA和PSA培養基長勢最優。

2.2 液體發酵培養基的優化

2.2.1 蔗糖含量對DT-DYLC液體發酵培養基OD值的影響 菌株DT-DYLC液體培養基的OD值在蔗糖含量30～50 g/L的區間內上升， "50～60 g/L下降，60～70 g/L又突然上升，并在70 g/L達到最大值之后，隨著蔗糖含量增加，培養基的OD值迅速下降（圖3-A），故選定70 g/L為菌株DT-DYLC液體發酵培養基的最佳蔗糖 "含量。

2.2.2 硝酸鈉含量對DT-DYLC液體發酵培養基OD值的影響 隨著硝酸鈉含量增加，菌株DT-DYLC的OD值在3～6 g/L的區間內迅速上升，6～12 g/L間上升平緩，在12 g/L達到最大值，之后隨著硝酸鈉含量上升，OD值迅速下降（圖3-B），故選定12 g/L為菌株DT-DYLC培養基的最佳硝酸鈉含量。

2.2.3 MgSO4·7H2O含量對DT-DYLC液體發酵培養基OD值的影響 隨著MgSO4·7H2O含量的增加，菌株DT-DYLC液體發酵培養基的OD值呈現先升高后降低的趨勢，并在2 g/L時達到最大值，之后在MgSO4·7H2O含量2.0～2.5 g/L時急劇下降，2.5～3.0 g/L時略微上升，后又隨著MgSO4·7H2O含量增加下降（圖3-C）。故選定2 g/L為菌株DT-DYLC培養基的最佳MgSO4·7H2O含量。

2.2.4 KCl含量對DT-DYLC液體發酵培養基OD值的影響 隨著KCl的含量增加，DT-DYLC液體發酵培養基的OD值呈升高-降低-升高-降低的形式，OD值在0.5～1.5 g/L內迅速上升，在1.5 g/L時達到最大值。后在1.5～2.0" "g/L內下降，在2.0～3.0 g/L區間內上升。在 "3.0～ "3.5 g/L區間內下降（圖3-D）。故選定1.5 g/L為菌株DT-DYLC液體發酵培養基的最佳KCl含量。

2.2.5 K2HPO4含量對DT-DYLC液體發酵培養基OD值的影響 隨著K2HPO4的含量增加，DT-DYLC的OD值先升高后降低，在1～2 g/L內迅速升高，2～4 g/L開始略微下降，4～6 g/L內上升，最終在6 g/L達到最大值。6～7 g/L內下降（圖3-E）。故選定6 g/L為菌株DT-DYLC液體發酵培養基的最佳K2HPO4含量。

2.2.6 FeSO4含量對DT-DYLC液體發酵培養基OD值的影響 隨著FeSO4含量的增加，DT-DYLC的OD值總體呈先升高后降低的趨勢，在0.01～0.04 g/L區間內DT-DYLC液體發酵培養基OD值呈上升趨勢。并在0.04 g/L達到最大值之后開始下降（圖3-F）。故選定0.04 g/L為菌株DT-DYLC培養基的最佳FeSO4含量。

2.3 成分及配比優化

根據“2.2”得出的結果對鏈格孢菌 "DT-DYLC菌株的液體培養條件進行優化，利用Design expert中心組合試驗設計3因素5水平試驗，每個處理3個重復，結果以平均數±標準差表示，如表4所示。

以DT-DYLC發酵液的OD值（Y）為響應值，根據中心組合的試驗結果（表4）進行分析得到OD值與蔗糖（A）、NaNO3（B）與無機鹽（C）的二次多項回歸方程：

Y=0.690 4-0.013 7A+0.023 4B-0.050 7C-0.039 4AB+0.045 6AC-0.031 7BC- "0.014 44A2-0.083 7B2-0.167 0C2

通過方差分析上述回歸模型可知（表5），回歸模型的Plt;0.000 1，顯著性檢驗極顯著，失擬項的P值0.341gt;0.05，顯著性檢驗不顯著，說明未知因素對試驗的干擾很小，模型穩定，回歸方程的決定系數為99.12%，證明該方程與實際情況較符合，該模型能夠模擬菌株DT-DYLC的OD值與碳源、氮源和無機鹽之間的關系。

模型數據顯示，各因子的影響主次順序為：C gt;AC gt; AB gt; BC gt; C2gt; B gt; A2gt;Agt; B2。一次項B、C、交互項AB、AC、BC及二次項 A2、C2影響顯著。

根據試驗因素（蔗糖、硝酸鈉、無機鹽）之間的交互效應三維立體響應面和等高線圖（圖4），確定一個因素后觀察另外兩個因素對DT-DYLC的OD值影響。綜上，三者交互作用響應面皆為開口向下的凸形曲面，且交互效應的等高線形狀為橢圓形，說明兩兩之間的交互作用效果較顯著。

利用回歸方程計算得到菌株DT-DYLC液體發酵培養基產孢量的培養基條件為：蔗糖 68.853 g/L，硝酸鈉 11.41 g/L，無機鹽8.94 g/L（其中K2HPO4 5.523 g/L、KCl 1.405 g/L、MgSO4·7H2O 1.874 g/L、FeSO4 0.0375 g/L）。

3 討論與結論

微生物農藥具有綠色環保、低毒無害、高效可控、抗性低、安全易存儲等優點，是未來農業發展的重要方向之一。而篩選具有抑草作用的微生物是微生物除草劑研究的重要途徑之一[22-24]，孢子是微生物生長過程中的一個重要間體[25]，孢子數量決定著生防菌劑的生防效用。故產孢率也是評價生防菌制劑的一個重要指標[26]。但在自然屆篩選到的具有生防能力的菌株，其致病力和產孢量往往不能滿足微生物農藥的工業化生產，所以需要對自然篩選的菌株進行培養基碳源、氮源及無機鹽的優化，以優化菌株產孢能力。同時，優化培養基也是提高經濟效益的重要途徑[27]。通過優化培養基提高孢子產量可為真菌制劑制備及其工業化生產提供基礎保障[28]。

本研究通過先對固體培養基進行篩選，選出最適固體培養基，后進行單因素試驗和響應面優化，旨在使鏈格孢DT-DYLC達到最適生長條件后，增加其孢子和抑草物質的產量。李祥等[29]研究得出察氏培養基為除草鏈格孢HY-02的最佳培養基，與本研究結果相同；通過單因素實驗確定了培養基的最佳碳源為蔗糖，這與杜艷麗等[30]研究結果一致；本研究中所采用的無機鹽對鏈格孢DT-DYLC培養基的OD值影響效果較明顯，這與楊瑩等[25]利用中心組合優化出芽短梗霉菌PA-2菌株所用的無機鹽效果相似，均能優化促進菌株生長產孢；王雪妍等[31]對貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HP-24進行發酵條件優化，發酵液中的活菌數可達到 1.17×109 CFU/mL；郭建軍等[32]通過響應面法優化發酵培養基使多粘類芽孢桿菌LY1發酵產芽孢數量達到了 "6.825×109 CFU/mL；戴寶等[33]通過響應面法優化了萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus） BsR05的芽孢產量提高了1.27倍；證明通過響應面法優化培養基可以促進產孢。

本研究通過單因素試驗和響應面試驗，確定鏈格孢菌DT-DYLC的最佳固體培養基為察氏培養基，液體發酵培養基產孢的最佳條件為：蔗糖 68.853 g/L、NaNO3 11.41 g/L、無機鹽 8.94 g/L（其中K2HPO45.523 g/L、KCl 1.405 g/L、 "MgSO4·7H2O 1.874 g/L、FeSO4 0.037 5" "g/L），在此條件下，孢子量達到3.4×107" "CFU/mL，是優化前的2.72倍。優化后的發酵條件，不僅能有效提高菌液中的孢子量，而且可進一步降低培養成本，為鏈格孢菌DT-DYLC生防菌劑的進一步開發應用提供參考。本研究目前只優化了該菌株液體發酵的配方，后期還需進行發酵條件探索，以滿足工業化生產的需要。

參考文獻 Reference：

［1］ 王玉靈，王愛華，胡冠芳，等.噴霧助劑對滅草松防除馬鈴薯田闊葉雜草藜的增強作用[J].中國馬鈴薯，2021，35（3）：250-261.

WANG Y L，WANG A H，HU G F，et al. Enhancement effects of bentazone plus spray" adjuvants on" control of" broadleaf" weed Chenopodium album in" potato" field[J].Chinese Potato Journal，2021，35（3）：250-261.

[2]KRAK K，VIT P，BELYAYEV A，et al.Allopolyploid origin of" Chenopodium album str.（Chenopodiaceae）：A molecular and cytogenetic insight[J].PLoS ONE，2016，11（8）：e0161063.

[3]DMITROVIC′ S，SIMONOVIC′" A，MITIC′" N，et al.Hairy root exudates of allelopathic weed Chenopodium murale L.induce oxidative stress and down-regulate core cell cycle genes in Arabidopsis and wheat seedlings[J].Plant Growth Regulation，2015，75：365-382.

[4]BAJWA A A，ZULFIQAR U，SADIA S，et al.A global perspective on the biology，impact and management of" Chenopodium album and Chenopodium murale：two troublesome agricultural and environmental weeds[J]. Environmental Science and Pollution Research，2019，26（6）：5357-5371

[5]李香菊.近年我國農田雜草防控中的突出問題與治理對策[J].植物保護，2018，44（5）：77-84.

LI X J.Main problems and management strategies of weeds in agricultural" fields in China in recent years[J].Plant Protection，2018，44（5）：77-84

[6]KOOCHEKI A，NASSIRI M，ALIMORADI L，et al.Effect of cropping systems and crop rotations on weeds[J].Agronomy for Sustainable Development，2009，29（2）：401-408.

[7]陳世國，強 勝.生物除草劑研究與開發的現狀及未來的發展趨勢[J].中國生物防治學報，2015，31（5）：770-779.

CHEN SH G，QIANG SH.The status and future directions of bioherbicide study and development[J].Chinese Journal of Biological Control，2015，31（5）：770-779

[8]RADOSEVICH S R，HOLT J S，GHERSA C.Weed Ecology：Implications for Management[M].New York：Weed Ecology Implications for Management，1997.

[9]DUKE S O，DAYAN F E，RIMANDO A M，et al.Chemicals from nature for weed management[J].Weed Science，2002，50（2）：138-151.[ZK）]

[10] 李海濤，王金信，楊合同，等.微生物除草劑的研究現狀和應用前景[J].山東科學，2005（1）：30-34，46.

LI H T，WANG J X，YANG H T， et al. The present research and application progress of mycoherbicides[J].Shandong Science，2005（1）：30-34，46.

[11]EL-SAYED W.Biological control of weeds with pathogens：current status and future trends[J].Journal of Plant Diseases and Protection，2005，112（3）：209-221.

[12]李 健，高興祥，李 美，等.“魯保一號”菌株的鑒定和生防增效助劑篩選[J].山東農業科學，2021，53（2）：102-105.

LI J，GAO X X，LI M， et al. ldentification of ‘Lubao 1’ strain and screening of" pesticide adjuvants[J].Shandong Agricultural Sciences，2021，53（2）：102-105.

[13]劉志海，朱全讓.魯保一號菌[M].濟南：山東科學技術出版社，1980.

LIU ZH" H，ZHU Q R.Lubao 1 Strain[M].Jinan：Shandong Science and Technology" Press，1980.

[14]HASAN S.Specificity and host specialization of Puccinia chondrillina[J].Annals of Applied Biology，1972，72：57-263．

[15]STIERLE A，CARDELLINA H，STROBEL G.Maculosin a host-specific phytotoxin from Alternaria alternate on spotted knapweed [J].American Chemical Society Symposium Series，1989，439：53.

[16]顧瓊楠，歐 翔，褚世海，等.牛筋草生防菌NJC-16的分離鑒定及生物學特性研究[J].中國生物防治學報，2021， "37（4）：817-825.

GU Q N，OU X，CHU SH H，et al. Isolation identification and biological characteristics of the biocontrol" fungi NJC-16 for Eleusine indica[J]. Chinese Journal of Biological Control，2021，37（4）：817-825.

[17]劉 璐，鐘加日，朱哲遠，等.稗草生防菌株NX1的生物學特性及致病性研究[J].微生物學報，2023，63（11）：4245-4257

LIU L，ZHONG J R，ZHU ZH Y，et al.Biological characteristics and pathogenicity of the biocontrol fungal strain NX1 for Echinochloa crusgalli[J].Acta Microbiologica Sinica，2023，63（11）：4245-4257

[18]楊景艷.多粘類芽胞桿菌KM2501-1培養基優化及巨大芽胞桿菌CP3揮發性殺線蟲活性物質研究[D].武漢：華中農業大學，2018.

YANG J Y.Optimization of Paenibacillus polymyxa KM2501-1 medium and research of nematicidal volatiles produced by Bacillus megaterium CP3[D].Wuhan：Huazhong Agricultural University，2018.

[19]彭 上.刺糖多孢菌培養基成分優化和發酵條件研究[D].長沙：湖南師范大學，2016.

PENG SH.The optimization of fermentation medium and process of spinosad by Saccharopolyspora spinosa[D].Changsha：Hunan Normal University，2016

[20]黎秋雨，柴軍發，蒲艷麗，等.雷斯青霉F-1發酵培養基優化及對枸杞木虱的毒力測定[J/OL].生態學雜志，2023：1-11[2023-12-15].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/21.1148.Q.20230428.0955.002.html.

LI Q Y，CHAI J F，PU Y L，et al. Optimization of the culturing medium for Penicillium raistrickii F-1 and determination of its virulence against Bactericera gobica[J/OL].Chinese Journal of Ecology，2023：1-11.[2023-12-15].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/21.1148.Q.20230428.0955.002.html.

[21]程海洋，程 亮，朱海霞，等.鏈格孢菌DT-DYLC菌株的除草活性及對作物的安全性[J].中國生物防治學報，2023，39（2）：418-428.

CHENG H Y，CHENG L，ZHU H X，et al.Herbicidal activity and safety to crops of Alternaria alternata DT-DYLC[J]. Chinese Journal of Biological Control，2023，39（2）：418-428.

[22]HOAGLAND R E，BOYETTE M A，BOYETTE C D.Myrothecium verrucaria fungus：a bioherbicide and strategies to reduce its non-target risks[J].Allelopathy Journal， 2007，19（1）：179-192.

[23]HAO S H，WEI Y，WANG J，et al. Allelopathy and the active metabolites of the endophytic fungus，Alternaria J46，from Platycladus orientalis[J].Weed Biology and Management， 2015，15（3）：95-101.

[24]ANDE R，SON K I，HALLETT S G.Herbicidal spectrum and activity of Myrothecium verrucaria[J].Weed Science，2004，52（4）：623-627.

[25]楊 瑩，莊新亞，程 亮，等.出芽短梗霉菌PA-2發酵培養基及發酵條件優化[J].南方農業學報，2019，50（9）：1998-2008.

YANG Y，ZHUANG X Y，CHENG L，et al.Fermentation medium of Aureobasidium pullulans PA-2 and optimization of fermentation conditions[J].Journal of Southern Agriculture，2019，50（9）：1998-2008.

[26]王曉梅，劉國寧，程 麗，等.辣椒疫霉菌拮抗真菌M-12發酵條件的優化[J].吉林農業大學學報，2015，37（6）：658-663.

WANG X M，LIU G N，CHENG L，et al. Study on optimal fermentation of M-12 strain against Phytophthora capsici[J].Journal of Jilin Agricultural University，2015，37（6）：658-663.

[27]易征璇，王 征，譚著名.康氏木霉固體發酵產孢子粉工藝研究[J].現代農業科技，2013（8）：194-196.

YI ZH X，WANG ZH，TAN ZH M.Study on producction technical of spores by" adopting Konningii trichoderma solid-state fermination[J].Xiandai Nongye Keji，2013（8）：194-196.

[28]李鴻文，馮明光.球孢白僵菌不同菌株分生孢子的耐熱能力[J].浙江大學學報（農業與生命科學版），2008，34（2）：158-162.

LI H W，FENG M G，Bioassay of conidial thermotolerance of Beauveria bassiana strains from different hosts and geographic origins[J].Journal of Zhejiang University（Agriculture amp; Life Sciences），2008，34（2）：158-162

[29]李 祥，朱海霞.除草鏈格孢菌HY-02的培養和發酵條件優化[J].甘肅農業大學學報，2022，57（3）：111-120，128.

LI X，ZHU H X.Optimization of culture and fermentation conditions of "Alternaria alternate HY-02[J].Journal of Gansu Agricultural University，2022，57（3）：111-120，128.

[30]杜艷麗，曹 興，王桂清，等.百合灰霉病病原菌鑒定及其部分生物學特性測定[J].南方農業學報，2019，50（2）：307-314.

DU Y L，CAO X，WANG G Q，et al. ldentification and partial biological characteristics of pathogen causing lily gray mold [J].Journal of Southern Agriculture，2019，50（2）：307-314.

[31]王雪妍，馬 煥，岳丹丹等.一株西瓜細菌性果斑病生防菌的篩選、鑒定及其培養基優化[J].中國瓜菜，2022，35（9）：9-15.

WANG X Y，MA H，YUE D D.et al.Screening and identification of a biocontrol strain against bacterial fruit blotch of watermelon and optimization of its culture medium [J].Zhongguo Gua-cai，2022，35（9）：9-15.

[32]郭建軍，曾 靜，袁 林，等.響應面法優化多粘類芽孢桿菌LY1的產芽孢條件[J].湖南農業科學，2022（4）：6-11.

GUO J J，ZENG J，YUAN L，et al. Optimization of sporenbsp; production conditions of Paenibacillus polymyxa LY1 by response surface" methodology[J].Hunan Agricultural Sciences，2022（4）：6-11.

[33]戴 寶，扈進冬，尹姍姍，等.響應面法優化萎縮芽孢桿菌BsR05發酵培養基[J].山東科學，2017，30（4）：31-37.

DAI B，HU J D，YIN SH SH，et al.Optimization of fermentation medium composition for Bacillus atrophaeus BsR05 by response surface method[J]. Shandong Science，2017，30（4）：31-37.

Liquid Medium Optimization of Alternaria alternata DT-DYLC with High

Pathogenic Activity" against Chenopodium album

Abstract Using Alternaria alternata DT-DYLC as the research object， and with mycelium biomass and spore number （OD600nm） as the response value， the fermentation medium was optimized by single factor test， Plackett-Burman test， and response surface test. The results showed that after 7 days of cultivation at 25 °C on Chaw’s medium， the colony diameter and mycelium mass of DT-DYLC reached 73.1 mm， and the mycelial mass was 0.049 g， both significantly higher than other tested media. The main factors affecting the spore number of A.alternata DT-DYLC was inorganic salt. The optimal fermentation medium for spore production was determined by response surface methodology consisted of sucrose 68.853 g/L， NaNO3 11.41 g/L， K2HPO4 5.523 g/L， KCl" 1.405 g/L， MgSO4·7H2O" "1.874 g/L， FeSO4 0.037 5 g/L. Under these conditions， the spore number in the fermentation broth of A.alternata DT-DYLC reached 3.4×107 CFU/mL， which was 2.72 times that of the unoptimized condition. The optimized medium can be used for the industrial-scale liquid fermentation of" A.alternata" DT-DYLC.

Key words Alternaria alternata; Spore yield; Medium optimization;Response surface methods