二甲雙胍通過NLRP3炎癥小體通路對皮膚角質形成細胞增殖和凋亡的雙向調節研究

【摘要】 背景 扁平苔蘚是一種皮膚-黏膜慢性炎癥性疾病。因其病因不明，許多患者治療效果欠佳，嚴重影響生活質量，有必要深入研究扁平苔蘚的發病機制，為其藥物篩選提供新靶點。目的 探討二甲雙胍通過NLRP3炎癥小體通路對皮膚角質形成細胞增殖和凋亡的調控作用。方法 實驗時間為2020—2023年。體外實驗以人永生化角質形成細胞株HaCaT為研究對象，分為4組：對照組、脂多糖（LPS）組（5 μg/mL）、二甲雙胍組（Met組：10 mmol/L）、LPS與二甲雙胍聯合組（LPS+Met組：LPS 5 μg/mL刺激2 h后，再給予二甲雙胍10 mmol/L處理）。體內實驗以BALB/c小鼠為研究對象，利用咪喹莫特涂抹小鼠背部皮膚誘導了銀屑病樣皮炎模型，并制備了二甲雙胍乳膏進行治療，將小鼠隨機分為3組：對照組、咪喹莫特組（IMQ組）、咪喹莫特與二甲雙胍聯合組（IMQ+Met組），每組10只；對照組小鼠于背部涂抹凡士林，IMQ組小鼠于背部涂抹咪喹莫特軟膏，IMQ+Met組小鼠于背部涂抹IMQ軟膏12 h后再涂抹二甲雙胍乳膏；1次/d，連續7 d。采用細胞增殖試劑盒（CCK-8）和流式細胞術檢測二甲雙胍對HaCaT細胞增殖和凋亡的影響；采用Western Blotting、酶聯免疫吸附實驗（ELISA）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）活性實驗檢測二甲雙胍處理HaCaT細胞后NOD樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體通路的蛋白表達情況及活性水平；最后采用皮膚組織切片蘇木素-伊紅（HE）染色和免疫組化檢測二甲雙胍對咪喹莫特誘導銀屑病小鼠皮炎的抗炎效果。結果 CCK-8實驗結果顯示：LPS組、Met組、LPS+Met組HaCaT細胞48 h存活率均低于對照組，而LPS+Met組HaCaT細胞48 h存活率高于LPS組（Plt;0.05）。流式細胞術結果顯示：LPS組、Met組HaCaT細胞48 h G2/M期細胞、細胞凋亡比例均高于對照組，而LPS+Met組HaCaT細胞48 h G2/M期細胞、細胞凋亡比例低于LPS組（Plt;0.05）。Western Blotting結果顯示：LPS組、Met組HaCaT細胞NLRP3炎癥小體通路Caspase-1 p40、Caspase-1 p20、白介素（IL）-1β、IL-18蛋白表達均高于對照組，而LPS+Met組HaCaT細胞NLRP3炎癥小體通路Caspase-1 p40、Caspase-1 p20、IL-1β、IL-18蛋白表達低于LPS組（Plt;0.05）。ELISA實驗結果顯示：LPS組、Met組HaCaT細胞NLRP3炎癥小體通路IL-1β、IL-18水平、Caspase-1相對活性均高于對照組，而LPS+Met組HaCaT細胞NLRP3炎癥小體通路IL-1β、IL-18水平、Caspase-1相對活性低于LPS組（Plt;0.05）。皮膚組織切片HE染色顯示：IMQ+Met組小鼠二甲雙胍涂抹明顯改善了咪喹莫特對皮膚的損害。免疫組化結果顯示：IMQ+Met組小鼠則顯著降低了NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達。結論 二甲雙胍通過NLRP3炎癥小體通路雙向調節皮膚角質形成細胞的增殖和凋亡，并能夠改善咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠的皮膚損害，有望為二甲雙胍臨床上用于治療扁平苔蘚提供理論依據。

【關鍵詞】 二甲雙胍；NLRP3炎癥小體；HaCaT細胞；細胞增殖；細胞凋亡；扁平苔蘚；銀屑病；小鼠

【中圖分類號】 R 977.15 R 329.25 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2024.0042

Bidirectional Regulation of Keratinocyte Proliferation and Apoptosis by Metformin via NLRP3 Inflammasome Pathway

【Abstract】 Background Lichen planus is a chronic inflammatory disease of the skin and mucosa. Due to its unknown etiology，many patients have poor treatment effect，which seriously affects the quality of life. It is necessary to further study the pathogenesis of lichen planus to provide a new target for drug screening. Objective To investigate the effects of metformin on keratinocyte proliferation and apoptosis through NLRP3 inflammasome pathway. Methods Experiment period：2020 to 2023. In vitro experiment，human immortalized keratinocytes（HaCaT）were divided into 4 groups：control group，lipopolysaccharide group（LPS group：5 μg/mL），metformin group（Met group：10 mmol/L），LPS combined with metformin group（LPS+Met group：metformin was treated with 10 mmol/L after LPS 5 μg/mL stimulation for 2 hours）. In vivo experiments，BALB/c mice were used as research objects to induce psoriatic dermatitis model by applying imiquimod on the back skin，and metformin cream was prepared for treatment. The mice were randomly divided into 3 groups：control group，imiquimod group（IMQ group），and imiquimod plus metformin group（IMQ+Met group）. Each group has 10 mice. Mice in the control group were smeared with petroleum jelly on the back，mice in the IMQ group were smeared with imiquimod ointment on the back，mice in the IMQ+Met group were smeared with metformin cream after 12 h of IMQ ointment. Once a day for seven consecutive days. Cell counting kit-8（CCK-8） and flow cytometry were used to detect the effects of metformin on the proliferation and apoptosis of HaCaT cells. Western Blotting，enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）and Caspase-1 activity assay were used to detect the expression and activity of NOD-like receptor protein 3（NLRP3）inflammasome pathway protein in HaCaT cells treated with metformin. Finally，hematoxylin-eosin（HE）staining and immunohistochemistry were used to detect the anti-inflammatory effect of metformin on imiquimod-induced psoriatic dermatitis in mice. Results The results of CCK-8 experiment showed that the 48 h survival rate of HaCaT cells in LPS，Met and LPS+Met groups were lower than that in control group，while the 48 h survival rate of HaCaT cells in LPS+Met group was higher than that in LPS group（Plt;0.05）. Flow cytometry results indicated that the proportions of G2/M phase and apoptosis of HaCaT cells at 48 h in LPS and Met groups were higher than those in control group，while the proportion of G2/M phase and apoptosis of HaCaT cells at 48 h in LPS+Met group were lower than those in LPS group（Plt;0.05）. Western Blotting results demonstrated that the expression of Caspase-1 p40，Caspase-1 p20，interleukin（IL）-1β and IL-18 proteins in NLRP3 inflammasome pathway of HaCaT cells in LPS and Met groups were higher than those in control group. The expression of Caspase-1 p40，Caspase-1 p20，IL-1β and IL-18 of HaCaT cells in LPS+Met group were lower than those in LPS group（Plt;0.05）. ELISA results showed that the levels of IL-1β，IL-18 and relative activity of Caspase-1 in NLRP3 inflammasome pathway of HaCaT cells in LPS and Met groups were higher than those in control group. The levels of IL-1β，IL-18 and relative activity of Caspase-1 of HaCaT cells in LPS+Met group were lower than those in LPS group（Plt;0.05）. Metformin application in IMQ+Met group significantly improved the imiquimod skin damage observed by HE staining. Immunohistochemical results reported that the expressions of NLRP3，Caspase-1，IL-1β and IL-18 were significantly decreased in IMQ+Met group. Conclusion Metformin bidirectional regulates the proliferation and apoptosis of skin keratinocytes through the NLRP3 inflammasome pathway，and can improve the skin damage induced by imiquimod in psoriasis mice，which is expected to provide a theoretical basis for the clinical use of metformin in the treatment of lichen planus.

【Key words】 Metformin；NLRP3 inflammasome；HaCaT cells；Cell proliferation；Cell apoptosis；Lichen planus；Psoriasis；Mice

扁平苔蘚（lichen planus，LP）主要表現為紫色、多角形、扁平的斑丘疹，伴瘙癢或無自覺癥狀，多發生于口腔黏膜和四肢、軀干皮膚，口腔LP患病率高于皮膚LP，還可累及外陰黏膜、掌跖部、指（趾）甲等特殊部位，可致糜爛性損害、甲床萎縮、翼狀胬肉等，部分病例有惡變傾向［1-4］。因其病因尚不完全清楚，現有的治療方法效果欠佳，嚴重影響了患者的生活質量［5］。

有研究表明角質形成細胞的凋亡、分泌的細胞因子及其與T細胞的相互作用等參與LP的發?。?］。近年來還發現LP患者易出現系統性紅斑狼瘡、白癜風、斑禿、心血管疾病等合并癥［7-9］。而且，LP患者中肥胖、血脂異常、糖尿病等合并癥更常見［10］。二甲雙胍是治療2型糖尿病的一線藥物，尤其適用于肥胖人群。近來研究發現二甲雙胍具有非常廣泛的藥理作用，能夠發揮抗腫瘤、抗雄激素、抗炎等效應［11］，在治療痤瘡、黑棘皮病、銀屑病等炎癥性皮膚病時表現出明顯的療效［12］。但是二甲雙胍能否用于治療LP，報道鮮見。本研究主要觀察了二甲雙胍對皮膚角質形成細胞的增殖和凋亡的調控作用，并探討其分子機制，為二甲雙胍臨床上用于治療LP提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 實驗時間

本研究具體實驗時間為2020—2023年。

1.2 實驗對象

人永生化角質形成細胞株HaCaT購買自中國科學院細胞庫；8周齡BALB/c小鼠購買自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2019-0008。本研究已獲得河北工程大學醫學院生物醫學倫理委員會批準（BER-YXY-2021023）。

1.3 實驗材料

主要試劑：脂多糖（LPS）和二甲雙胍購買自Sigma公司，IMQ乳膏（麗科杰）購買自湖北科益藥業股份有限公司，細胞增殖試劑盒（CCK-8法）購買自MCE公司，酶聯免疫吸附實驗（ELISA）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）活性檢測試劑盒購買自MSK生物公司，流式凋亡檢測試劑盒購買自BD公司，NOD樣受體蛋白3（NLRP3）、Caspase-1、白介素（IL）-1β、IL-18和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗購買自Proteintech公司。

主要儀器：多功能酶標儀（Bio-Rad），流式細胞儀（BD FACSLyric），光學顯微鏡（奧林巴斯），Western Blotting成像系統（Odyssey? XF），石蠟切片機（Leica）。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養與分組：人永生化角質形成細胞株HaCaT培養條件為改良Eagle's高糖培養基（DMEM）添加10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素，37 ℃，5%CO2。細胞融合度達80%時，進行傳代，調整細胞濃度接種至6孔板或96孔板，按要求進行后續實驗。細胞隨機分為4組，依次為對照組、LPS組（5 μg/mL）、二甲雙胍組（Met組：10 mmol/L）、LPS與二甲雙胍聯合組（LPS+Met組：LPS 5 μg/mL刺激2 h后，再給予二甲雙胍10 mmol/L處理）。每組3復孔，重復3次實驗。

1.4.2 CCK-8法檢測細胞活性：細胞以1×104個/孔接種于96孔板，按實驗要求給予不同刺激處理，每種處理設5個復孔，培養至24 h、48 h、72 h后，加入CCK-8試劑10 μL/孔，再培養1 h后，酶標儀測定450 nm波長的吸光度（OD）值。細胞存活率（%）=（實驗組平均OD值-空白組平均OD值）/（對照組平均OD值-空白組平均OD值）×100%。實驗重復3次。

1.4.3 Western Blotting：利用蛋白裂解液（RIPA）提取不同處理組HaCaT細胞中的總蛋白，蛋白定量試劑盒（BCA法）進行蛋白定量，40 μg上樣電泳，轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜。洗滌緩沖液（TBST）漂洗3次，5 min/次。二抗室溫孵育1 h，發光試劑盒（ECL法）顯影定影，GAPDH作內參。

1.4.4 ELISA：HaCaT細胞以3×106個/mL接種于6孔板，分別加入磷酸緩沖液（PBS）、LPS、Met、LPS+Met聯合處理，48 h后，收集培養基上清液，2 000 轉/min離心10 min，留取上清液，按照試劑盒說明書操作，檢測細胞培養基上清液中IL-1β和IL-18的濃度。每種處理設3復孔，實驗重復3次。

1.4.5 流式細胞術分析細胞周期和凋亡：HaCaT細胞以3×106個/ml接種于6孔板過夜培養后，分別加入PBS、LPS、LPS、Met、LPS+Met聯合處理，48 h后收集細胞，PBS漂洗3遍，直接碘化丙啶（PI）染色，或加入Annexin V-FITC避光室溫孵育15 min后，再進行流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率，或處于G0/G1、S、G2/M期的細胞比例。每種處理設3復孔，重復3次。

1.4.6 二甲雙胍乳膏的制備：油相為液體石蠟10 g，十八醇、硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、對羥基苯甲酸乙酯各5 g，加熱至75 ℃～80 ℃混勻備用；水相為甘油10 g，脂肪醇聚氧乙烯醚1.5 g，吐溫1 g，加入少量蒸餾水，加熱至75 ℃～80 ℃混勻備用；加入0.6 g二甲雙胍至水相中充分溶解，將水相緩慢加入油相中，攪拌混勻，加蒸餾水填充至100 g，最后將乳膏冷卻至室溫，備用［13］。

1.4.7 咪喹莫特誘導小鼠銀屑病樣皮炎模型的建立：由于缺乏LP動物模型，為了觀察二甲雙胍在整體水平對皮膚炎癥性疾病的影響，本研究利用咪喹莫特涂抹小鼠背部皮膚誘導了銀屑病樣皮炎模型，并制備了二甲雙胍乳膏進行治療。將BALB/c小鼠隨機分為3組：對照組，咪喹莫特組（IMQ組），咪喹莫特與二甲雙胍聯合組（IMQ+Met組），每組10只。對照組小鼠于背部涂抹凡士林，IMQ組小鼠于背部涂抹咪喹莫特軟膏，IMQ+Met組小鼠于背部涂抹IMQ軟膏12 h后再涂抹二甲雙胍乳膏。涂抹面積2 cm×2 cm，1次/d，連續7 d。

1.4.8 石蠟切片與蘇木素-伊紅（HE）染色：咪喹莫特誘導小鼠銀屑病樣皮炎8 d后處死小鼠，取背部皮膚固定于4%多聚甲醛中48 h，脫水、包埋、切片、水化、HE染色、脫水透明、中性樹膠封片。

1.5 統計學分析

采用SPSS 26.0統計學軟件進行數據分析。本研究計量資料符合正態分布，以（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 二甲雙胍對HaCaT細胞增殖和凋亡的影響

2.1.1 CCK-8實驗結果顯示：不同濃度的二甲雙胍（1、2、5、10、20 mmol/L）對HaCaT細胞均有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越明顯，藥物濃度與處理時間有交互作用，各濃度細胞存活率隨時間變化呈下降趨勢（圖1）。在后續實驗中，選擇對HaCaT細胞增殖抑制明顯且毒性相對較小的10 mmol/L二甲雙胍處理48 h作為觀察點進行實驗。4組HaCaT細胞48 h存活率比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）；其中LPS組、Met組、LPS+Met組HaCaT細胞48 h存活率均低于對照組，而LPS+Met組HaCaT細胞48 h存活率高于LPS組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1。

2.1.2 流式細胞術結果顯示：4組HaCaT細胞48 h G2/M期細胞比例比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）；其中LPS組、Met組HaCaT細胞48 h G2/M期細胞比例均高于對照組，而LPS+Met組HaCaT細胞48 h G2/M期細胞比例低于LPS組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2、圖2A。4組HaCaT細胞48 h細胞凋亡比例比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）；其中LPS組、Met組HaCaT細胞48 h細胞凋亡比例均高于對照組，而LPS+Met組HaCaT細胞48 h細胞凋亡比例低于LPS組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2、圖2B。

2.2 二甲雙胍對HaCaT細胞NLRP3炎癥小體通路的影響

2.2.1 Western Blotting結果顯示：4組HaCaT細胞NLRP3蛋白表達比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）；4組HaCaT細NLRP3炎癥小體通路Caspase-1活性亞基p40和p20、IL-1β、IL-18蛋白表達比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）。其中LPS組、Met組HaCaT細胞NLRP3炎癥小體通路Caspase-1 p40、Caspase-1 p20、IL-1β、IL-18蛋白表達均高于對照組，而LPS+Met組HaCaT細胞NLRP3炎癥小體通路Caspase-1 p40、Caspase-1 p20、IL-1β、IL-18蛋白表達低于LPS組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表3、圖3。

2.2.2 ELISA實驗結果顯示：4組HaCaT細胞NLRP3炎癥小體通路IL-1β、IL-18水平、Caspase-1相對活性比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）。其中LPS組、Met組HaCaT細胞NLRP3炎癥小體通路IL-1β、IL-18水平、Caspase-1相對活性均高于對照組，而LPS+Met組HaCaT細胞NLRP3炎癥小體通路IL-1β、IL-18水平、Caspase-1相對活性低于LPS組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表4。

2.3 二甲雙胍對咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮炎的治療作用

2.3.1 小鼠皮膚外觀表現：3組BALB/c小鼠經相應藥物處理7 d后，IMQ組小鼠背部涂抹區出現輕微鱗屑和部分紅斑（圖4B），而IMQ+Met組小鼠涂抹二甲雙胍后可以改善皮損的嚴重程度（圖4C）。

2.3.2 皮膚組織切片HE染色顯示：IMQ組表皮明顯增厚，伴角化不全或角化過度，棘突延長（圖5B），基底層細胞增厚（圖5E），炎性充血明顯（圖5H）；而IMQ+Met組小鼠二甲雙胍涂抹則明顯改善了咪喹莫特對皮膚的損害（圖5C、5F、5I）。

2.3.3 免疫組化結果顯示：IMQ組小鼠皮膚中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18呈陽性表達，而IMQ+Met組小鼠則顯著降低了NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達，見圖6。

3 討論

二甲雙胍是國內外內分泌指南推薦的治療2型糖尿病的一線藥物，通過促進外周組織對葡萄糖的攝取和利用，發揮降血糖作用。除了降低血糖，二甲雙胍還能夠抑制核因子κB（NF-κB）通路而對腫瘤的轉移和侵襲發揮抑制作用［14］；能夠抑制氧化應激和炎癥而延緩細胞老化進程［15］；而且，來自細胞、動物模型和臨床試驗的證據表明，二甲雙胍具有抗炎特性，在很多炎癥驅動的疾病治療中表現出治療潛力［16］，也被嘗試用于治療多種炎癥性皮膚?。?2，17］。但是二甲雙胍在治療皮膚慢性炎癥性疾病LP中的應用報道較少，且曾有案例報道二甲雙胍的應用誘發了類天皰瘡LP［18］。因此有必要深入研究二甲雙胍的抗炎效應能否用于治療LP。

LP的組織病理主要表現為上皮角化過度或不全、棘層增厚、基底細胞液化變性等［4］。角質形成細胞功能異常在LP的發病中發揮著重要作用。角質形成細胞的凋亡、分泌的細胞因子及其與T淋巴細胞間的相互作用均參與了LP的發?。?，19］，是LP治療的重要靶點。有研究發現二甲雙胍通過抑制雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，以濃度和時間依賴的方式抑制人角質形成細胞HaCaT的細胞生長和增殖，誘導細胞凋亡，抑制細胞分泌IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細胞因子［20］。在紫外線B（UVB）誘導皮膚急性光損傷的細胞模型中，二甲雙胍能夠減輕UVB輻后HaCaT細胞產生的炎癥和細胞凋亡［13］。二甲雙胍還能通過抑制NLRP3炎癥小體通路降低炎癥因子的釋放，有望成為治療化膿性汗腺炎的選擇［21］。

LPS是細菌表面抗原物質，常被用于炎性損傷模型。由于缺乏LP動物模型，本研究利用LPS刺激HaCaT細胞構建炎性模型，模擬LP的炎癥病理。結果顯示LPS抑制HaCaT細胞增殖、促進凋亡、促進炎癥因子釋放。與LPS的效應相似，二甲雙胍處理HaCaT細胞后，抑制細胞增殖、促進凋亡、促進炎癥因子釋放，且該效應隨二甲雙胍濃度增大而增加。進一步探索潛在的分子機制發現，二甲雙胍激活了HaCaT細胞的NLRP3炎癥小體通路，提高了Caspase-1的活性以及炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌，即二甲雙胍處理HaCaT細胞，表現出了致炎作用。但是在以LPS刺激HaCaT細胞使其致炎后，再加以二甲雙胍處理，則可以抑制NLRP3炎癥小體通路，減少炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌，緩解炎癥對細胞增殖和凋亡的影響。也就是說，在體外細胞模型中，二甲雙胍可以通過激活或抑制NLRP3炎癥小體通路，對HaCaT細胞的增殖和凋亡發揮雙向調節作用。

有多篇文獻曾報道咪喹莫特涂抹可導致患者出現LP［22-23］，且LP和銀屑病存在一個共同的病理變化，即角質形成細胞異常增殖，所以本研究采用了咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮炎模型來替代LP模型，從動物整體水平上觀察二甲雙胍對皮膚炎癥的緩解作用。結果顯示，二甲雙胍能夠改善咪喹莫特誘導的小鼠皮膚損害，減輕炎癥反應，即在體內動物模型中，二甲雙胍能發揮抗炎效應，與已有的研究結果相似［24］，二甲雙胍的抗炎作用使其具有治療皮膚炎癥性疾病的潛力。

4 小結

綜上所述，本研究證明二甲雙胍可激活或抑制NLRP3炎癥小體通路，雙向調節HaCaT細胞的增殖和凋亡，對于已致炎的HaCaT細胞，二甲雙胍通過抑制NLRP3炎癥小體活性，可緩解炎癥對其增殖和凋亡的影響。本研究豐富了二甲雙胍發揮抗炎作用的分子靶點和信號通路，加深了對二甲雙胍發揮有益生物學效應的分子機制的理解，為開發基于分子機制的治療LP的藥物提供了理論基礎，臨床上或可利用這一特性，將二甲雙胍應用于治療LP等皮膚炎癥性疾病。當然，由于缺乏理想的動物模型，本研究也存在局限性，咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮炎模型并不能充分模擬LP皮炎模型，未來將在臨床患者中觀察二甲雙胍對LP的療效，以彌補研究不足之處。

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