AM 真菌?小麥共生體系對不同氮源的吸收轉運效率及對磷水平的響應

摘要： 【目的】研究隨著時間的變化以及不同磷（P） 濃度下，氮（N） 素在叢枝菌根（AM） 真菌根外菌絲中的轉運對小麥生長狀況的影響?！痉椒ā吭囼炘谌以耘嗪兄袠嫿ˋM 真菌?小麥共生根系系統。在小麥生長約60 天后，進行7 天饑餓處理，然后在菌絲室分別施加30 mL 4 mmol/L 硝酸鉀、硫酸銨、谷氨酰胺、精氨酸、尿素溶液，以純水為對照（CK）。在供氮后第3、5、7 天收獲小麥植株，分析菌根和根外菌絲中精氨酸含量、葉片中游離氨基酸和葉綠素含量。同樣饑餓處理小麥?菌根共生體系，在菌絲室分別加入磷水平0、35、700 μmol/L 的溶液，每個磷水平下分別施加4 mmol/L 15N 標記的硝酸鉀、硫酸銨、尿素，以加純水為對照，氮源和不同磷水平每7 天各加10 mL，42 天后收樣，測定菌根中15N 豐度、葉片中關鍵酶活性及植株氮、磷含量。【結果】1） 隨著供氮培養時間的增加，各處理根外菌絲中精氨酸含量不斷下降，在第7 天降至最低。相較于CK，各氮源處理在培養第3 天顯著增加了根外菌絲中精氨酸含量，尤以硝酸鉀和精氨酸處理的含量最高。相較于CK，除精氨酸組外，各氮源處理在不同培養天數均顯著提高了小麥葉片游離氨基酸含量，以施加硝酸鉀處理第5 天的游離氨基酸含量最高（1.26 mg/g）。小麥葉片葉綠素含量也隨供氮時間的延長整體呈上升趨勢。2） 供磷水平與氮素形態均顯著影響菌根中15N 豐度，硝酸鉀處理配合P 700 μmol/L 處理菌根中的15N 豐度最高，而硫酸銨則在P 35 μmol/L處理下最高。除尿素處理配合P 700 μmol/L 外，氮源的施加顯著提高了小麥葉片中硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性，施加不同氮源后，小麥葉片硝酸還原酶活性隨著磷水平的升高而有所降低。在各磷水平下，各氮源處理下植株地上部、地下部氮、磷含量較不施氮處理均有不同程度的提高?！窘Y論】AM 真菌根外菌絲吸收轉運硝態氮和銨態氮的效率高于有機態氮，吸收的氮素以精氨酸的形式轉移到根內菌絲，進一步運轉到菌根中供小麥生長所需，整個運轉過程約為7 天。高磷水平有利于AM 真菌對硝態氮的吸收轉運，而低磷水平有利于對銨態氮的吸收轉運。

關鍵詞： AM 真菌；小麥；15N 同位素示蹤；氮、磷轉運

叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM） 真菌可以與地球上大多數植物的根形成共生關系[1]，AM 真菌吸收氮（N）、磷（P） 等元素并轉運到宿主植物體內[2]。Jin 等[3]和Govindarajulu 等[4]證明當AM 真菌根外菌絲（extraradical mycelium，ERM） 吸收NO3?或NH4+后，往往通過硝酸還原酶（NR） 以及谷氨酰氨合成酶/谷氨酸合成酶（GS/GOGAT） 途徑轉化為精氨酸（Arg），再轉運到根內菌絲（intraradical mycelium，IRM），Arg 通過尿素循環分解為NH4+供植物吸收和利用。而宿主植物給AM 真菌提供碳源以供AM 真菌的生長。小麥（Triticum aestivum L.） 是世界三大糧食作物之一，我國有35% 的人口以小麥為主食[ 5 ]。小麥也是菌根作物，其根系能夠被AM 真菌侵染[6]，接種AM 真菌可以促進小麥生長，提高小麥籽粒產量。如馬放等[7]通過人工施加AM 真菌菌劑后，發現小麥侵染率提高了24.54%，小麥地上部生物量提高了24.05%。Li 等[8]在接種AM 真菌的同時聯合施用48.76 mg/kg 磷肥，不僅獲得小麥高產，還充分發揮了小麥吸收硒的生物學潛力。

氮（N） 是植物中最重要的礦物質營養元素之一，是核苷酸、氨基酸和蛋白質的重要組成成分[9]，小麥高產嚴重依賴氮肥[10]。長期以來，人們一直認為AM真菌共生在植物養分積累中只起著次要作用。但Govindarajulu 等[4]在離體培養試驗中發現根系蛋白氨基酸中的氮至少有1/3 來自AM 真菌。M?der 等[11]發現，通過菌根途徑吸收轉運給寄主番茄的氮素可達植物體總氮吸收量的42%。Tanaka 等[12]報道菌根化玉米地上部氮吸收量的74% 來自于與其共生的AM真菌ERM。然而，Johansen 等[13]研究發現AM 真菌菌絲體吸收轉運給黃瓜的氮素僅占植物總吸收氮量的0.6%～10%。這些差異可能是由于宿主植物的不同等因素造成的。植物對氮的形態也有偏好，一些植物偏向吸收銨態氮，如茶樹、水稻等[14]，對大部分旱生植物來說則更喜歡硝態氮，如玉米，蔬菜等[15]。所以不同形態氮源的添加可能會影響AM 真菌對氮素的吸收。

磷（P） 是核酸、膜磷脂、還原型輔酶II （NADPH）和ATP 的重要組成部分，在植物的光合、呼吸、蒸騰作用和生長中起著重要作用，往往限制植物的生長和產量[16]，土壤中的磷分為有機磷和無機磷，然而磷的流動性較差，難以被植物根系直接吸收利用。中國耕地的土壤磷平均盈余每年達到51.4 kg/hm2，遠高于全球平均水平，真正被田間作物吸收利用的磷只占施肥的10%～15%[17?18]。AM 真菌能夠通過擴大土壤中磷的吸收范圍，將從土壤中吸收的多聚磷酸鹽通過多聚磷酸酶轉化為植物可利用的正磷酸鹽[19]。同時有研究表明，當磷濃度一定時，菌根植物對磷的吸收速率是非菌根植物的6 倍[20]。Qin 等[21]通過32P 示蹤技術，在不同磷濃度下接種AM 真菌后發現相較于低磷，高磷條件顯著降低了AM 真菌對小麥根部的侵染和小麥莖部的磷含量，表明充足的磷供應會降低AM 真菌對宿主植物的侵染，故而影響AM 真菌吸收的磷素對宿主磷的貢獻率。

無機氮形態，通常指硝酸鹽和銨鹽，在植物對氮的吸收中占主導地位，因此，有關AM 菌根化小麥對其他形式氮的吸收轉運研究較少，也缺乏不同磷供應水平、不同形態氮下，ERM 對小麥共生體氮素營養吸收的研究。因此本研究對以下兩個問題進行探究：1） 隨著時間的變化，不同氮素形態在AM真菌ERM 中的轉運以及對小麥生長狀況的影響；2） 在不同磷水平下施加不同形態氮素時，ERM 對氮的轉運量以及轉運的氮、磷對小麥生長狀況的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

寄主植物為小麥，品種為石4366，購自金華市種子公司；供試AM 真菌為異形根孢囊霉（Rhizophagusirregularis），由本課題組培養（本試驗接種物為含有Ri T-DNA 轉基因胡蘿卜根、真菌孢子、菌絲的AM真菌菌劑）。

培養容器為三室培養盒，盒體通過兩層0.0385mm 的尼龍過濾布被分隔成三室（菌根室、隔離室和菌絲室）。為了避免營養元素的流動，設計菌根室高于菌絲室。三室在0.1% 的高錳酸鉀溶液中浸泡消毒50～60 min 后晾干待用。供試基質材料為清洗后的河沙與草木灰，二者均經121℃、0.1 MPa 高溫蒸汽滅菌120 min。菌根室基質為河沙與草木灰按19∶1（v/v） 均勻混合，以保證前期生長的基本營養。隔離室和菌絲室基質為河沙。

1.2 試驗設計

選取大小相近、籽粒完整且飽滿的小麥種子，用流水沖洗后浸泡在70% 的無水乙醇溶液中消毒3 min，立即用蒸餾水沖洗。將小麥種子放入鋪有滅菌濾紙的玻璃培養皿，置于25℃ 生化培養箱暗條件培養并保持濕潤。待種子發芽后將種子播入培養基質均一的育苗盤，成長到兩葉一心期后，選取長勢一致的幼苗移栽至菌根室，每個三室培養盒種植4株。接種處理組在小麥根系分別接種2 mL 菌劑（約400 個孢子）。生長階段每隔7 天在菌根室添加30 mLHoagland 營養液，向菌絲室定期補水。待菌絲室基質在顯微鏡下可以看到許多蛛網狀結構的根外菌絲后（60 天），饑餓處理7 天（在菌絲室和菌根室只加水），之后進行兩組試驗處理。

1.2.1 不同氮供應試驗 在菌絲室分別施加硝酸鉀（KNO3）、硫酸銨[（NH4）2SO4]、尿素（Urea）、精氨酸（Arg）、谷氨酰胺（Gln），各形態氮素的濃度均為N 4mmol/L，添加量為30 mL，以加30 mL 純水為對照。在菌根室施加30 mL 不含氮、磷的Hoagland 營養液。于處理第3 天、第5 天和第7 天分別收獲1次，共計18 個處理，每個處理3 個重復。

1.2.2 不同磷濃度下15N 示蹤試驗 在菌絲室中分別添加P 水平為0、35、700 μmol/L 的KH2PO4 溶液，分別記作P0、P35、P700，每個磷濃度處理下，分別加入 4 mmol/L 15N 同位素標記的15N-KNO3、15N-（NH4）2SO4、15N-Urea，以加純水為對照。不同磷水平、各形態氮素、不含氮、磷的Hoagland 營養液每隔7 天各加10 mL，共計12 個處理組合，每個處理3 個重復，42 天后收樣。

1.3 測定方法

1.3.1 菌根和菌絲中精氨酸（Arg） 含量測定 取300 g 菌絲室河沙倒入燒杯，加入1000 mL 水，玻璃棒攪拌后立即使用孔徑分別為0.45 和0.0385 mm 的試驗篩進行疊篩，重復多次直至燒杯中水變清澈。將下層孔徑為0.0385 mm 的試驗篩網上的殘留物全部洗入10 mL 離心管中，加入60% 的蔗糖溶液，4000 r/min 離心10 min，去上清，用蒸餾水洗去菌絲上殘留的蔗糖后收集篩離的菌絲（ERM）。小麥收樣后將根部用自來水沖洗干凈，用濾紙吸去表面的水分即為菌根。將提取的ERM 和菌根使用真空冷凍干燥儀干燥（?50℃，8.0 Pa，48 h）。采用甲萘酚?雙乙酰胺法[22]測定Arg 含量。

1.3.2 植株總氮、磷含量測定 將小麥植株收獲后分為地上部和地下部，在超低溫冷凍干燥機內干燥（?50℃，8.0 Pa，48 h），分別采用凱氏定氮法[23]和鉬銻抗比色法[24]測定小麥植株地上部和地下部的氮、磷含量。

1.3.3 葉綠素含量測定 采用丙酮?乙醇法[25]測定小麥葉片葉綠素含量。

1.3.4 核磁共振（NMR） 分析同位素15N 豐度 參照孫穎盈等[26]的方法對菌根中15N 豐度進行測定。

1.3.5 游離氨基酸含量測定 將新鮮小麥葉片沖洗后用吸水紙擦拭干凈，剪碎、混勻，采用茚三酮溶液顯色法[27]測定小麥組織中游離氨基酸含量。

1.3.6 硝酸還原酶（NR） 和谷氨酰胺合成酶（GS） 的測定 參考陳薇等[28]的方法進行NR 活性測定；參考董召娣等[29]的方法進行GS 活性測定。

1.4 數據處理

數據處理、統計分析與圖表制作分別采用MicrosoftExcel 2021、SPSS 26.0、Origin 2021 軟件完成。采用Duncan 法進行數據比較，結果用平均值±標準差（SD） 表示。

2 結果與分析

2.1 不同形態氮素供給下ERM 和菌根Arg 含量的變化

圖1 為不同取樣時間ERM 和菌根中的Arg 含量。培養第3 天，各氮素處理組ERM 中Arg 的含量顯著高于對照，增幅為94.52%～360.24%，而在第5 天和第7 天，ERM 中的Arg 含量急劇降低，培養5 和7 天 的ERM 中Arg 含量較第3 天分別下降了13.79%～93.13% 和77.78%～97.89%，且大部分氮處理的Arg 含量與CK 處理無顯著差異。

隨培養時間的增加，菌根中Arg 含量在KNO3、Arg、Urea 處理下先增加后減少，在（NH4）2SO4 處理下呈下降趨勢，在Gln 處理下呈升高趨勢。培養至第3 天，菌根Arg 含量KNO3 組與對照無顯著差異，Gln、Arg 和Urea 處理組顯著降低，而（NH4）2SO4 處理組顯著增加。培養至第5 天時，Urea 處理組菌根Arg 含量與對照無顯著差異，而KNO3、（NH4）2SO4、Gln、Arg 處理組比對照顯著提高了16.83%～151.15%。培養至第7 天時，KNO3 處理與對照無顯著差異，（NH4）2SO4、Gln、Arg 和Urea 處理菌根Arg 含量比對照顯著提高了28.43%～133.98%。

2.2 AM 真菌氮素轉運對小麥葉片游離氨基酸和葉綠素含量的影響

由圖2 所示，隨著恢復供氮后培養時間的延長，不同氮源處理小麥葉片中的游離氨基酸含量3 個取樣時間均以KNO3、（NH4）2SO4 處理最高，且顯著高于其他處理；KNO3 處理的葉片游離氨基酸含量第5 天（1.26±0.06 mg/g） 也顯著高于（NH4）2SO4 處理；而Arg 處理的游離氨基酸含量在5 個氮源處理中最低，第7 天時甚至顯著低于對照。隨著培養時間的增加，葉綠素含量整體上呈上升的變化趨勢。在培養3 天時，僅有Gln 和Arg 處理葉綠素含量高于對照組，培養7 天時，各氮素處理葉綠素含量均高于對照組。其中，Gln 處理對葉綠素含量的積累最為顯著，在培養至7 天時葉綠素含量達到了（1.51±0.05） mg/g。

2.3 不同磷水平和氮素形態下菌根15N 豐度

由圖3 所示，磷水平與氮素形態對小麥菌根組織15N 豐度影響顯著。當施加KNO3 時，小麥菌根組織15N 豐度隨著磷水平的增加而增加，P 700 μmol/L處理顯著高于0 μmol/L 處理。當施加（NH4 ）2SO4時，菌根組織15N 豐度隨著磷水平的增加呈先升高后降低的趨勢，在P 35 μmol/L 處理最高，為9.84%，且高于其他所有處理組，在P 700 μmol/L 處理下最低，僅為4.09%，顯著低于其他所有處理組。當施加Urea 時，菌根組織15N 豐度隨著磷水平的增加先降低后升高，在P 0 和700 μmol/L 處理間無顯著差異；P 0 μmol/L條件下，（NH4）2SO4 和Urea 處理菌根組織15N 豐度顯著高于KNO3 處理。在P 35 μmol/L條件下，（NH4）2SO4處理菌根組織15N 豐度顯著高于KNO3 和Urea 處理。在P 700 μmol/L 條件下，KNO3和Urea 處理菌根組織15N 豐度顯著高于（NH4）2SO4 處理，但這兩處理間無顯著差異。

2.4 不同磷水平和氮素形態下葉片中NR 和GS活性的變化

由圖4 所示，各施氮處理組NR 活性均顯著高于不施氮處理。在不施氮 （CK） 時，磷水平對小麥NR 活性無顯著影響。施加氮源后，隨著磷水平的增加，各氮素處理下NR 活性隨著磷水平的升高呈降低趨勢；除磷水平為700 μmol/L、氮源為Urea 處理外，其余施氮處理GS 活性均顯著高于不施氮處理。隨著磷水平的增加，小麥GS 活性在（ N H 4 ） 2 S O 4和Urea 處理下降低，在不施氮和KNO3 處理下先升高后降低。施KNO3 時，磷水平在35 μmol/L 處理下小麥GS 活性最高，為2.26 A/（g·h），顯著高于其他處理組。

2.5 不同磷水平和氮素形態下小麥植株中氮、磷含量的變化

如圖5 所示，在不同磷水平下，相較于不施氮處理，各氮素處理均不同程度提高了小麥地上部、地下部的氮含量。對于地上部來說，在不施加氮素時，磷水平對小麥氮含量無顯著影響。施加KNO3和（NH4）2SO4 時，在P 0 μmol/L 處理下氮含量高于P35 和700 μmol/L 處理。施加Urea 時，在P 0 和35μmol/L 處理下氮含量無顯著差異，但均顯著高于P700 μmol/L 處理；對于地下部來說，在不施加氮素時，磷水平對小麥氮含量無顯著影響。在施加氮素時，氮含量隨著磷水平的提高呈先增加后減少的趨勢，在P 35 μmol/L 處理下氮含量達到最大。

在不同磷水平下，相較于不施氮處理，各氮素處理下植株地上部、地下部的磷含量均得到不同程度的提高。對于地上部來說，在不施加氮素時，供磷水平對小麥磷含量無顯著影響。施加KNO3 和Urea 時，磷含量隨著施磷水平的增加而增加。施加（NH4）2SO4時，P 0 和700 μmol/L 處理下磷含量均顯著高于P 35μmol/L 處理，分別增加了21.96%、31.44%；對于地下部來說，施加KNO3 時，P 700 μmol/L 處理磷含量最高，達（2.48±0.12） g/kg，高于其他所有處理組。施加（NH4）2SO4 時磷含量隨著施磷水平的增加而減少。施加尿素時，磷含量隨著施磷水平的增加先增加后減少，在P 35 μmol/L 處理下達到最大。

3 討論

3.1 隨時間變化氮素在AM 真菌ERM 中的轉運狀況以及對小麥生長狀況的影響

本試驗通過在菌絲室中一次性加入不同形態的氮源后發現，相較于對照，施加氮源顯著提高了ERM中Arg 含量，且隨著培養時間的增加，ERM 中的Arg 含量呈下降趨勢（圖1），說明ERM 吸收氮源后可以促進Arg 的合成，同時，Arg 逐漸被易位到IRM。在培養至第7 天時，幾乎全部被轉運到IRM，說明氮源被ERM 吸收后再轉運到IRM 大約需要7 天。而菌根中Arg 含量并沒有隨著培養時間的延長而增加，說明Arg 分子轉運到IRM 后迅速通過尿素循環途徑分解，最終以NH4+的形式供給寄主植物[4]；氨基酸在植物氮代謝和發育中起著重要作用[30]。Svietlova等[31]發現有益真菌能夠向氮饑餓的植物提供氮，恢復因缺氮而失衡的氨基酸穩態。本研究結果表明除施加Arg 外，施加其他形式的氮均顯著促進了小麥葉片中游離氨基酸含量的積累。其中，施加KNO3、（NH4）2SO4 后游離氨基酸含量均顯著高于其他氮源，說明在短時間內（7 天） AM 真菌對無機氮的吸收利用進而被菌根化小麥吸收利用效率大于對有機氮的吸收利用。

3.2 不同磷濃度下15N 在AM 真菌ERM 中的轉運狀況以及對小麥生長狀況的影響

雖然AM 真菌已被證明可以吸收氮和磷，并將其從土壤轉移到植物中，但磷水平與氮形態之間的相互影響較少報道。在本試驗采用同位素15N 示蹤技術的研究結果中，（NH4 ）2SO4 處理下小麥菌根組織15N 豐度在磷水平為 35 μmol/L 條件下最高，顯著高于除磷水平為700 μmol/L 硝態氮處理外的其他所有處理。而在磷水平為 700 μmol/L 條件顯著低于其他處理；KNO3 處理下小麥菌根組織15N 豐度隨供磷水平的增加而顯著增加，在磷水平700 μmol/L 達到最大值（圖3）。說明在小麥通過菌絲途徑吸收利用銨態氮的過程中，AM 真菌對周圍環境中磷含量的多少比較敏感，這與孫穎盈等[26]在AM 真菌?丹參共生體中的研究結果一致，可能是因為高水平的磷抑制了AM 真菌菌絲的形成和ERM 的延長，從而降低了對外源氮的吸收能力[ 3 2 ]。當供應的氮素為NO3?時，菌根共生會強烈誘導硝酸鹽轉運基因OsNPF4.5、ZmNPF4.5、SbNPF4.5 的表達，促進菌根對硝態氮的獲取[33]。本研究發現磷水平在700 μmol/L 條件下，KNO3 處理下菌根組織15N 豐度顯著高于（NH4）2SO4 處理，這可能是當磷濃度過高時，大部分NO3?則沿著禾本科植物特殊的AM 真菌氮吸收途徑傳遞給寄主植物，進一步減弱AM 真菌借助氮載體Arg 的氮轉運效應[34]，其有待進一步驗證。

氮代謝是植物中最重要和最基本的代謝活動之一。硝酸還原酶（NR） 和谷氨酰胺合成酶（GS） 對植物氮代謝發揮重要調節作用。GS 是氮代謝的中心酶，參與各種氮代謝的調節，可同化氮和參與谷氨酰胺的生物合成[35]。任開明等[36]研究指出，施加尿素可以使小麥GS、NR 活性分別提高7.65%～46.46%、0.48%～28.26%。本研究發現相較于純水對照，不同磷水平下，施加KNO3、（NH4）2SO4、尿素均顯著提高菌根化小麥NR、GS 活性，且在 P 0、35 μmol/L處理下，硝態氮對GS 活性的增幅顯著高于銨態氮，而磷水平為700 μmol/L 下，兩個氮形態處理之間無顯著差異（圖4），因而不同磷水平下施加KNO3、（NH4）2SO4、尿素均顯著提高了菌根化小麥地上部、地下部的氮、磷含量（圖5），證明AM 真菌吸收的氮素通過調控根系氮代謝關鍵酶基因和氮轉運基因的表達，增強根系的活性，從而提高對氮的吸收同化效率。

4 結論

AM 真菌根外菌絲可吸收不同形態的氮源，合成Arg 后轉移到根內菌絲，以供菌根化小麥生長所需。AM 真菌對硝態氮和銨態氮的吸收利用效率高于有機氮。磷供應水平影響著根外菌絲對不同形態氮的吸收利用，低磷條件下促進了AM 真菌對銨態氮的吸收，高磷抑制對銨態氮的吸收，但有利于硝態氮的吸收。不同磷水平下，AM 真菌對氮素吸收和轉運增強了小麥中氮代謝關鍵酶活性，增加了小麥中的氮、磷含量。