產CpxP蛋白枯草芽孢桿菌的發酵優化及中試生產

摘 要：為獲得產CpxP蛋白枯草芽孢桿菌ZY1液體發酵的最佳條件并制備微生態菌劑，采用單因素試驗與響應面實驗對ZY1進行發酵工藝優化研究。結果表明：搖瓶發酵培養基最佳碳源、氮源、無機鹽分別為淀粉、豆粕、NaCl；最優培養基配方為淀粉2.12 g/L、豆粕5.90 g/L、NaCl 5.21 g/L，活菌數達到9.63×108 CFU/mL，比培養基優化前提高了11.04倍；搖瓶發酵條件最佳初始pH值、溫度、轉速、接種量分別為7.0、37 ℃、200 r/min、2%，活菌數達1.05×109 CFU/mL，比培養基優化后提高了9.0%；按10%接種量基于5 t發酵罐體系進行菌劑中試生產過程中，ZY1活菌數達到1.05×10¹¹ CFU/mL，比搖瓶優化后提高了100倍；發酵結束時芽孢率達到90%，經噴霧干燥制備出菌劑1 012 kg，成品檢測活菌數為8.5×109 CFU/g。研究結果可為進一步開展CpxP蛋白在動物細菌性腹瀉病生物防治功能方面的研究提供基礎材料。

關鍵詞：蛋白質工程；CpxP蛋白；枯草芽孢桿菌；發酵優化；響應面；中試生產

中圖分類號：Q939.9

文獻標識碼：A"" DOI：10.7535/hbkd.2025yx01011

收稿日期：2024-05-22；修回日期：2024-08-12；責任編輯：張士瑩

基金項目：國家藥典委員會科研項目（2021Y04）；

河北省自然科學基金生物醫藥聯合基金重點項目（C2020208020）；河北省農業科技成果轉化資金項目（202460101030040）

第一作者簡介：

董榮榮（1998—），女，河南濮陽人，碩士研究生，主要從事CpxP蛋白在畜禽養殖中細菌性腹瀉病防治功能方面的研究。

通信作者：劉浩。E-mail：390051387@qq.com

周曉輝，教授。E-mail：zhouxh2003@aliyun.com

Fermentation optimization and pilot production of

Bacillus subtilis ZY1 producing CpxP

DONG Rongrong" ZHANG Huan" YU Xinran" LIU Hao" ZHOU Xiaohui1

（1.School of Food and Biology， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China;

2.Department of Asset and Laboratory Management， Hebei University of Science and Technology，

Shijiazhuang， Hebei 050018， China）

Abstract：In order to obtain the optimal conditions for liquid fermentation of Bacillus subtilis ZY1 producing CpxP protein and prepare microecological bactericides， the fermentation process of Bacillus subtilis ZY1 was optimized by single factor test and response surface test. The results show that the optimal carbon source， nitrogen source and inorganic salt of fermentation medium are starch， soybean meal and NaCl， respectively. The optimal medium formulation is starch at 2.12 g/L， soybean meal at 5.90 g/L， and NaCl at 5.21 g/L， with a viable bacteria count of 9.63×108 CFU/mL， which is 11.04 times higher than that before the medium optimization. The optimum initial pH value， temperature， rotation speed and inoculation amount for shake flask fermentation are 7.0， 37 ℃， 200 r/min and 2%， respectively. The viable bacteria number is 1.05×109 CFU/mL， which is 9.0% higher than that of optimized medium. During the pilot production process of the microecological bactericides based on 5 t fermentation tank system with 10% inoculated quantity， the count of viable ZY1bacteria reaches 1.05×10¹¹ CFU/mL， which is 100 times higher than that after shaker optimization. When the spore rate reaches 90% at the end of fermentation， 1 012 kg bactericides are prepared by spray drying， and the count of viable bactericide is 8.5×109 CFU/g. The research results can provide basic materials for further research on the biocontrol function of CpxP protein in animal bacterial diarrhea disease.

Keywords：protein engineering; CpxP protein; Bacillus subtilis; optimization of fermentation; response surface; pilot production

細菌性腹瀉病是動物養殖中的常見疾病，對畜牧業造成較大經濟損失^[1]。大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌和非傷寒桿菌等革蘭氏陰性菌是引起細菌性腹瀉的主要致病菌，通過引起腸道微生物菌群失衡，造成消化道代謝紊亂，導致腹瀉甚至死亡。抗生素、中草藥以及生物制劑等是細菌性腹瀉病的常用防治手段^［2-5］。雖然抗生素治療效果顯著，但長期使用會產生多重耐藥性，中國農業農村部已于2020年頒布退出所有促生長類藥物飼料添加劑（除中藥外）在動物源性食品中的使用^[6]。中草藥雖然可以調節動物腸道菌群，緩解細菌性腹瀉，但存在提取困難、成分復雜等問題^［7-11］。因此，生物防治成為當前防治細菌性腹瀉病的研究熱點。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，BS）屬于芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌，具有可分泌抗菌肽、黏蛋白、有機酸等多種活性代謝產物的益生特性，常被用于畜禽及田間病害的生物防治。但BS功效及作用隨菌株的不同而異^[12-15]。基于BS菌株不產生內毒素、可穩定表達外源蛋白、抗逆性強和廣譜抗性等優點^[15]，并針對以上BS單一菌株功能特異性弱、代謝產物作用機制不明確等問題，本文研究開發了具有協同抗菌作用的ZY1菌株，其既有BS特性，又擁有分泌抑制革蘭氏陰性菌抗菌蛋白CpxP的特性。課題組前期對大腸桿菌MG1655標準株系進行了深入研究，發現過度表達CpxP蛋白會顯著削弱其游動能力，暗示CpxP在大腸桿菌纖毛形成過程中起到抑制作用，降低了侵染能力與致病性^［16-18］。經過多序列比對和分子生物學分析，結果顯示，CpxP在蛋白水平上與志賀氏菌和沙門氏菌具有較高的同源性，可能對治療革蘭氏陰性菌引起的細菌性腹瀉病具有普遍適用性。但由于CpxP蛋白穩定性較差、不易保存，因而ZY1的菌體產量偏低，僅為8.0×10⁷ CFU/mL。而微生物蛋白表達水平與合適的發酵條件息息相關，通過優化發酵培養基與發酵條件，可以充分發揮菌株的生產潛能，提高菌體產量，增加蛋白表達量，降低工業化生產成本^[19]。本研究利用枯草芽孢桿菌ZY1作為表達系統分泌CpxP蛋白，通過單因素試驗和響應面實驗優化發酵培養基及發酵條件^[20]，利用大罐發酵技術制得高純度高活性固體菌劑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌ZY 河北科技大學蛋白質工程實驗室篩選并保存。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖，北京索萊寶科技有限公司提供；蛋白胨、酵母浸粉、糊精、尿素、豆粕、豆餅粉，河北民得富生物技術有限公司提供；蔗糖、淀粉、甘油、尿素、硫酸銨、NaCl、MnSO4、CaCO3、KCl、MgSO4、ZnSO 天津科百奧生物試劑有限公司提供。

1.1.3 儀器與設備

ZHWY-2102C恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司提供；D-1型自動蒸汽滅菌鍋，北京發恩科貿有限公司提供；HH-2數顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司提供；JJ200精密電子天平，常熟雙杰測試儀器廠提供；EL204型分析天平，上海民橋精密科學儀器有限公司提供；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司提供；SPX-250B-Ⅱ生化培養箱，上海賀德實驗設備有限公司提供；100 L、5 t發酵罐，滄州旺發生物技術研究所有限公司提供；LPG離心噴霧干燥機，滄州旺發生物技術研究所有限公司提供。

1.1.4 培養基配方

LB固體培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L，pH值為7.0。LB液體培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH值為7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

將實驗室低溫保藏的枯草芽孢桿菌ZY1在LB固體培養基上劃線活化菌株，于37 ℃恒溫培養箱中過夜培養。挑取固體培養基上的單菌落，接種至裝液量100 mL/250 mL的液體培養基中，于180 r/min、37 ℃過夜培養。按2%接種量將種子液接種至裝液量100 mL/250 mL的液體培養基中，于180 r/min、37 ℃培養至穩定期。

1.2.2 發酵培養基優化

在培養基中分別選取淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖作為唯一碳源，確定枯草芽孢桿菌ZY1的最佳碳源；分別選取蛋白胨、豆餅粉、豆粕、尿素、酵母浸粉、硫酸銨作為唯一氮源，確定最佳氮源；分別選取MnSO4、NaCl、CaCO3、KCl、ZnSO4、MgSO4作為不同無機鹽種類，確定最佳無機鹽；在最佳碳源、氮源、無機鹽的基礎上對培養基中的其他因素進一步優化。選擇淀粉、豆粕、NaCl的添加量均為0～12.5 g/L，考察3個因素對枯草芽孢桿菌ZY1活菌數的影響，實驗重復3次，取平均值。發酵條件均為37 ℃、180 r/min、36 h。

1.2.3 響應面實驗

根據單因素試驗結果，采用Design-Expert 11軟件，依據Box-Behnken實驗設計原理，選取淀粉（A）、豆粕（B）、NaCl（C）作為自變量，以活菌數（Y）作為響應值，設計3因素3水平的響應面實驗進行發酵培養基優化。Box-Behnken實驗設計因素與水平見表1。

1.2.4 發酵條件優化

在確定發酵培養基中淀粉為碳源、豆粕為氮源、NaCl為無機鹽的基礎上，分別對ZY1初始pH值（5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0）、培養溫度（28、31、34、37、40、43 ℃）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、轉速（160、180、200、220、240、260、280 r/min）4個發酵條件進行單因素發酵優化試驗，發酵時間為36 h，以活菌數為評價指標，實驗重復3次，取平均值。

1.2.5 中試生產

以100 L發酵罐為種子罐，50%裝液量，采用火圈接種法接種后進行ZY1種子液培養。發酵罐參數設定溫度為37 ℃，電機轉數初始6 h為120 r/min，隨后為150 r/min，罐體壓力為0.05 MPa。將培養后的種子液通過調節管路按10%接種量接種至5 t發酵罐中。基于搖瓶優化后的培養基，在5 t發酵罐中添加酵母膏、玉米漿干粉、硫酸錳等物質進行菌劑中試生產，發酵結束后采用LPG離心噴霧干燥機制備菌劑。

1.2.6 數據統計

采用Origin 2018、Design Expert 11.0軟件處理數據，用SPSS 26軟件ANOVA檢驗程序進行單因素方差分析，結果以“平均數±標準誤差”表示，Plt;0.05為差異顯著，Plt;0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基優化

2.1.1 碳源及添加量對發酵的影響

碳源是微生物代謝活動所需能量的主要來源。菌株對碳源的利用情況可以反饋其生長代謝情況，詳見圖1。由圖1 a）可知，當碳源為淀粉時，活菌數最高為

5.80×10⁸ CFU/mL，較培養基優化前提升了6.25倍，與其他碳源相比，均有顯著差異（Plt;0.05），因此得出最佳碳源為淀粉。由圖1 d）可知，活菌數隨淀粉添加量的增加先上升后下降，當添加量為2.5 g/L時，活菌數最高為8.00×10⁸ CFU/mL，與5 g/L添加量時無顯著差異，但均顯著高于其他添加量時的ZY1活菌數。因此，淀粉最佳添加量為2.5 g/L。

2.1.2 氮源及添加量對發酵的影響

氮源能提供微生物生長所需要的核苷酸、維生素與礦物質元素。圖1 b）表明，當氮源為豆粕時，活菌數為6.73×10⁸ CFU/mL，均顯著高于其他氮源培養時的活菌數（Plt;0.05）。因此，最佳氮源為豆粕。由圖1 e）可知，未添加豆粕時，活菌數為0，說明微生物無氮源不生長。隨著豆粕含量的增加，活菌數先增加后下降，添加量為5.0 g/L時，活菌數均顯著高于其他添加量（Plt;0.05），達到9.50×10⁸ CFU/mL。因此，豆粕最佳添加量為5.0 g/L。

2.1.3 無機鹽種類及添加量對發酵的影響

無機鹽作為微生物生長的必要營養物質，參與微生物的各種代謝途徑及細胞構成。由圖1 c）可知，當無機鹽為NaCl時，ZY1菌體產量均顯著高于其余組（MgSO4除外）（Plt;0.05）。因此，最佳無機鹽為NaCl。由圖1 f）可知，添加量為5.0 g/L時，活菌數最大為9.80×10⁸ CFU/mL，與7.5 g/L相比無顯著差異，與其他添加量相比均具有顯著性（Plt;0.05）。因此，NaCl最佳添加量為5.0 g/L。

2.2 響應面優化分析

在單因素試驗基礎上，使用Design Expert 11軟件中Box-Behnken設計3因素3水平實驗。選取淀粉（A）、豆粕（B）、NaCl（C）添加量為自變量，活菌數（Y）為響應值，設計出17種實驗方案，測定每組實驗條件下ZY1活菌數，Box-Behnken實驗設計及結果見表 回歸模型方差分析見表3。

應用Design Expert 11軟件得到以活菌數為響應值的二元多項回歸方程：Y=86.72-1.64A+2.75B+0.96C-0.25AB+0.68AC+0.1BC-5.45A²-3.87B²-5.45C²。回歸模型方差分析如表3所示，二次回歸模型P=0.000" 差異極顯著；失擬項P=0.079" 差異不顯著，說明無異常數據，模型建立成功。響應面相關系數（R²）為0.987" 回歸方程校正決定系數為0.971" 均大于0.9 說明擬合程度較好，預測值與實際值高度相關，可應用于ZY1發酵活菌數理論預測。此外，方差分析結果顯示，A與B對活菌數影響極顯著（Plt;0.01），C對活菌數影響顯著（Plt;0.05），各因素對活菌數影響程度為B＞A＞C。

為更直觀了解2種變量之間的交互作用及各因素交互作用對ZY1活菌數的影響，運用Design Expert 11軟件基于二次回歸方程模擬繪制影響活菌數的等高線和三維圖，結果如圖2所示，其中淀粉、豆粕、NaCl 3個因素均存在極值點。對二次多項回歸方程求導，獲得最佳培養基配方為淀粉質量濃度為2.12 g/L、豆粕質量濃度為5.90 g/L、NaCl質量濃度為5.21 g/L，在此配方下發酵活菌數的預測值最高達9.74×10⁸ CFU/mL。為了驗證響應面模型的準確性，在上述最佳培養基配方條件下進行6次平行實驗。經發酵實驗結果驗證，得到ZY1活菌數平均值為9.63×10⁸ CFU/mL，與預測值接近，說明預測結果可信。

2.3 發酵條件優化

2.3.1 初始pH值對發酵的影響

微生物菌株生長受pH值的影響較大。通常情況下，微生物處于自己的耐受pH值時，可以正常生長繁殖，但生長速度及活性會下降。由圖3 a）可知，活菌數隨pH值的升高先上升后下降，當pH值為7.0時活菌數最多，達到9.80×10⁸ CFU/mL，與pH值為7.5時相比無顯著差異，與其他pH值相比均有顯著差異（Plt;0.05）。因此，最佳初始pH值為7.0。

2.3.2 培養溫度對發酵的影響

微生物在生長繁殖時隨環境溫度的變化而變化。溫度過高或者過低，均會對微生物的生長繁殖產生影響。由圖3 b）可知，溫度為37 ℃時，活菌數最高為9.83×10⁸ CFU/mL，與其他溫度相比均有顯著差異（Plt;0.05），且活菌數隨溫度的升高先增加后減少。因此，最佳培養溫度為37 ℃。

2.3.3 接種量對發酵的影響

在發酵過程中，菌種接種量是影響微生物生長速度的重要因素。適宜的接種量可以促進菌種的生長繁殖，提高發酵效率。由圖3 c）可知，當接種量為2%時，活菌數為1.02×10⁹ CFU/mL，與3%接種量相比無顯著差異。因此，種子液最佳接種量為2%。

2.3.4 轉速對發酵的影響

在搖床發酵中，轉速通過影響溶液的溶氧對菌株發酵產生影響。由圖3 d）可知，當轉速為200 r/min時，活菌數最高，達到1.05×10⁹ CFU/mL，與其他轉速相比，均有顯著差異（Plt;0.05），且活菌數隨轉速的增加先上升后下降。因此，最佳轉速為200 r/min。

2.4 中試生產

對枯草芽孢桿菌ZY1進行5 t中試擴大生產，發酵過程中參數檢測結果見圖4。由圖可知，5 t發酵罐培養時，6～28 h為對數生長期，32 h時活菌數最大為1.05×10¹¹ CFU/mL，比搖瓶優化后提高了100倍。在12～20 h時受菌株快速生長代謝產生的乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸影響，pH值呈現緩慢下降趨勢，20 h后pH值穩定上升，可能與菌株代謝活動減弱及芽孢產生有關^[15]。發酵至36 h時，芽孢率約為75%，此時活菌數為1.01×10¹¹ CFU/mL。由于菌株放大生產的可行性及穩定性較好，因而活菌數均達到預期值，發酵罐回涼結束后芽孢率達到90%時，可用于噴霧干燥。改變管路將發酵液轉入預混罐，5 t發酵罐中發酵液流入的預混罐中加入30%氫鈣，調整預混罐轉速為80 r/min，混勻罐內物料，經噴霧干燥可得到1 012 kg制劑。微生物檢測參考標準GB/T 26428—2010，經平板活菌計數驗證，得到活菌數為8.50×10⁹ CFU/g。文獻[21]對枯草芽孢桿菌進行液態發酵培養、鼓風干燥后，所得芽孢產量為4.80×10⁹ CFU/g。與之相比，雖然本文枯草芽孢桿菌的活性較高，但仍可借鑒其干燥方式獲得更高的ZY1活性及芽孢數。文獻[22]在對枯草芽孢桿菌Y31培養基和固態發酵條件優化后，Y31活菌數達到了2.40×10¹⁰ CFU/g，遠高于本文ZY1活性。其原因一是菌株不同，二是發酵方式不同^[23]。

3 結 語

以課題組前期篩選得到的一株產CpxP蛋白的菌株Bacillus subtilis ZY1為出發菌株進行液體發酵優化及中試生產，得出以下結論：1）培養基優化結果為淀粉2.12 g/L、豆粕5.90 g/L、NaCl 5.21 g/L；2）發酵條件優化結果為初始pH值為7.0、溫度為37 ℃、接種量為2%、轉速為200 r/min；3）5 t發酵罐中試生產過程中菌株ZY1活菌數達到1.05×10¹¹ CFU/mL；4）發酵液經噴霧干燥制備出1 012 kg菌粉，成品檢測后得到活菌數為8.50×10⁹ CFU/g。

本文發酵方式與干燥方式的不同可能損失了菌體產量和蛋白產量，因此，未來擬結合固態發酵與鼓風干燥方式提高ZY1的活菌數及芽孢數，為進一步開展CpxP蛋白在動物細菌性腹瀉病生物防治功能方面的研究提供優良制劑。

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