基于CREB/BDNF信號通路探討NA-1對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的保護作用

摘要" 目的：探討突觸后密度蛋白-95（PSD-95）抑制劑（NA-1）對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）海馬區環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（CREB）/腦源性神經營養因子（BDNF）信號通路的影響。方法：將7 d齡新生SD大鼠隨機分為正常對照組、HIBD組、NA-1組（腹腔注射10 μg/g NA-1溶液）和NA-1＋CREB抑制劑H89組（腹腔注射10 μg/g NA-1溶液＋2 μg/L H89溶液），每組15只。采用Rice法制備HIBD模型，評估大鼠神經行為變化；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色和尼氏染色觀察大鼠腦組織病理變化；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測大鼠海馬區PSD-95和CREB/BDNF信號通路表達情況。結果：與正常對照組比較，HIBD組大鼠趨地反射和懸崖逃避反射時間延長，前肢握力時間縮短，腦梗死體積、海馬區PSD-95蛋白表達增加，尼氏陽性細胞數、磷酸化CREB（p-CREB）/CREB、BDNF蛋白表達減少（P＜0.05）；與HIBD組比較，NA-1組趨地反射和懸崖逃避反射時間縮短，前肢握力時間延長，腦梗死體積、海馬區PSD-95蛋白表達減少，尼氏陽性細胞數、p-CREB/CREB、BDNF蛋白表達增加（P＜0.05）；添加H89可部分逆轉NA-1的作用。結論：NA-1可改善新生大鼠HIBD后的神經行為，減少腦梗死體積和神經元凋亡，可能與激活CREB/BDNF信號通路有關。

關鍵詞" 新生兒缺氧缺血性腦損傷；突觸后密度-95抑制劑；環磷酸腺苷反應元件結合蛋白/腦源性神經營養因子信號通路；神經元損傷；大鼠；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.02.009

Protective Effect of NA-1 on Hypoxic-ischemic Brain Damage in Neonatal Rats Based on CREB/BDNF Signaling Pathway

XIA Li， YIN Huaiqing， YIN Chongjuan， BAI Dan， SHI Rui

First Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， Shanxi， China， E-mail： xiali-xia925@163.com

Abstract Objective：To investigate the effect of postsynaptic densitin-95（PSD-95） inhibitor（NA-1） on cyclic adenosine phosphate response element binding protein（CREB）/brain-derived neurotrophic factor（BDNF） signaling pathway in hippocampus of neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage（HIBD）.Methods：Neonatal SD rats of 7 d-old were randomly divided into normal control group，HIBD group，NA-1 group（intraperitoneally injected with 10 μg/g NA-1 solution） and NA-1＋CREB inhibitor H89 group（intraperitoneally injected with 10 μg/g NA-1 solution＋2 μg/L H89 solution），with 15 rats in each group.HIBD model was established by Rice method to evaluate the neurobehavioral changes of rats.The 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride（TTC） staining and Nissl staining were used to observe the pathological changes of rat brain.The expression of PSD-95 and CREB/BDNF signaling pathway in the hippocampus of rats was detected by Western Blot.Results：Compared with the normal control group，the time of ground reflex and cliff escape reflex in the HIBD group was prolonged，the time of forelimb grip strength was shortened，the volume of cerebral infarction and the expression of PSD-95 protein in hippocampus increased，and the number of Nissl positive cells，phosphorylated CREB（p-CREB）/CREB and BDNF protein decreased（P＜0.05）.Compared with the HIBD group，the time of ground reflex and cliff escape reflex in the NA-1 group was shortened，the time of forelimb grip strength was prolonged，the volume of cerebral infarction and the expression of PSD-95 protein in hippocampus decreased，and the number of Nissl positive cells，p-CREB /CREB and BDNF protein were increased（P＜0.05），while adding H89 partially reversed the effect of NA-1.Conclusion：NA-1 could improve the neurobehavior of neonatal rats after HIBD，reduce the volume of cerebral infarction and neuronal apoptosis，which might be related to the activation of CREB/BDNF signaling pathway.

Keywords" neonatal hypoxic-ischemic brain damage; postsynaptic density-95 inhibitor; cyclic adenosine phosphate reaction element binding protein/brain-derived neurotrophic factor signaling pathway; neuron injury; rats; experimental study

圍生期窒息是導致新生兒缺氧缺血性腦損傷（HIBD）的重要因素，可導致新生兒遺留嚴重神經系統后遺癥。相關研究顯示，20%～50%窒息新生兒死于HIBD，給家庭及社會帶來沉重負擔^［1］。目前，尚無有效的干預措施用于HIBD的治療，還需探討新型手段改善新生兒HIBD預后^［2］。突觸后密度蛋白-95（PSD-95）是重要的支架蛋白，可促進N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體興奮^［3］。有研究顯示，NMDA受體興奮毒性是誘發HIBD的起始因子，通過影響細胞內鈣離子濃度，介導線粒體功能障礙，導致神經元壞死與凋亡^［4］。因此，抑制PSD-95表達或阻滯PSD-95與NMDA受體結合可能是HIBD潛在的干預途徑。PSD-95抑制劑（NA-1）是臨床關注度較高的PSD-95抑制劑，可特異性破壞PSD-95與NMDA受體的結合^［5］。據報道，NA-1可保護新生大鼠HIBD的神經損傷^［6］，具體作用機制尚未明確。環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（CREB）/腦源性神經營養因子（BDNF）信號通路在神經元保護、學習記憶等方面發揮重要的調控作用，相關研究顯示，激活CREB/BDNF信號通路可抑制海馬區神經元損傷^［7-8］。NA-1是否通過CREB/BDNF信號通路在HIBD中發揮作用尚未明確。本研究從CREB/BDNF信號通路分析NA-1對新生大鼠HIBD的保護性機制，以期為NA-1治療HIBD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器

清潔級，健康新生7 d齡SD大鼠60只，體質量13～18 g，雌雄不限，由山西醫科大學實驗動物中心提供。各大鼠由母鼠行母乳喂養，室溫20～25 ℃，相對濕度40%～60%，每12 h晝夜循環交替。本研究動物實驗經過山西醫科大學實驗動物中心同意（編號：DWYJ-2023-085）。

NA-1（美國MedChem Express公司），CREB抑制劑H89、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染液（美國Sigma公司），尼氏染色試劑盒（上海遠慕生物公司），RIPA裂解液（上海碧云天生物公司），CREB、磷酸化CREB（p-CREB）、BDNF、PSD-95、β-actin蛋白一抗（美國Abcam公司）。

ProOx-810L型動物實驗低壓氧艙缺氧箱（上海塔望智能科技公司），BX53型光學顯微鏡（日本奧斯巴林公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理

選將7 d齡新生SD大鼠隨機分為正常對照組、HIBD組、NA-1組和NA-1＋H89組，每組15只。除正常對照組外，其余組別采用Rice法制備HIBD模型，吸入異氟烷麻醉大鼠，取仰臥位并固定四肢，于頸正中切口、開胸，游離左側頸總動脈并用滅菌絲線結扎近心端和遠心端，縫合后放回原飼養環境；恢復2 h后再將大鼠置于有機玻璃缺氧艙，艙內底部鋪有鈉石灰，吸收濕氣和CO₂，氧濃度維持在8%左右，持續缺氧2 h。最后將大鼠放原飼養環境，觀察大鼠出現肌力下降、平衡失常、翻身困難或不能等行動障礙，表明HIBD模型構建成功^［9］。正常對照組僅分離左側頸總動脈，但不結扎、不缺氧處理。NA-1組造模后1 h腹腔注射10 μg/g NA-1溶液，NA-1＋H89組造模后1 h腹腔注射10 μg/g NA-1溶液＋2 μg/L H89溶液，正常對照組和HIBD組同時間腹腔注射等體積生理鹽水，每日注射1次，連續注射7 d。

1.2.2 神經行為評估

干預結束后，通過負趨地性試驗、懸崖回避試驗和前肢握力試驗評估大鼠神經行為。1）負趨地性試驗評估大鼠運動協調性和前庭敏感性，預先準備可變換角度的平面，將大鼠置于平面上，變換角度放松大鼠，待其適應后將平面設置為45°傾斜，記錄大鼠頭部及身體轉向作出90°?轉彎所用時間。2）懸崖回避試驗評估大鼠運動不良行為反應沖動，將兩塊木板并齊放置，第1塊木板標記大鼠頭和雙側上肢位置，將大鼠置于標記處，待其放松時迅速放下第1塊木板，使得大鼠雙側上肢懸空，記錄大鼠前掌放回第2塊木板的時間。3）前肢握力試驗評估大鼠執行力和易疲勞性，將直徑1.5 mm的金屬繩橫向固定在寬度50 cm的測試盒子上，測試盒高度15 cm，并鋪有軟木屑，讓大鼠雙側前掌握住金屬繩，記錄大鼠握住到放開金屬繩所用時間。

1.2.3 TTC染色觀察腦組織梗死面積

神經行為評估結束后，采用斷頸法處死大鼠，制作厚度1 mm石蠟組織切片，常規行TTC染色。應用Image J軟件測量梗死面積，計算總梗死體積在腦組織總體積中的占比。

1.2.4 尼氏染色檢測腦組織細胞凋亡

取厚度4 μm腦組織石蠟切片，行尼氏染色，滴加0.1%甲苯胺藍溶液染色后，光鏡下觀察尼氏小體形態變化，藍色染色為存活神經元。

1.2.5 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測海馬區PSD-95和CREB/BDNF信號通路表達

取大鼠海馬組織，添加RIPA裂解液提取總蛋白，預先配置十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將蛋白濃縮后分離，再電轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，取出載有蛋白的PVDF膜浸于5%脫脂牛奶中，室溫封閉2 h，分別添加CREB、磷酸化CREB（p-CREB）、BDNF、PSD-95、β-actin蛋白一抗（1∶1 000），4 ℃下搖床孵育過夜，之后加入蛋白二抗（1∶5 000），37 ℃下搖床孵育30 min，最后采用化學發光法顯影。應用Image J軟件分析圖像，以β-actin為內部對照，計算目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理

采用SPSS 24.0統計軟件進行數據分析。符合正態分布和方差齊性的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用最小顯著差異法（LSD）-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經行為比較

與正常對照組比較，HIBD組大鼠趨地反射和懸崖逃避反射時間延長，前肢握力時間縮短（P＜0.05）；與HIBD組比較，NA-1組趨地反射和懸崖逃避反射時間縮短，前肢握力時間延長（P＜0.05）；與NA-1組比較，NA-1＋H89組趨地反射和懸崖逃避反射時間延長，前肢握力時間縮短（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 NA-1對HIBD大鼠腦梗死體積的影響

正常對照組、HIBD組、NA-1組、NA-1＋H89組大鼠腦梗死體積占比分別為0、（36.55±5.77）%、（13.22±2.56）%、（24.58±3.29）%。與正常對照組比較，HIBD組腦梗死體積增加（P＜0.05）；與HIBD組比較，NA-1組腦梗死體積減小（P＜0.05）；與NA-1組比較，NA-1＋H89組腦梗死體積增加（P＜0.05）。TTC染色圖見圖1。

2.3 NA-1對HIBD大鼠神經元損傷的影響

正常對照組、HIBD組、NA-1組、NA-1＋H89組大鼠腦組織尼氏陽性細胞數分別為（124.35±10.77）個、（35.92±8.34）個、（81.73±9.61）個、（56.28±7.69）個。與正常對照組比較，HIBD組腦組織尼氏陽性細胞數減少（P＜0.05）；與HIBD組比較，NA-1組腦組織尼氏陽性細胞數增加（P＜0.05）；與NA-1組比較，NA-1＋H89組腦組織尼氏陽性細胞數減少（P＜0.05）。尼氏染色圖見圖2。

2.4 NA-1對HIBD大鼠海馬區PSD-95和CREB/BDNF信號通路表達的影響

與正常對照組比較，HIBD組海馬區PSD-95蛋白表達增加，p-CREB/CREB、BDNF蛋白表達減少（P＜0.05）；與HIBD組比較，NA-1組PSD-95蛋白表達減少，p-CREB/CREB、BDNF蛋白表達增加（P＜0.05）；與NA-1組比較，NA-1＋H89組PSD-95蛋白表達增加，p-CREB/CREB、BDNF蛋白表達減少（P＜0.05）。詳見圖3、表2。

3 討論

動物模型是臨床研究HIBD病理機制的常用方法，其中窒息和缺氧是重要的致病因素，Rice建模法結合上述因素，結扎頸總動脈導致一側大腦局部血供不足，再置于低氧環境中，造成結扎同側腦損傷^［10］。7 d齡新生大鼠腦組織結構與32～34周胎兒/新生兒類似，可較好地模擬HIBD病理生理過程。目前認為，腦缺氧缺血一定時間后可發展為谷氨酸興奮性毒性反應，產生氧化應激、炎癥反應等，導致長期性神經元死亡^［11］。NMDA受體在谷氨酸興奮性毒性反應中發揮重要作用，是導致HIBD的損傷機制之一。NMDA受體有雙重功能，除造成腦組織興奮性中毒外，還是中樞神經系統的調節遞質，可維持大腦正常功能^［12］。因此，阻斷NMDA受體功能的雙面性導致其無法用于HIBD的臨床治療。

隨著研究的深入，發現NMDA受體介導腦損傷依賴于PSD-95下游信號轉導實現。有研究顯示，應用PSD-95抑制劑NA-1可將NMDA受體從活性復合物上解離下來，中斷下游神經中毒信號，但不影響興奮性神經的傳遞過程^［13］。有關NA-1神經保護和改善神經行為方面的作用已得到證實，但其在HIBD中的作用機制尚未明確。本研究通過建立新生大鼠HIBD模型，從神經行為、組織學形態及蛋白水平對NA-1的作用機制進行探討，結果顯示，應用NA-1干預后HIBD大鼠趨地反射和懸崖逃避反射時間縮短，前肢握力時間延長，大鼠腦梗死體積減小，存活神經元增加，表明NA-1可改善HIBD模型神經元損傷，從而促進大鼠運動神經功能的恢復，與既往研究結果^［6］一致。

CREB/BDNF信號通路在神經元功能中發揮關鍵的調控作用，包括神經元生長、再生、突觸可塑性等過程^［14］。CREB磷酸化后被激活，促進下游與學習記憶能力相關的靶基因轉錄；其中BDNF處于CREB下游，可改善神經元病理狀態，維持神經元生存及正常生理功能^［15］。Jiang等^［16］研究顯示，激活CREB/BDNF信號通路可改善缺血性腦卒中小鼠的神經預后。Balakrishnan等^［17］研究表明，激活CREB/BDNF信號通路可減輕小鼠神經炎癥，消除記憶障礙。為進一步明確NA-1對CREB/BDNF信號通路的影響，本研究采用CREB抑制劑聯合干預，并檢測大鼠海馬區CREB/BDNF信號通路的表達，發現NA-1可抑制PSD-95表達，并上調p-CREB和BDNF表達，而添加后H89后CREB/BDNF信號通路受到抑制，并阻斷或減弱NA-1對HIBD神經保護作用。上述結果表明，NA-1減輕新生大鼠HIBD神經元損傷可能與激活CREB/BDNF信號通路有關。

綜上所述，NA-1可改善新生大鼠HIBD后神經行為，減少腦梗死體積和神經元凋亡，其機制可能與激活CREB/BDNF信號通路有關。課題組將進一步探索NA-1最佳效用劑量，為NA-1的臨床應用提供依據。

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（本文編輯 薛妮）

基金項目 山西省衛生健康委科研計劃項目（No.2022027）

引用信息 夏莉，陰懷清，陰崇娟，等.基于CREB/BDNF信號通路探討NA-1對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的保護作用［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2025，23（2）：223-227.