紫葉苔(Pleurozia purpurea)線粒體基因組密碼子偏好性分析

摘 要：為了豐富對紫葉苔屬遺傳基礎的認識，探究了紫葉苔（Pleurozia purpurea）線粒體基因組密碼子使用的偏好性及其影響因素。首先，基于完整紫葉苔線粒體基因組篩選蛋白編碼序列；然后，利用CodonW、EMBOSS explorer計算各基因的GC含量、有效密碼子數（ENC）、密碼子適應指數（CAI）和同義密碼子相對使用度（RSCU）等指標；最后，采用R軟件進行參數間的相關性分析并繪圖。結果表明：1） 從紫葉苔線粒體基因組中篩選出31條蛋白編碼序列，平均GC含量和密碼子第 3 位堿基的 GC 含量分別為38.17%和32.28%，ENC和CAI平均值為50.29、0.17，表明密碼子偏好使用以A/U結尾的堿基，且密碼子偏好性較弱；2） ENC分別與GCall、GC3以及基因編碼氨基酸的長度呈極顯著正相關，表明GC含量和基因的長度對密碼子的偏好有顯著影響；3） 中性繪圖、ENC-plot和PR2-plot分析表明，突變壓力和自然選擇等因素共同塑造了密碼子的使用偏好性，其中突變是最主要的影響因素；4） 篩選出23個最優密碼子，多數以 A/U 結尾。因此，紫葉苔線粒體基因組密碼子偏好性較弱，除了主要受突變壓力影響外，還受到自然選擇、堿基組成和基因長度等因素的影響，研究結果可為苔蘚植物線粒體基因組的進化研究提供參考。

關鍵詞：分子遺傳學；紫葉苔屬；密碼子偏好性；線粒體基因組；最優密碼子

中圖分類號：Q949.35；Q755

文獻標識碼：A"" DOI：10.7535/hbkd.2025yx01010

收稿日期：2024-04-27；修回日期：2024-08-21；責任編輯：張士瑩

基金項目：

國家自然科學基金（3216031" 31760054）；海南大學科研啟動項目 （KYQD（ZR）-22105）

第一作者簡介：

杜夢雪（1994—），女，河南平頂山人，碩士研究生，主要從事苔蘚植物基因組和系統進化方面的研究。

通信作者：

張莉娜，副教授。E-mail：zhanglina@hainanu.edu.cn

Analysis of codon usage bias in the mitochondrial

genome of Pleurozia purpurea

DU Mengxue ZHANG Xin" GAO Jie" BI Sheng" HAO Jiewei ^"""ZHANG Lina ^"2

（1. Ministry of Education Key Laboratory for Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest

Trees and Ornamental Plants，Hainan University，Haikou，Hainan 570228，China；

2. International Joint Center for Terrestrial Biodiversity Around South China Sea of Hainan Province，

Hainan University，Haikou，Hainan 570228，China）

Abstract：In order to enrich the understanding of the genetic basis of the genus Pleurozia purpurea， the codon usage bias （CUB） in the mitochondrial genome of Pleurozia purpurea and its main influencing factors were investigated. Firstly， protein-coding sequences were screened based on the complete mitochondrial genome of Pleurozia purpurea. Then， CodonW and EMBOSS explorer were utilized to calculate various metrics for each gene， including GC content， effective number of codons （ENC）， codon adaptation index （CAI）， and relative synonymous codon usage （RSCU）. Finally， correlation analysis between parameters was analyzed and plotted using R software." The results show that： 1） A total of 31 protein-coding sequences are identified from the mitochondrial genome of Pleurozia purpurea， with an average GC content of 38.17% and a GC content of 32.28% for the third base of codons， respectively. The average values for ENC and CAI are 50.29 and 0.17， indicating a preference for codons ending with A/U bases and a relatively weak CUB; 2） ENC exhibits significantly positive correlations with GCall， GC" and the length of amino acid encoding genes， indicating significant influences of GC content and gene length on CUB; 3） Analyses including neutrality plot， ENC-plot and PR2-plot indicate that mutation pressure and natural selection jointly shaped the CUB， with mutation being the most important influencing factor; 4） A total of 23 optimal codons are selected， most of which end with A/U. Therefore， the CUB in the mitochondrial genome of Pleurozia purpurea is relatively weak， influenced primarily by mutational pressure， and by factors such as natural selection， base composition， and gene length. The research results can provide reference for evolutionary studies of mitochondrial genomes in bryophytes.

Keywords：molecular genetics; the genus Pleurozia purpurea; codon usage bias; mitochondrial genomes; optimal codon

植物線粒體是關鍵細胞器，負責代謝、呼吸和能量轉換等重要細胞過程^[1]。和葉綠體一樣，線粒體是半自主性細胞器，有自己的基因組，具有獨立復制表達及母系遺傳等特點。線粒體基因組編碼與呼吸作用等代謝過程有關的蛋白質中含有豐富的遺傳信息。在遺傳信息的解讀過程中，密碼子扮演著至關重要的角色，是基因與蛋白質之間聯系的基礎。已知構成天然蛋白質的20種基本氨基酸中，除了色氨酸和甲硫氨酸各由1個密碼子編碼外，其他18種氨基酸由2～6個不同的密碼子進行翻譯，這種現象被稱為密碼子簡并性^[3]，而編碼同一種氨基酸的不同密碼子被定義為同義密碼子。同義密碼子在蛋白質合成中的使用并不均勻，一些同義密碼子被優先使用，這種對特定密碼子的偏倚，即為密碼子使用偏好（codon usage bias，CUB）^[4]。CUB信息的獲得可以為基因表達水平的預測和優化、基因功能預測、遺傳分歧評估和生物進化探索等提供重要的見解^[5-7]，并有助于解釋物種對環境適應的分子機制^[8]。

苔蘚植物是由水生到陸生過渡的高等植物類群，大多生活在潮濕的陸地環境中，包含地錢門（Marchantiophyta）、真蘚門（Bryophyta）和角苔門（Anthocerotophyta）3個門類。紫葉苔屬隸屬于地錢門，在最新的世界苔類名錄中共記錄12種^[9]，其中中國記錄5種。紫葉苔屬是唯一具有兩面體頂細胞結構的莖葉體苔類^[10]，被視為苔類植物中由簡單葉狀體向莖葉體過渡的關鍵類群^[11-12]。同時，紫葉苔屬具有形態獨特且變異較大的葉型和生殖結構，如囊狀葉、不育蒴萼等^[13]，使得這一類群在苔類系統發育與進化研究中具有非常重要的科學意義。此外，紫葉苔屬多為樹附生類型，主要分布于熱帶和亞熱帶山地高海拔、多云霧的雨林中^[13]，對于氣候等環境因子的變化十分敏感。因此，紫葉苔屬不僅是高海拔雨林或云霧林生態系統動態變化潛在的指示植物，而且極易成為受威脅物種。在《中國生物多樣性紅色名錄——高等植物卷（2020）》中，紫葉苔（Pleurozia purpurea）和狹尖紫葉苔被列為近危物種。

地錢門是現存陸生植物最早分化的系群之一^[14-15]，開展紫葉苔屬基因組的研究有助于揭示陸生植物起源和早期進化過程中基因組的演化。已有研究表明，紫葉苔線粒體基因組在苔蘚植物中具有較高的進化保守性和代表性^[16]。然而，盡管測序技術不斷進步，對維管植物細胞器基因組的研究日益增多，但關于苔蘚植物線粒體基因組的研究仍然較少^{[1 17-18]}，特別是關于密碼子使用偏好性較為全面的分析更是寥寥無幾^[19-20]。本研究深入分析紫葉苔線粒體基因組的密碼子使用模式，探討其偏好性形成的潛在機制，并篩選出最優密碼子。通過研究，期望能夠豐富對紫葉苔屬這一進化和生態關鍵類群遺傳基礎的認識，為理解該屬的生物學特性及其在苔蘚植物系統發育、進化和物種保護中的關系提供新的視角和科學依據。

1 材料和方法

1.1 紫葉苔線粒體基因組序列的獲取

紫葉苔線粒體基因組序列從GenBank數據庫下載，登錄號為NC_013444.1。該基因組總長為168 526個堿基，含有41條蛋白編碼序列（coding sequence，CDS）。為了提高后續密碼子偏好分析的準確性，本文依照長度大于300 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA、TAA和TAG的標準，最終選取了31條CDS序列用于后續數據分析。

1.2 密碼子使用特征參數分析

運用CodonW （版本號v1.4.2） 對紫葉苔線粒體基因組CDS序列的密碼子使用指標進行分析，包括有效密碼子數（effective number of codon，ENC）、密碼子適應指數（codon adaptation index，CAI）、同義密碼子相對使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）、GC3s、A3s、T3s、C3s和G3s。其中A3s、T3s、C3s和G3s代表了同義密碼子第3堿基位置分別使用A/T/C/G的頻率；GC3s指同義密碼子第3位置的平均GC含量。EMBOSS explorer （http：//www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/） 被用來計算密碼子的平均GC含量（GCall）以及密碼子的第1、2和3位置的GC含量（分別表示為GC1、GC2和GC3），GC12為GC1和GC2的平均值。

1.3 中性繪圖分析

中性繪圖分析是一種用于研究突變壓力和自然選擇對密碼子使用偏好影響的方法^[21]。利用R語言中的ggplot2包，以GC3作為橫坐標，GC12作為縱坐標，構建一個二維散點分布圖以表征之前篩選出來的31條序列。此外，使用SPSS 18.0，基于皮爾遜相關性分析，繪制GC12和GC3的線性關系回歸線。該回歸曲線的斜率大小表示密碼子使用偏好的主導原因。如果回歸曲線接近對角線（斜率=1.0），GC12 和 GC3 之間存在顯著相關性，表示突變壓力是密碼子偏好的主要驅動因素，自然選擇壓力無或較弱；相反，如果回歸曲線偏離對角線，斜率趨近于0，且GC12 和 GC3 之間沒有顯著相關性，則表明自然選擇是塑造密碼子使用的主要力量^[22]。

1.4 ENC-plot分析

ENC是評估同義密碼子使用不均衡度的重要指標^[23]，其范圍通常在20～61之間，與密碼子的偏好性呈負相關。ENC值為20表示極端偏倚，每個氨基酸僅使用1個密碼子；而ENC值接近61時，可以認為基本沒有偏好性。較低的ENC值（≤35）表示基因具有較強的密碼子偏好，即傾向于使用特定的密碼子來編碼每個氨基酸；較高的ENC值則表明密碼子使用偏好較弱^[24]。ENC-plot常用于探究影響特定基因密碼子偏好性的決定性因素，將各基因沒有密碼子使用偏好的期望ENC值^[23]作為縱坐標，其GC3s值作為橫坐標來繪制期望曲線。如果基因分布在預期曲線上或接近曲線，可以認為突變壓力對密碼子使用偏好產生了顯著影響；反之，如果這些點落在標準曲線下方且顯著偏離預期曲線，則可能是自然選擇等因素在密碼子偏好的形成中發揮了主要作用^[22]。為了更準確地評估期望ENC值與實際ENC值之間的差異，可以使用公式：ENC比率=（ENC期望-ENC實際）/ENC期望來計算，并通過直方圖將這些ENC比率的分布情況呈現出來。

1.5 PR2-plot分析

Parity rule 2 （PR2）-plot分析應用于評估具有4個同義密碼子氨基酸的密碼子偏好，并進一步確定突變壓力和自然選擇對密碼子使用的影響^[25]。本研究選擇了具有4個同義密碼子的氨基酸（如纈氨酸（Val）、脯氨酸（Pro）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly））來計算每個基因第3個堿基位置的組成頻率。散點圖的構建以A3s/（A3s+T3s）作為縱坐標，以G3s/（G3s + C3s）作為橫坐標。圖的中心點代表鏈內核苷酸組成遵循PR2 （A代表T，G代表C），表示DNA 2條互補鏈間的突變和選擇壓力沒有偏差，距中心的距離和方向表示偏離PR2的程度和方向。如果在密碼子的第3位置上，AT的頻率等于GC的頻率，圖中的點將沿坐標軸成比例分布，則表明基因的密碼子使用偏好僅受到突變壓力的影響；否則，說明自然選擇或兩者共同作用影響了密碼子的不均等使用^[26]。

1.6 RSCU分析和最優密碼子篩選

當RSCU等于1時，表示密碼子使用是無偏的，即在 RNA 轉錄中密碼子被隨機或平等地選擇；當RSCU值大于1時，表示該密碼子的使用頻率高于預期，為高頻密碼子；RSCU 值小于" 則表示該密碼子的使用頻率較低^[27-28]。

已知較低的 ENC 值代表較高的密碼子使用偏倚，而高表達基因通常具有較大程度的密碼子偏好，因此具有較小的 ENC 值。最優密碼子的確定是將基因按其ENC值降序排列，選擇排在ENC值高低兩端基因中的10％分別建立低表達和高表達基因庫。根據 CodonW 軟件計算2個基因庫中密碼子的RSCU值以及二者的差異值（ΔRSCU）。滿足RSCUgt;1且ΔRSCUgt;0.08的密碼子被定義為基因的最優密碼子^[29]。

2 結果與分析

2.1 密碼子偏好相關指標分析

紫葉苔線粒體基因組 CDS 序列的堿基組成分析顯示，A3s、T3s、C3s和G3s分 別 為 40.93%、45.44%、18.51%和19.80%，A3s和 T3s遠高于C3s和 G3s，表明紫葉苔線粒體基因組密碼子的第 3 位置堿基以 A/U 結尾為主。在密碼子不同位置的堿基GC含量分布如圖1 a）所示，GC1、GC2、GC3和GCall的分布區間分別為29.29%～61.36%、27.18%～52.91%、21.57%～54.57%和30.46%～56.28%。不同位置堿基GC含量的平均值大小如下：GC1（43.35%） gt; GC2（38.90%）gt;GCall（38.17%）gt; GC3（32.28%）。結果表明，紫葉苔線粒體基因組密碼子不同位置的GC含量分布不均衡，且偏好使用A/U堿基，在密碼子的第3位置上表現尤為明顯。不同編碼基因的ENC值分布在39.80～57.79之間，平均值為50.29。此外，CAI集中在0.13～0.21之間，平均值為0.17，遠小于1。上述結果表明，紫葉苔線粒體基因組存在密碼子使用偏好性，但整體偏倚程度較弱，基因表達水平較低。

紫葉苔線粒體密碼子偏好性主要指標的相關性分析如圖1 b）所示，密碼子的GCall和其他不同位置的GC含量及ENC均呈極顯著正相關，GC3與ENC呈極顯著正相關（r=0.66，plt;0.01），且二者的相關系數在不同位置堿基的GC含量與ENC的相關系數中最大。該結果表明GC含量，尤其是密碼子第3位置的GC含量對密碼子的偏好使用存在顯著影響。此外，ENC與基因編碼氨基酸的長度L_aa有極顯著正相關（r=0.56，plt;0.01），表明在紫葉苔線粒體中，基因的長度影響密碼子偏好性。

紫葉苔線粒體基因組蛋白編碼區密碼子的RSCU值分布如圖2所示，不同密碼子的RSCU值差異較大，其中編碼亮氨酸的密碼子UUA的RSCU值最高，為1.9 而另一個同樣編碼亮氨酸的密碼子CUC的RSCU值僅為0.41。此外，共鑒定出27個高頻密碼子，其RSCU值大于1。在這27個密碼子中，以U、A、G和C結尾的密碼子數分別為16、10、1和0，這表明紫葉苔線粒體基因組的高頻密碼子在使用偏好上多以A或U結尾。

2.2 中性圖分析

GC3和GC12之間的關系用中性圖（neutrality plot）分析（見圖3）。GC3的范圍為0.215 7～0.545 7，GC12的范圍為0.330 6～0.571" 平均值分別為0.322 8和0.411 2。GC12和GC3之間存在顯著的相關性（r= 0.620" plt;0.01），說明基因組中大多數編碼基因的前2個密碼子堿基與第3個堿基在組成上不存在顯著差異，定向突變壓力作用于所有密碼子位置。回歸直線的斜率（回歸系數）為0.534 0，表明突變壓力對密碼子偏好效應的貢獻率為53.40%，自然選擇等因素的貢獻率為46.60%。根據中性繪圖可知，突變壓力和自然選擇共同塑造了紫葉苔線粒體基因組的密碼子偏好，其中突變壓力占主要作用。

2.3 ENC曲線分析

圖4中ENC-plot結果表明，在紫葉苔線粒體基因組蛋白編碼序列中，基因的ENC值分布較聚集，有大量基因落在或靠近ENC標準曲線，而較少數的基因離標準曲線較遠。從ENC比值頻率統計分布圖也可以看出：ENC比率從-0.15到0.25不等；在31個蛋白編碼基因中，靠近ENC標準曲線的區間（-0.05～0.05）內共分布19個基因（61.29%），其實際和預期的ENC值差異較小；有9個基因（29.03%）的ENC比率大于0.0 反映了這些基因不僅分布在標準曲線下方且離標準曲線較遠。以上結果進一步表明，紫葉苔線粒體基因組的密碼子偏好性更多地受到突變壓力的作用，自然選擇的影響次之。

2.4 PR2-plot分析

為進一步評估紫葉苔線粒體基因4種堿基的偏倚關系，并了解突變和選擇壓力對密碼子使用的影響，對同義密碼子的第3位堿基進行了PR2-plot分析。如圖5所示，PR2水平4個區域的基因分布不均勻。在垂直方向上，大部分基因集中在平面的下半區域，表明在密碼子的同義位置上T的使用頻率高于A；在水平方向上，更多的基因分布在平面的右側，說明G的使用頻率高于C。因此，紫葉苔線粒體基因組同義密碼子的第 3 位置堿基在選擇上具有偏好性。根據堿基的不均衡使用，以及少數基因顯示出接近中心的位置，可以推測自然選擇與突變壓力可能共同影響了紫葉苔線粒體基因的密碼子使用偏好。

2.5 最優密碼子篩選

按照ENC值的大小順序，分別選取3個基因（rps14、rpl6、cox2）作為高表達基因庫，3個基因（ccmFC、rpl2、rtl）作為低表達基因庫。按照最優密碼子的標準（RSCU gt;1且ΔRSCUgt;0.08），共篩選出23個最優密碼子（見表1），其中以U結尾的密碼子有14個，以A結尾的密碼子有8個，以G結尾的密碼子有1個，而以C結尾的密碼子有0個。該結果進一步表明了紫葉苔線粒體基因的最優密碼子偏好以A或U結尾。

3 討 論

在基因編碼中，生物體傾向于選擇某些特定的密碼子，即CUB，對CUB的解析有助于理解基因調控和進化過程。CUB在不同基因組、基因之間以及同一基因內部都存在差異^[30]，同一物種的核基因組和細胞器基因組的CUB往往也有較大差別。植物具有較高的GC含量，其中單子葉植物的核基因編碼區富含以C/G結尾的密碼子，雙子葉植物則有較高比例的以A/U結尾的密碼子^[24]，葉綠體和線粒體基因組在密碼子使用上更傾向于使用A/U結尾的密碼子。在對多種植物的葉綠體基因組進行的研究中，如水稻屬^[26]、胡頹子屬^[31]、柏科^[32]、枸杞^[33]等，都發現了這種密碼子偏好性。目前，對植物線粒體基因組CUB模式的研究還相對有限，但已有研究^[19，34-35]也揭示了相似的規律，為理解植物基因組的進化提供了寶貴信息。

本文對紫葉苔線粒體基因組蛋白編碼序列進行了全面的密碼子使用偏好性分析。密碼子組成計算結果顯示，紫葉苔線粒體基因組的平均GC含量和密碼子不同位置的GC含量均低于50%，表明紫葉苔線粒體基因組傾向于富含A/T的核苷酸，偏好以A/U結尾的密碼子，且基因組中的高頻密碼子和最優密碼子也主要以A/U結尾。通過對維管植物、苔蘚植物和藻類線粒體基因組的密碼子偏好進行初步比較^[19-20，34]，發現綠色植物各類群在密碼子偏好上既表現出共性特征，也存在動態變化。其中大多數物種偏好以A/U結尾的密碼子，但這種偏好的程度在不同類群之間以及類群內部又表現出一定的變異性。總體來看，苔蘚植物對A/U結尾密碼子的偏好低于水生輪藻類，高于在陸地繁盛的維管植物，這似乎也暗示了苔蘚植物在植物界中從水生到陸生過渡的進化地位。地錢門、真蘚門和角苔門在線粒體基因組的密碼子偏好上也存在一定差異，其中地錢門在密碼子末端位點對A/U的偏好最弱，而真蘚門的偏好性較強^[34]。本文的結果同樣顯示，紫葉苔線粒體基因組密碼子對A/U具有較弱的偏好性，為陸生植物早期分化類群在基因組組成上的共性特

征提供了又一證據。植物在線粒體基因組密碼子偏好上的相似性可能與植物線粒體的共同起源有關，而偏好性強度的變化可能與不同植物類群對陸生環境變化的適應性密切相關。例如，在陸生植物譜系的進化過程中，線粒體基因組中的密碼子使用逐漸從強烈的AT偏好轉變為越來越多的GC積累，這可能有助于減少DNA在強紫外線輻射下的損傷^[20]，從而更好地適應干燥的環境。

在基因組學研究領域，人們對CUB的形成機制進行了廣泛探討，其中自然選擇理論與中性理論得到了學術界的普遍認可^[36]。在研究密碼子使用偏好的成因時，中性圖是一種重要的分析工具，它能夠揭示自然選擇和突變壓力對CUB的相對影響^[37]。紫葉苔線粒體基因組密碼子中性繪圖結果顯示，GC3與GC12顯著相關，表明定向突變壓力在整體密碼子組成上發揮了重要作用；同時回歸直線的斜率（回歸系數）為0.534 0，進一步表明，相較于自然選擇等因素，突變壓力對于密碼子的組成成分發揮了更為重要的作用。為了進一步說明同義密碼子的使用偏好性，基于同義密碼子第3位置的GC含量（GC3s）繪制ENC-plot圖，結果顯示大部分基因接近預期曲線，表明這些基因的密碼子偏好性主要受突變壓力的制約，自然選擇的作用次之。在PR2-plot分析中，只有少量基因位于或接近中心坐標（0. 0.5），大部分基因散落在A3/（A3+T3）lt;0.5和G3/（G3+C3）gt;0.5的區域范圍內，顯示在同義位點上不同堿基的使用頻率存在差異。這也表明，在形成紫葉苔線粒體基因組的CUB時，除了受到中性突變壓力的影響外，還受到自然選擇及其他因素的影響。植物線粒體基因組密碼子的偏好性可能以突變或自然選擇作為主要的驅動力，或同時受到其他多種因素的共同作用^[30]。然而目前針對苔蘚植物的相關研究極少，有待加大對該植物類群線粒體基因組的探討，尋找更廣泛的密碼子偏好規律，為揭示植物類群的系統發育關系，以及理解其進化歷程等提供更全面、深入的見解。

此外，本研究從紫葉苔線粒體基因組中共篩選出23個最優密碼子。這些密碼子的大多數在第3位置堿基上或以U結尾，或以A結尾，更進一步表明紫葉苔線粒體基因組對于A/U結尾密碼子的偏好，NNA或NNU密碼子的使用模式也與之前其他植物細胞器基因組最優密碼子的篩選結果一致^[38-39]。基于紫葉苔線粒體基因組密碼子使用模式進行外源序列優化，可以在后續以基因工程為手段的紫葉苔屬遺傳發育、物種保護等研究工作中，用于改善基因表達。

4 結 語

基于紫葉苔線粒體基因組CDS序列，對紫葉苔線粒體基因組的密碼子組成、中性繪圖、ENC-plot繪圖、PR2-plot繪圖等進行了分析，主要結論如下：紫葉苔線粒體基因組CDS序列傾向于富含A/T的核苷酸和以A/U結尾的密碼子，但偏倚程度較弱；其同義密碼子的使用偏好性除主要受到突變壓力的影響外，還受到自然選擇、堿基組成和基因長度等因素的影響；篩選出了23個最優密碼子，可用于紫葉苔分子發育和遺傳保護等方面的研究。

本文僅針對紫葉苔線粒體基因組的蛋白編碼序列進行了密碼子偏好分析，后續將進一步研究非編碼序列如內含子數量等因素對密碼子偏好性的影響，并增加苔蘚及其他不同植物類群的物種作為線粒體基因組密碼子偏好性的研究對象，結合系統發育樹深入探討密碼子偏好與進化的關系。

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