不同劑量LPS預處理對心肌缺血再灌注大鼠炎性因子的影響

摘要" 目的：觀察低劑量脂多糖（LPS）預處理對心肌缺血再灌注（MIR）大鼠心肌細胞炎性因子的影響。方法：將84只SD大鼠按照數字隨機表法分為假手術組、模型組、維拉帕米干預組、0.1 mg/kg LPS干預組、0.5 mg/kg LPS干預組、1.0 mg/kg LPS干預組。假手術組前4 h腹腔注射等體積生理鹽水，開胸處理但不進行MIR手術；模型組術前24 h腹腔注射等體積生理鹽水，行MIR手術；維拉帕米干預組術前24 h腹腔注射維拉帕米（2 mg/mL，0.8 mL/kg）；0.1 mg/kg LPS干預組（LPS 0.1 mg/kg）、0.5 mg/kg LPS干預組（LPS 0.5 mg/kg）、1.0 mg/kg LPS干預組（LPS 1.0 mg/kg）腹腔注射。注射完畢后，除假手術組外其余大鼠均構建MIR模型。分別于術前和術后檢測動物心電圖。術后72 h行心臟超聲檢測，觀察左室射血分數（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室收縮末期內徑（LVESD）、左室舒張末期內徑（LVEDD）、左室后壁收縮期厚度（LVPWs）、左室后壁舒張期厚度（LVPWd）、左室收縮末期容積（LVESV）、左室舒張末期容積（LVEDV）變化。采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色測量心肌梗死面積；使用Image J軟件分析梗死區和非梗死區并計算心肌梗死面積百分比。蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心肌組織病理變化。采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清炎性因子γ干擾素（IFN-γ）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量。結果：心臟超聲結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS減小，提示心臟功能受損（P＜0.05）；與模型組比較，維拉帕米干預組和LPS各干預組大鼠LVEF、LVFS增加，提示心功能得到改善（P＜0.05）。TTC染色結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌梗死面積增加（P＜0.05）；與模型組比較，LPS各干預組大鼠心肌梗死面積減小（P＜0.05），其中1.0 mg/kg LPS干預組心肌梗死面積顯著減少（P＜0.05）。HE染色結果顯示，假手術組心肌纖維排列整齊，心肌細胞形態規則，橫紋未見明確異常；模型組心肌纖維排列紊亂，斷裂嚴重，可見較多出血灶，心肌細胞水腫嚴重，部分溶解、壞死，可見較多核固縮，間質有較多炎細胞散在或灶狀浸潤；與模型組比較，0.1 mg/kg LPS干預組、0.5 mg/kg LPS干預組病變改善不明顯；1.0 mg/kg LPS干預組及維拉帕米干預組心肌纖維水腫、斷裂、壞死及炎細胞浸潤程度均稍減輕。與假手術組比較，模型組大鼠血清IFN-γ、IL-6、TNF-α含量增加（P＜0.05）；與模型組比較，LPS各干預組IL-6、TNF-α含量降低（P＜0.05）。結論：低劑量LPS預處理通過抑制炎癥反應可改善MIR誘導的大鼠心肌損傷，從而發揮心肌保護作用。

關鍵詞" 心肌缺血再灌注；心肌損傷；脂多糖；炎性因子；大鼠；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.02.007

Effects of LPS with Different Doses Pretreatment on Inflammatory Factors in Myocardial Ischemia?reperfusion Rats

Bannu · Kuken， XU Changsheng， XU Xia， YANG Mengzhi， YAN Jinlong

The Seventh Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830028， Xinjiang， China

Corresponding Author" YAN Jinlong， E-mail： 214289027@qq.com

Abstract Objective：To observe the effect of low dose lipopolysaccharide（LPS） pretreatment on inflammatory factors in myocardial ischemia-reperfusion（MIR） rats.Methods：Eighty-four SD rats were divided into sham operation group，model group，verapamil intervention group，0.1 mg/kg LPS intervention group，0.5 mg/kg LPS intervention group，and 1.0 mg/kg LPS intervention group according to numerical random table method.In the sham operation group，equal volume normal saline was injected intraperitoneally 4 hours before the operation，and thoracotomy was performed without MIR operation.The model group was injected with normal saline 24 h before operation and the MIR operation was performed.Verapamil intervention group was intraperitoneally injected with verapamil（2 mg/mL，0.8 mL/kg） at 24 h before surgery.The 0.1 mg/kg LPS intervention group（LPS 0.1 mg/kg），0.5 mg/kg LPS intervention group（LPS 0.5 mg/kg），and 1.0 mg/kg LPS intervention group（LPS 1.0 mg/kg） were intraperitoneally injected respectively.After injection，MIR models were established in all rats except the sham operation group.ECG was detected before and after operation.Echocardiography was performed at 72 h after surgery.Left ventricular ejection fraction（LVEF），left ventricular short axis shortening rate（LVFS），left ventricular end-systolic diameter（LVESD），left ventricular end-diastolic diameter（LVEDD），left ventricular posterior wall thickness-systolic（LVPWs），left ventricular posterior wall thickness-diastolic（LVPWd），left ventricular end-systolic volume（LVESV），and left ventricular end-diastolic volume（LVEDV） were observed.Myocardial infarction area was detected by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride（TTC） staining.Image J software was used to analyze percentage of myocardial infarction area.The pathological changes of myocardial tissue were detected by hematoxylin-eosin（HE） staining.Serum levels of inflammatory factor interferon γ（IFN-γ），interleukin-6（IL-6），and tumor necrosis factor-α（TNF-α） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：The results of cardiac ultrasound showed that compared with data in the sham operation group，LVEF and LVFS in the model group decreased，indicating that the heart function was impaired（P＜0.05）.Compared with model group，LVEF and LVFS in the verapamil intervention group and LPS intervention groups increased，indicating that cardiac function was improved（P＜0.05）.TTC staining showed that compared with sham operation group，myocardial infarction area of model group increased（P＜0.05）.Compared with the model group，the myocardial infarction area in the LPS intervention groups decreased（P＜0.05），and the myocardial infarction area of rats in the 1.0 mg/kg LPS intervention group decreased significantly（P＜0.05）.The results of HE staining showed that the myocardial fibers in the sham operation group arranged neatly，the morphology of myocardial cells was regular，and there was no clear abnormality in the transverse striae.In the model group，the myocardial fibers disordered and broken severely，with more bleeding foci，serious edema，partial dissolution and necrosis of cardiomyocytes，more nuclear contraction，and scattered or focal infiltration of inflammatory cells in the interstitium.Compared with the model group，0.1 mg/kg LPS intervention group and 0.5 mg/kg LPS intervention group showed without obvious improvement in lesions.The degree of myocardial fibrosis edema，rupture，necrosis，and inflammatory cell infiltration were reduced slightly in the 1.0 mg/kg LPS intervention group and verapamil intervention group.Compared with the sham operation group，the contents of serum IFN-γ，IL-6 and TNF-α in the model group increased（P＜0.05）.Compared with the model group，the contents of IL-6 and TNF-α in LPS intervention groups decreased（P＜0.05）.Conclusion：Low-dose LPS pretreatment could decrease MIR-induced myocardial injury in rats by inhibiting inflammatory response，thus playing some myocardial protective role.

Keywords" myocardial ischemia-reperfusion; myocardial injury; lipopolysaccharide; inflammatory factors; rats; experimental study

缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD）是由冠狀動脈循環改變致心肌缺血缺氧引起的心臟病，是導致急性心肌梗死、心絞痛及缺血性心力衰竭死亡和致殘的主要原因^［1］。再灌注治療可減小病人心肌梗死面積并改善臨床癥狀，是治療IHD的有效手段^［2］。然而，急性缺血心肌再灌注導致心肌細胞進一步損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI），臨床表現為缺血后心功能不全、心律失常、微血管阻塞及心肌壞死等^［3］。目前IRI的機制尚未明確，針對IRI暫無有效的治療方法，因此，分析IRI的發生機制，尋找治療及改善IRI的方法成為目前亟待解決的問題。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌的主要結構成分，也是感染反應的關鍵介質，通過核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路等炎癥途徑促進促炎細胞因子分泌，引起組織或器官內炎癥反應，進而加重組織損傷^［4-5］。有研究表明，低劑量LPS預處理可抑制心肌缺血再灌注（MIR）誘導的心肌損傷，減小心肌梗死面積，促進心功能的恢復^［6］，但具體作用機制尚未明確。基于此，本研究通過構建MIR大鼠模型，觀察不同劑量LPS預處理對MIR大鼠心肌損傷的改善效果，進而探究不同劑量LPS預處理對MIR損傷后炎性因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

84只雄性SD大鼠，購自杭州醫學院動物實驗中心［生產許可證號碼：SCXK（浙）2019-0002］，8～10周齡，體質量200～250 g。實驗于杭州醫學院實驗動物中心無特定病原體（SPF）級動物實驗室進行［SYXK（浙）2019-0011］，室溫（22±2）℃，相對濕度60%～80%，晝夜節律，自由進食、飲水。本研究經過醫院動物倫理委員會審核通過（編號：20241018-LW01）。

1.2 實驗試劑與儀器

LPS購自美國Sigma-Aldrich公司；大鼠γ干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒、大鼠白細胞介素-6（IL-6）酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒購自聯科生物科技公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）、蘇木精-伊紅（HE）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；鹽酸維拉帕米注射液購自上海禾豐制藥有限公司；舒泰50購自法國維克；鹽酸賽拉嗪注射液購自圣達動物藥品有限公司。小動物人工呼吸機購自北京眾實迪創科技發展有限責任公司（型號ZS-MV-HXB）；MadLab生物信息化醫學信號采集處理系統購自北京眾實迪創科技發展有限責任公司（型號Madlab4c-5H）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠MIR模型建立

大鼠腹腔麻醉，仰臥固定，大鼠皮下插針記錄Ⅱ導聯心電圖（ECG），先記錄穩定5 min的心電圖，之后進行MIR手術。行無創氣管插管，連接呼吸機，開胸，暴露心臟，分離并結扎左冠狀動脈前降支，于血管與結扎線之間穿硅膠管，缺血45 min后剪斷結扎線，取出硅膠管，再灌注2 h，結扎后觀察并記錄心電圖，以ST段明顯抬高、結扎線以下心肌顏色變蒼白、左心室內壓迅速下降視為造模成功。假手術組手術方法同模型組但不進行結扎。

假手術組（9只）前4 h腹腔注射等體積生理鹽水，開胸處理但不進行MIR手術；模型組（15只）術前24 h腹腔注射等體積生理鹽水，行MIR手術；維拉帕米干預組（15只）術前24 h腹腔注射維拉帕米（2 mg/mL，0.8 mL/kg）；0.1 mg/kg LPS干預組、0.5 mg/kg LPS干預組、1.0 mg/kg LPS干預組給予不同劑量LPS（0.1、0.5、1.0 mg/kg）腹腔注射，行MIR手術。

1.3.2 心臟超聲觀察

每組選3只大鼠，術后72 h進行心臟超聲檢查，檢測左室射血分數（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室收縮末期內徑（LVESD）、左室舒張末期內徑（LVEDD）、左室后壁收縮期厚度（LVPWs）、左室后壁舒張期厚度（LVPWd）、左室收縮末期容積（LVESV）、左室舒張末期容積（LVEDV）。

1.3.3 大鼠心臟TTC染色

處死動物后取各組大鼠心臟（10 min內），置于4 ℃的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶液浸泡，置于－20 ℃冰箱冷凍30 min；切取心臟切片，厚度約為2 mm，將心臟切片置入2%的TTC染料中37 ℃避光水浴30 min，每5 min輕微晃動容器，使充分染色。取出心臟切片用PBS溶液洗滌3～5 min，進行拍照，使用Image J軟件分析梗死區和非梗死區并計算心肌梗死面積百分比。梗死區呈白色，非梗死區呈紅色，計算心肌梗死面積比例（%）＝心肌梗死區/非梗死區×100%。

1.3.4 HE染色觀察心肌組織病理變化

將各組大鼠心肌組織浸入10%甲醛溶液固定過夜，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋后，制備成厚度4 μm的切片。將切片脫蠟至水，蘇木素染色3 min，1%鹽酸乙醇分化數秒，伊紅染色1 min，再經梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理形態學變化并收集圖像。

1.3.5 大鼠血清IL-6、TNF-α、INF-γ含量檢測

各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血4 mL，在4 ℃條件下，3 000 r/min離心10 min，取上清液單獨分裝，保存于－20 ℃。采用ELISA檢測各組大鼠血清INF-γ、IL-6、TNF-α含量，具體檢測方法及步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計學分析，符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析方法對多組數據分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。采用GraphPad Prism 5.0軟件輔助作圖。

2 結果

2.1 各組大鼠心電圖結果（見圖1～圖6）

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比較

與假手術組比較，模型組大鼠心肌梗死面積百分比顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，維拉帕米干預組及LPS各干預組大鼠心肌梗死面積百分比均減小（P＜0.05）。詳見表1。

2.3 各組大鼠心臟超聲結果比較

與假手術組比較，模型組大鼠LVPWs、LVEF和LVFS降低（P＜0.05）；與模型組比較，維拉帕米干預組、0.1 mg/kg LPS干預組和0.5 mg/kg LPS干預組大鼠LVEF和LVFS增加（P＜0.05），提示心功能得到改善。與維拉帕米干預組比較，1.0 mg/kg LPS干預組LVESV增加（P＜0.05），LVEF、LVFS降低（P＜0.05）；與0.1 mg/kg LPS干預組比較，1.0 mg/kg LPS干預組LVEF和LVFS降低（P＜0.05）；與0.5 mg/kg LPS干預組比較，1.0 mg/kg LPS干預組LVESV增加（P＜0.05），LVEF和LVFS降低（P＜0.05）。詳見表2。

2.4 各組大鼠心肌組織病理形態學變化

假手術組心肌纖維排列整齊，心肌細胞形態規則，橫紋肌未見明確異常；模型組心肌纖維排列紊亂，斷裂嚴重，可見較多出血灶，心肌細胞水腫嚴重，部分溶解、壞死，較多核固縮，間質有較多炎細胞散在或灶狀浸潤；與模型組比較，0.1 mg/kg LPS干預組、0.5 mg/kg LPS干預組病變改善不明顯；1.0 mg/kg LPS干預組及維拉帕米干預組心肌纖維水腫、斷裂、壞死及炎細胞浸潤程度均稍減輕。詳見圖7。

2.5 各組大鼠血清炎性因子含量比較

與假手術組比較，模型組IFN-γ、IL-6、TNF-α含量增加（P＜0.05）；與模型組比較，維拉帕米干預組、0.5 mg/kg LPS干預組、1.0 mg/kg LPS干預組IFN-γ、IL-6、TNF-α含量減少（P＜0.05），0.1 mg/kg LPS干預組IL-6、TNF-α炎性因子含量減少（P＜0.05）；與維拉帕米干預組比較，0.1 mg/kg LPS干預組IFN-γ、IL-6、TNF-α含量降低（P＜0.05），0.5 mg/kg LPS干預組IL-6、TNF-α含量降低（P＜0.05）；與0.1 mg/kg LPS干預組比較，0.5 mg/kg LPS干預組IL-6含量降低，1.0 mg/kg LPS干預組IFN-γ、IL-6、TNF-α含量減少（P＜0.05）。詳見表3。

3 討論

目前，冠心病的主要治療方法包括藥物、經皮冠狀動脈介入、冠狀動脈旁路移植術等，通過各種血運重建方法可及時有效恢復心肌血液灌注緩解缺血引起的心肌損傷和心肌壞死。心肌缺血后恢復血液灌注進一步導致心肌細胞損傷甚至壞死，這種現象稱為MIR損傷^［7］。目前，臨床尚無有效的治療方法避免MIR損傷，嚴重制約了冠心病的治療效果。結合以往的病例分析，術后立即開通罪犯血管后易發生缺血再灌注，且易發生IRI的血管多為右冠狀動脈^［8］，臨床常予以阿托品、多巴胺等藥物對癥治療，無法提前預防及保護。因此，研究MIR損傷病理生理機制并尋找有效的防治措施，對改善冠心病病人的預后具有重要意義。

發生MIR損傷時，活化的NF-κB誘導不同促炎細胞因子產生，包括IFN-γ、IL-6及TNF-α等炎性因子在心肌損傷中發揮著重要作用，可誘導心肌細胞凋亡，擴大炎癥反應，進一步損傷心肌組織^［7-9］。IFN-γ是二聚體糖蛋白，誘導一氧化氮產生，從而誘導炎癥反應^［10］。IL-6是一種關鍵的炎性細胞因子，不僅參與多種炎癥過程，還與細胞之間的相互作用密切相關^［11］。正常生理條件下，機體內TNF-α表達水平較低，當發生MIR損傷時釋放大量TNF-α，并誘導其他炎性因子如IL-1β合成^［12］。

本研究以不同低劑量LPS（0.1、0.5、1.0 mg/kg）對大鼠每日進行腹腔注射，連續注射7 d以誘導持續性炎癥反應，再建立MIR損傷模型，通過檢測心功能相關指標發現，0.1 mg/kg LPS預處理使大鼠LVPWs顯著增加，0.1、0.5、1.0 mg/kg LPS預處理使大鼠LVESD、LVESV減小，LVEF、LVFS增加，從而改善MIR損傷誘導的心功能障礙；經過對心肌組織進行形態病理學與心肌梗死面積檢測發現，1.0 mg/kg LPS預處理后MIR大鼠心肌纖維水腫、斷裂、壞死及炎細胞浸潤程度均明顯減輕，0.1、0.5、1.0 mg/kg LPS預處理MIR損傷大鼠心肌梗死面積百分比顯著減小。上述結果均說明，低劑量LPS預處理可改善大鼠MIR損傷癥狀，發揮心肌保護作用。卿羽等^［13］研究表明，連續7 d腹腔注射1.5 mg/（kg·d）LPS對小鼠進行預處理后再誘導MIR損傷模型，可顯著減小心肌梗死面積，且與升高的心肌組織蛋白質糖基化修飾水平有關。Chu等^［14］通過使用LPS預處理骨髓來源的間充質干細胞（MSCs）與未處理骨髓來源的MSCs治療MIR損傷小鼠后發現，LPS預處理的MSCs較未處理的MSCs有更好的心功能恢復效果，對小鼠的心臟保護作用更佳。本研究超聲結果可知，1.0 mg/kg LPS預處理使心臟功能下降。綜合分析超聲是術后72 h完成的，樣本抽血檢測是再灌注結束后2 h完成的，故急性心肌梗死早期心臟彩超不能提示心肌運動的減弱或心臟功能改變，后期可能出現心功能下降，因此認為，超聲對指導LPS劑量的控制發揮了關鍵作用。

綜上所述，LPS預處理通過抑制炎性因子對MIR大鼠發揮保護作用，改善心肌組織病理學損傷，減小心肌梗死面積。目前通過調控何種具體通路尚未明確，有待后續進一步深入研究。

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（本文編輯 薛妮）

基金項目 新疆維吾爾自治區自然科學基金面上項目（No.2021D01A173）

通訊作者 嚴金龍，E-mail：214289027@qq.com

引用信息 班努·庫肯，徐長生，徐霞，等.不同劑量LPS預處理對心肌缺血再灌注大鼠炎性因子的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2025，23（2）：208-214.