珙桐MADS-box基因家族的鑒定、表達及調控分析

關鍵詞： 珙桐； MADS-box 基因家族； 花瓣狀苞片； 基因異位表達

1 引言

花是被子植物特有的生殖器官，其大小、形狀和顏色因物種而異. 植物開花的過程由一系列基因構成一個復雜的基因調控網絡響應外界環境及內源的開花信號而操縱. 編碼一系列轉錄因子的MADS-box 基因家族在其中發揮著重要的作用，參與了從響應開花信號到花原基啟動再到花器官身份確立以及花發育的整個開花過程.

在植物中具有Ⅰ類和Ⅱ類兩種MADS-box 基因，Ⅰ類MADS-box 基因也稱M 型基因，編碼的蛋白只有SRF-like MADS-box 結構域，根據其C 末端區域的保守基序可分為Mα、Mβ 和Mγ 3 類［1］. 植物Ⅱ 類MADS-box 基因也稱MIKC 型基因，其編碼的蛋白除MADS-box 結構域外，還具有I（intervening）、K-box（keratin-like）和C（C-terminal）3 個結構域［2］. MIKC 型基因又可進一步分為MIKCC 型和MIKC*型基因，MIKCC 型基因編碼的蛋白保留了原始的“經典結構”， 而MIKC*型蛋白的I 結構域明顯長于MIKCC蛋白，K-box 結構域在序列及長度上也與MIKCC 蛋白存在差異［3］. MIKCC 型基因根據系統發育情況可劃分為AG， AGL12， AGL15，AGL17， AGL2/SEP， AGL6， FLC， GGM13，PI/AP3， STMADS11， SQUA， TM3 共12 個不同的進化枝，每個進化枝的基因具有相似的表達模式和高度相關的功能.

MADS-box 基因編碼的蛋白在響應開花信號調控開花時間，花器官身份決定，種子及果實發育以及根的發育等多方面發揮重要的調控作用，其在花器官身份決定中的作用尤其受到關注. 一朵典型的花通常由四輪花器官按同心圓的形式排列，從外到里分別為萼片、花瓣、雄蕊和心皮. 研究人員們通過突變體植株中花器官的同源轉化發現花器官身份的確立由一系列花器官特征基因指定［4］. 并基于這些基因的突變體表型及遺傳相互作用，經過不斷發展、補充和修訂，最終建立了花器官身份決定的“ABCDE”模型，將這些花器官特征基因分為5 類并對它們的功能進行了描述. 根據“ABCDE”模型：A 類基因指定萼片的形成；B 類基因和A 類基因共同指定花瓣的形成；B 類基因和C類基因共同指定雄蕊的形成；雌蕊的形成由C 類基因單獨指定；D 類基因調控胚珠的發育；E 類基因參與每一輪花器官的形成［5-8］. 目前已鑒定的所有花器官特征基因中除了 A 功能基因 APETALA2（AP2） 外都編碼 MIKCC 型MADS-box 轉錄因子［9， 10］

在花器官身份建成時，花器官特征基因的表達被限制在特定的器官輪里. 而花器官特征基因在其他的花器官區域發生異位表達，能夠將其影響擴大到不同的花器官輪，從而導致花器官的同源轉化［10， 11］. 在矮牽牛和番茄葉中證明了轉基因植株異位表達AG 基因可以將萼片轉化為心皮，花瓣轉化為雄蕊. AP2 基因在第三輪花器官的表達導致雄蕊轉變為花瓣［12-14］. 在一些花被未分化的單子葉植物中，呈現兩輪一樣的花瓣狀花被，例如郁金香［11］和百合［15］，在它們的兩輪花被中都檢測到了B 類基因的表達. 在雙子葉植物中也有這樣的例子，例如枇杷［16］和小花瓜蓮［17］. 除了花器官外，一些物種在苞片中也表現出花瓣的特征，珙桐（Davidia involucrata）的花尤其特別，其花被完全缺失，且花序軸極度縮短形成一個球形的頭狀花序，使整個花序看起來像一朵花. 花序外側生長的一對（少數為單瓣或三瓣）白色苞片取代花瓣，以吸引傳粉者和保護花粉免受雨水的侵襲. 并且隨著花序的生長，苞片有明顯的由葉狀向花瓣狀過渡的過程. 這些特征表明，珙桐具有較高的科學價值，是研究花器官特性在花外建立和花瓣狀苞片發育的理想材料.

研究人員已經認識到MADS-box 家族基因在珙桐苞片發育中的重要性，并對其部分基因進行了研究，但僅局限于少數幾個基因的克隆及表達定量［18， 19］. 目前仍需要對珙桐的MADS-box 基因家族進行更全面、系統的研究，以了解其對其花器官特性和花瓣狀苞片發育的影響. 本研究將基于Chen 等［20］發布的珙桐基因組組裝，在全基因組范圍內對珙桐MADX-box 家族基因進行鑒定，并通過與近緣物種的比較探索該基因家族的進化. 進一步，通過轉錄組測序分析MADS-box 在苞片發育過程中的表達模式并預測其潛在的靶基因，探究MADS-box 基因家族對珙桐花瓣狀苞片形成的調控機制，對被子植物開花調控網絡進行進一步的補充和完善.

2 材料與方法

2. 1 材料

2. 1. 1 植物材料 珙桐苞片及葉片材料取于四川省成都市都江堰龍溪-虹口國家級自然保護區.分別于2018 年4 月15 日、4 月22 日、5 月7 日采集開花早、中、晚期的珙桐苞片和葉片（對應的苞片分別為綠色、淡綠色和白色）. 根據時間由早到晚，將3 個時期的苞片和葉片分別標記為B-1、B-2、B-3和L-1、L-2、L-3. 每組苞片和葉片各取3 個生物重復.

2. 1. 2 數據來源 本研究使用的珙桐及近緣物種基因組及注釋來源：珙桐全基因組序列和注釋從國家基因組科學數據中心（National GenomeData Center，https：//ngdc. cncb. ac. cn/）獲取，登錄號為GWHABJS00000000［20］. 近緣物種喜樹（Camptotheca acuminata）染色體規模基因組組裝及注釋數據從Figshare 數據庫獲得［基因組組裝：https：//doi. org/10. 6084/m9. figshare. 12570599；注釋：https：//doi. org/10. 6084/m9. figshare. 12570614］［21］. 藍果樹（Nyssa sinensis）［22］和山茱萸（Cornus florida）的全基因組信息均從NCBI 數據庫下載，登錄號分別為：GCA_008638375. 1 和GCF_030987335. 1.

2. 2 方法

2. 2. 1 珙桐MADS-box 家族基因鑒定 以擬南芥MADS-box 蛋白序列為參考序列，使用Ge?MoMa-1. 9［23］軟件，通過tblastn 策略在珙桐基因組范圍內鑒定可能的MADS-box 基因座位. 基于與Swisse-Prot 數據庫的比對結果將新基因座位與基因組注釋去冗余獲得候選基因. 將全部候選基因編碼的氨基酸序列使用Interproscan［23］，利用Pfam數據庫（http：//pfam. xfam. org/）進行注釋. 提取注釋結果中包含PF00319（SRF-box）和PF01486（MIKCC 型 K-box）結構域的序列為珙桐MADSbox蛋白序列.

2. 2. 2 珙桐MADS-box 基因系統發育分析及分類 利用鑒定出來的珙桐MADS-box 基因編碼的最長氨基酸序列進行系統發育分析. 長度大于100aa 的序列與擬南芥MADS-box 基因編碼的蛋白質序列一起，利用MAFFT 軟件［24］進行多序列比對. 使用ProtTest 3［25］軟件檢測序列建樹的最佳模型，然后使用RAxML［26］基于最大似然法構建ML 進化樹，并根據分析結果對MADS-box 基因進行分類. 長度小于100aa 的序列與NR 數據庫進行比對，參考比對結果進行分類.

2. 2. 3 山茱萸目物種MADS-box 基因家族同源性研究 對喜樹、藍果樹、山茱萸使用與珙桐相同的方法分別鑒定物種中的MADS-box 基因并分類. 并將在珙桐及近緣物種中鑒定出來的MADSbox家族基因使用OrthoFinder-v2. 4. 0［27］進行同源性分析.

2. 2. 4 珙桐MADS-box 基因家族特征分析 將鑒定出來的珙桐MADS-box 蛋白氨基酸序列利用MEME［28］進行motif 預測. 利用Expasy［29］的Protparam工具（https：//web. expasy. org/protparam/）分析編碼蛋白的理化性質. 另外分別使用TMHMM2. 0［30］和SignalP-6. 0［31］軟件對蛋白質氨基酸序列的跨膜結構域和信號肽結構進行預測.2. 2. 5 珙桐MADS-box 基因家族進化分析 使用MCScanX［32］基于默認參數進行物種內共線性分析及復制類型分類. 隨后根據物種內共線性分析得出的共線性基因對，利用基因的CDS 序列對共線性基因對之間的堿基非同義替換率（Ka）和同義替換率（Ks）進行計算. 最后對M type， MIKC*和 MIKCC 三種類型的MADS-box 基因的Ka/Ks進行計算，分析珙桐不同類型MADS-box 基因所受到的選擇壓力.

2. 2. 6 珙桐MADS-box 基因在苞片發育過程中的表達模式分析 從三個發育時期的18 例苞片及葉片樣本中提取總RNA 進行轉錄組測序. 轉錄組文庫構建和測序服務由華大基因提供，使用BGISEQ-500 測序平臺進行. 測序原始數據已上傳至國家基因組科學數據中心GSA 數據庫（CRA013964），可通過https：//ngdc. cncb. ac. cn/gsa 公開訪問. 使用SOAPnuke 短序列過濾軟件和Trimmomatic［33］對原始數據進行過濾獲得Cleanreads. 使用HISAT2［34］將Clean reads 比對到珙桐基因組. 利用Stringtie 軟件［35］對不同發育階段的苞片和葉片中的基因表達進行定量分析. 采用DEseq2 軟件［36］進行差異表達分析，差異表達基因篩選標準為log2FC 絕對值大于等于1 且FDR 小于0. 01.

2. 2. 7 基因表達模式的qRT-PCR 驗證 qRT-PCR 使用Hieff UNICON? Universal Blue qPCRSYBR Green Master Mix （Yeasen； Shanghai，China）基于CFX Connect Real-Time PCR DetectSystem 平臺進行. 擴增程序為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，40 個循環. 使用珙桐β-DiACTIN 基因作為內參基因，發育早期的葉片（L-1）作為對照組，使用2?ΔΔCt法計算基因的相對表達量. qRT-PCR 使用的引物見表1.2. 2. 8 珙桐MADS-box 轉錄因子靶基因預測 利用 JASPAR 數據庫（ https：//jaspar. elixir. no/）中擬南芥SVP， AP3， AP1 和SEP3 轉錄因子結合位點的motif 分別在基因轉錄起始位點上游2000 bp范圍內識別潛在的結合位點. 然后在轉錄調控區具有結合位點的基因中根據pearson 相關性系數，篩選與對應珙桐同源基因表達量相關性gt;0. 70或lt;-0. 70 且Plt;0. 01 的基因作為珙桐同源轉錄因子的潛在靶基因.

3 結果

3. 1 珙桐MADS-box 基因鑒定及分類

在珙桐基因組中共鑒定出103 個MADS-box家族基因，將這些基因分別命名為DiMADS1-103，其編碼的蛋白質分別命名為DiMADS1-103.根據系統發育樹的結果（ 圖1a），參考擬南芥MADS-box 基因家族對103 個DiMADSs 進行了分類. 結果表明珙桐含有34 個M type（Ⅰ類）和69 個MIKC（Ⅱ 類）基因（圖1b）. 其中Ⅰ 類MADS 基因中包含18 個Mα、8 個Mβ 和8 個Mγ 分支基因. Ⅱ類MADS 包括10 個MIKC*類基因和59 個MIKCC類基因，每個MIKCC亞家族有1～9 個成員（圖1c）.可以發現珙桐在AGL2/SEP 亞家族、SQUA 亞家族以及STMADS11 亞家族中的基因數量遠超擬南芥，說明這幾個MADS-box 基因家族的分支可能在珙桐的進化過程中發生了明顯的擴張，并且有可能導致這些基因的功能在珙桐中的進一步分化. DiMADS76 由于序列較短，未用于構建系統發育樹. 根據與Nr 數據庫的比對結果將其歸類為MIKC*型基因.

3. 2 山茱萸目植物MADS-box 基因家族比較分析

為了進一步分析珙桐MADS-box 家族基因的進化，以及該基因家族在珙桐及其近緣物種中的變化. 使用了同樣方法分別在喜樹、藍果樹、山茱萸中鑒定出85、102、103 個MADS-box 家族基因并命名為CaMADS1-85、NsMADS1-102 和Cf?MADS1-103. 如亞家族基因數目統計結果所示，4個物種基因數目的主要差異來源于Ⅰ類MADS 基因的差異. 值得注意的是，珙桐的AGL2/SEP 亞家族和SQUA 亞家族的基因數目除了之前發現與擬南芥相比有顯著擴張之外，與它的近緣物種相比也存在明顯的擴張（圖2a）.

對4 個物種的MADS-box 基因家族進行同源性分析. 共鑒定出63 個orthogroups，其中有40 個在4 個近緣物種中共享，包含68 個DiMADS、72 個CaMADS、56 個CfMADS 和62 個NsMADS. 珙桐、喜樹、藍果樹、山茱萸各有24、4、18、38 個物種特異性基因（圖2b）. 說明MADS-box 基因家族在這四個近緣物種中可能具有不同的進化歷史，在功能上也可能存在差異.

根據所有MADS-box 同源基因構建的STAG物種樹顯示，在藍果樹科中喜樹與藍果樹的親緣關系比跟珙桐更近. 而屬于另一個科的物種山茱萸與其他3 個物種的親緣關系最遠（圖2c）. 這與此前Qi 等［37］和Li 等［38］利用葉綠體基因組構建的山茱萸目和藍果樹科的物種系統發育樹相符合，可以為珙桐的系統發育分類提供一份來自核基因的證據.

在DiMADSs 編碼的氨基酸序列中共鑒定了15個保守的 moti（f 圖 3a）. 其中 99個 DiMADSs氨基酸序列含有motif 1 或motif 8. 通過SMART［39］進行評估，motif 1 和motif 8 都與SRF 結構域高度相關. 結合這兩個motif 在序列上的位置和motif的Seqlogo（圖3b）進行推斷，motif 8 可能是MADS結構域的核心區域. 同樣根據SMART 評估，Motif2、4、5 與K-box 結構域高度相關，其中motif 2 為核心區域. 共有57 條MIKCC 型序列（57/59）包含K-box 結構域. 另外，MIKC*類中的motif 15 也與K-box 結構域相關，但是與motif 2 不同. 并且MIKC*類的SRF 結構域和K-box 結構域之間的插入區段明顯比MIKCC 類更長. 這兩點均符合二者的特征差異. 此外，部分進化支（或亞家族）還具有其特征性的保守基序. 綜上所述， SRF 結構域是MADS-box 基因家族中最保守的結構域，而K-box是Ⅱ型基因的保守結構域. 序列C 端的保守性在總體上較低，但在其亞家族內也有一定程度的保守性.

除了DiMADS76 以外，DiMADSs 的編碼序列（CDS）長度范圍為327 bp 至2070 bp，編碼蛋白的氨基酸殘基數介于108 至698 之間，分子量介于12883. 13 至77751. 06 kDa 之間. 理論等電點（pI）介于4. 36 至10. 36 之間. 所有DiMADSs 均為親水性蛋白，無信號肽，多數為不穩定蛋白. 僅有3個DiMADS 蛋白含有1 到2 個跨膜結構.

DiMADS 基因的染色體定位如圖3c、3d 所示. 103 個基因中，有95 個基因定位于珙桐基因組組裝的21 條染色體上，8 個基因定位于未組裝到染色體的片段上. Chr2、Chr 5、Chr13、Chr21 分布了9 個及以上的MADS-box 基因，其余染色體上皆分布有1～6 個MADS-box 基因. MIKCC 類基因分布最為廣泛，除Chr15 和Chr18 外，每條染色體上均有MIKCC類基因的分布.

3. 4 珙桐MADS-box 基因家族進化分析

為了進一步研究發生在珙桐MADS-box 基因家族中的復制事件，對珙桐基因組進行了基因復制及種內共線性分析. 如表2 所示，基因被分為五類. 在珙桐103 個MADS-box 家族基因中，最多的是由全基因組或片段復制相關的基因. 珙桐MADS-box 基因家族中沒有基因被分類為單拷貝基因，這可能與MADS-box 基因家族的起源與擴張有關（表3）.

55 個珙桐MADS-box 家族基因關聯于48 個共線性塊中的66 個共線性基因對之中（圖４a），說明某些珙桐MADS-box 基因在進化過程中發生了多次的復制. 大多數共線性基因對中的DiMADSs屬于同一個亞家族，在一定程度上說明了亞家族基因結構域保守性的形成原因.

對DiMADSs 的進化壓力進行分析發現，僅MIKC* 亞家族的DiMADS71-DiMADS15 和Di?MADS71-Dinv44740. t1（ 非MADS）兩對基因的Ka/Ks 大于2，基因受正選擇，可能正在發生功能上的分化. 其余基因對之間的Ka/Ks 均小于1，且大多數基因對的Ka/Ks 小于0. 5. 證明絕大多數珙桐MADS-box 基因受到純化選擇. 對比Ⅰ型M type基因和Ⅱ 型基因中的MIKC*和MIKCC 類MADSbox基因. M type 類基因和MIKC*類基因的Ka、Ks以及Ka/Ks 均無顯著性差異. MIKCC 類基因的Ka以及Ka/Ks 值顯著低于M type 基因和MIKC*類基因，說明MIKCC 類基因受到更為強烈的純化選擇（圖4b～4d）. 這應當與MIKCC 類基因在高等植物發育過程中的重要作用有著密切關聯.

3. 5 DiMADSs 在苞片發育過程中的表達模式

苞片是珙桐生殖發育過程中的一種特殊結構. 在生長初期，苞片呈綠色，形狀和顏色與同時期的葉片相似，二者主要根據著生位置區分. 隨著發育的進行，兩個器官的形態差異逐漸增大. 為了探究MADS-box 基因在苞片變化中的作用，本研究通過轉錄組測序檢測了這些基因在花期早、中、晚期的苞片和葉片中的表達模式. 根據聚類結果可以將DiMADSs 的表達譜分為6 類. 類別Ⅰ和Ⅵ包括2 個AGL2/SEP 亞家族基因、4 個SQUA 亞家族基因和1 個Mβ 亞家族基因，這些基因主要在苞片中表達，在葉片中低表達或不表達. Ⅲ類基因在葉片發育的不同階段都有較高水平的表達，但在苞片發育過程中受到抑制. 在Ⅲ類的8 個基因中，有6 個是擬南芥SVP 的同源基因，SVP 在擬南芥中具有抵抗營養生長向生殖生長轉變的功能. 另外2 個為擬南芥TM3 類基因AGL42、AGL71 和AGL72 的同源基因，這些基因在擬南芥中與開花整合因子密切相關，參與花轉化（圖5a）.

對不同發育時期的苞片進行比較，在B-1vs.B-2、B-2vs. B-3 以及 B-1vs. B-3 中分別鑒定出8 個、5 個以及7 個差異表達的DiMADSs. 這一結果暗示了不同的DiMADS 基因可能在苞片發育的特定階段發揮著重要的調控功能. 進一步對各發育階段的苞片和葉片的差異表達基因進行分析.在B-1vs. L-1、B-2vs. L-2 和B-3vs. L-3 中分別鑒定出19 個、22 個和14 個差異表達的DiMADS. 似乎有更多的DiMADS 在發育的早期和中期決定苞片和葉片的差異. 10 個基因在3 個發育時期的苞片和葉片中均存在差異表達，其中屬于SQUA 亞家族的DiMADS5、DiMADS13、DiMADS75、Di?MADS83、DiMADS87 和DiMADS88 以及屬于AGL2/SEP 亞家族的DiMADS43 始終在苞片中高表達. 而屬于STMADS11 亞家族的Di?MADS19、DiMADS64、DiMADS78 始終在葉片中高表達.

3. 6 DiMADSs 基因表達模式的qRT-PCR 驗證

隨機選擇了11 個具有不同表達模式的Di?MADS 基因，以珙桐β-DiACTIN 基因作為內參基因，以L-1 葉片樣本為對照組計算了基因的相對表達量. 結果如圖6 所示，直方圖表示qRT-PCR 檢測的相對表達量，折線圖表示轉錄組定量中TPM數據. 二者之間雖然存在一定的差異，但是考慮到用于測序的cDNA 和用于qRT-PCR 的cDNA 可能存在批次效應帶來的差異，而且這些基因在苞片和葉片中的表達變化趨勢與轉錄組數據基本一致，表明基于轉錄組測序的定量結果是基本可靠的.

3. 7 DiMADS 轉錄因子的靶基因預測

在珙桐基因組中分別預測了201 個珙桐AP3-like 轉錄因子DiMADS31 的潛在靶標，1100 個珙桐AP1-like 轉錄因子DiMADS75 的潛在靶基因，182 個珙桐SEP-like 轉錄因子DiMADS43 的潛在靶基因，以及672 個SVP-like 轉錄因子DiMADS36的潛在靶基因. DiMADS31、DiMADS43 以及Di?MADS36 潛在靶基因沒有明顯的功能富集，但Di?MADS75 的潛在靶基因在光合作用以及細胞氧化還原穩態的生物學過程（BP）有所富集（圖7）. 并且與富集到的光合相關基因均有極強的負相關關系.

此外，一些DiMADS 基因也是這些轉錄因子的潛在靶基因. 另外，DiMADS36 在其自身的轉錄調控區域也存在結合位點. 這進一步說明了珙桐開花的基因調控相當復雜，這些調控基因之間可能形成相互的反饋網絡，在不同的發育階段控制著基因表達的平衡.

3. 8 潛在靶基因DiSTI 和DiMNS1 的表達模式

根據花器官建立的ABCDE 模型，花瓣的性狀由A、B 以及E 類基因共同控制. 并且根據花的四因子模型. AP3、PI 以及AP1、SEP 將形成轉錄因子四聚體結合兩個CArG box 介導DNA 環化并調控轉錄（AP3-PI 形成異源二聚體結合其中一個CArG box）. 在預測的靶基因中有兩個基因同時是DiMADS31、DiMADS75、DiMADS43 的潛在靶標，并且SEP3 和AP1 與AP3 在轉錄調控區有不同的結合位點，說明AP3-PI-AP1-SEP 轉錄因子四聚體有可能結合到這兩個基因的轉錄調控區域并調控其表達. 這兩個基因編碼的蛋白分別是STICHEL（STI）蛋白與Mannosyl-oligosaccharide1，2-alpha-mannosidase MNS1（ α-1，2-甘露糖苷酶1）的同源物，因此將它們分別命名為DiSTI 和DiMNS1. 以L-1 時期為對照組，利用qRT-PCR 檢測了這兩個基因在苞片及葉片中的相對表達量.結果表明，這兩個基因在苞片中的表達量顯著高于其在葉片中的表達量（ 圖8）. DiMADS31，Di?MADS75，DiMADS43 可能促進了這兩個基因在苞片中的表達.

4 討論

目前，MADS-box 基因家族在大量開花物種中的鑒定和克隆以及功能研究證明了其在植物生長發育及繁殖中的重要調控作用［14， 40， 41］. 目前關于被子植物開花調控的研究雖然已經有很多，但開花過程中的復雜基因調控網絡還沒有完全清晰，目前對花器官特征基因的功能描述也不足以解釋所有自然界中形態萬千的花. 珙桐作為第三紀古熱帶孑遺植物，尚有豐富的遺傳資源等待挖掘［42］. 其特殊的花器官結構及苞片結構表明珙桐是研究花器官身份決定的良好材料. 珙桐MADSbox基因家族進行鑒定并對其在苞片發育過程中的表達模式進行研究，將有助于加深對被子植物開花調控網絡的理解. 此外對珙桐遺傳資源的保護、開發和利用也具有重要的意義.

在本研究中，成功鑒定了103 個珙桐 MADSbox基因，并分析了這些基因及其編碼蛋白的特征. MADS-box 蛋白作為轉錄因子，通過與特定的順式作用元件結合來調控下游基因的表達. 對于結構域的功能，SRF-box（MADS 結構域） 決定了轉錄因子與DNA 序列的結合，而K-box 促進MADS-box 轉錄因子發揮功能所必需的二聚化［3］.二者的缺失可能導致基因功能的改變或喪失. 在本研究中發現FLC 亞家族中的DiMADS85 和Di?MADS86 缺失MADS 結構域，并且在不同時期的苞片和葉片中顯著表達. 研究表明，過表達截短的轉錄因子可能通過競爭性結合有功能的轉錄因子形成無功能的異二聚體而干擾正常功能［43］. FLC亞家族基因是控制開花時間的抑制因子，通過FT間接抑制下游花器官識別基因AP1 的表達［44］. 因此推測FLC-like 截短基因的表達可能是影響珙桐特殊花結構的潛在因素. 但其是否參與以及具體如何調控珙桐開花還有待進一步研究.

在基因組水平上比較了4 個物種的MADSbox基因家族. 除在物種間具有同源性的基因外，每個物種還存在多個物種特異性的MADS-box 基因. 這意味著MADS-box 基因家族在這四個近緣物種的進化過程中出現了分歧. 值得注意的是，珙桐的AGL2/SEP 和SQUA 亞家族的基因數目與擬南芥和近緣物種相比都有顯著的增加. 這兩個亞家族的成員在擬南芥和其他許多物種中都已被證明在植物開花調控中發揮著極其重要的作用.在擬南芥中，SQUA 亞家族包括4 個成員AP1、CAL、FUL 和AGL79，前三者在調控花分生組織決定中具有冗余的功能［45， 46］. 而AP1 更是調控萼片和花瓣發育所必需的基因［47］. 該亞家族的另一個同源基因AGL79 也被證明可以通過抑制TFL1的表達正向調控開花［48］. AGL2/SEP 亞家族的成員是花器官身份決定的E 類基因，在所有器官輪中發揮功能，其他花器官特征基因編碼的轉錄因子需要與SEP 蛋白結合形成高階蛋白質復合物才能正確激活下游開花基因的表達［7， 49］. 珙桐AGL2/SEP 亞家族和SQUA 亞家族的擴張，說明與模式種及其近緣物種相比，珙桐對花分生組織和花器官身份建立可能存在更為復雜的調控模式. 后續可以通過轉基因實驗來驗證這些復制產生的旁系同源基因的功能是否發生了亞功能化，是否具有功能冗余.

本研究通過轉錄組測序和qRT-PCR 驗證，發現AP3（B 類）、AP1（A 類）以及SEP（E 類）的同源基因在苞片中表現出較高的表達水平. P（I B類）的同源基因在苞片和葉片中持續表達. 而已有研究表明AP3、PI 與AP1 或SEP3 的異源表達可以將植物營養葉轉化為花瓣狀器官［6， 49， 50］. 據此推測，珙桐花瓣狀苞片的形成可能是由AP1-like、AP3-like 和SEP-like 的同源基因在苞片中的異位表達所導致.

進一步對這珙桐這三類轉錄因子的靶基因進行預測并篩選到兩個可能符合四因子模型［50］調控的基因DiSTI 和DiMNS1. 通過qRT-PCR 檢測發現它們在苞片中的表達顯著高于葉片，說明AP1-like、AP3-like 和SEP-like 的同源轉錄因子可能促進了它們在苞片中的表達. DiSTI 編碼的STICHEL 蛋白在擬南芥中被證明與毛狀體分支有關［51］，DiMNS1 編碼的α-1，2-甘露糖苷酶則是天冬酰胺（N）- 聚糖的生物合成中的一種關鍵酶，N-聚糖在植物開花、種子形成以及脅迫響應等方面發揮著重要的作用［52］. 而二者在珙桐苞片發育中的作用還有待進一步探索. 此外，通過靶基因的功能富集發現珙桐AP1-like 轉錄因子DiMADS75可能作為直接的抑制因子，參與調控部分光合作用相關基因的表達，抑制了苞片的光合功能. 同時參與了苞片與葉片發育細胞氧化還原穩態相關基因的表達調控.