乳酸菌發酵牛乳產物中5-羥甲基糠醛含量檢測方法的建立及其方法學驗證

摘 要：本文建立了一種高效液相色譜法檢測乳酸菌發酵牛乳產物中5-羥甲基糠醛含量的方法，并進行了方法學驗證。使用Agilent Zorbax SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進行色譜分離，以0.1%甲酸溶液-乙腈（98∶2，V/V）作為流動相，設置流速為1.0 mL·min-1、進樣量為10 μL、柱溫為30 ℃以及檢測波長為284 nm，外標法定量。結果表明，5-羥甲基糠醛在0.030 2～15.120 0 μg·mL-1線性關系良好，相關系數R2=0.999 9，樣品的平均回收率為90.90%。該方法專屬性強、穩定性好、耐用性良好，適用于乳酸菌發酵牛乳產物中5-羥甲基糠醛含量的測定。

關鍵詞：乳酸菌發酵；5-羥甲基糠醛；高效液相色譜法；方法學驗證

Establishment of a Method for the Detection of 5-Hydroxymethylfurfural Content in Milk Products Fermented by Lactic Acid Bacteria and Its Methodological Validation

ZHONG Dichang， XIONG Yanxia， ZHANG Yang， WU Yuzhen， LI Liying， YU Yinfang*

（Jiangzhong Pharmaceutical Co.， Ltd.， Nanchang 330004， China）

Abstract： A high performance liquid chromatography method for the determination of 5-hydroxymethylfurfural in milk products fermented by lactic acid bacteria was established and the method was verified. The separation was performed on Agilent Zorbax SB-Aq column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） with 0.1% formic acid-acetonitrile （98∶2， V/V） as the mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1， the sample size was 10 μL， the column temperature was

30 ℃， and the detection wavelength was 284 nm. The quantification was performed by external standard method. The results showed that 5-hydroxymethylfurfural had a good linear relationship in the range of 0.030 2 μg·mL-1 to

15.120 0 μg·mL-1 with correlation coefficient R2=0.999 9. The average recovery of sample was 90.90%. The method has strong specificity， good stability and good durability， and is suitable for the determination of 5-hydroxymethylfurfural content in milk products fermented by lactic acid bacteria.

Keywords： lactic acid bacteria fermentation; 5-hydroxymethylfurfural; high performance liquid chromatography method; methodological validation

乳酸菌發酵牛乳是乳酸菌發酵食品中使用最廣泛的制品之一，牛乳經乳酸菌發酵后可以產生大量的胞外多糖、活性肽、乳酸等乳酸菌代謝產物，可發揮廣泛的代謝和調節作用，具有調節腸道菌群、增強機體免疫、緩解非酒精性脂肪肝、抗氧化、降低血脂和膽固醇等生理功能[1-4]。牛乳在乳酸菌發酵以及加工成型過程中，特別是在高溫處理時，極易發生美拉德反應，生成一系列的芳香與顏色物質，5-羥甲基糠醛就是其中的代表產物之一[5-7]。相關研究表明[8-10]，5-羥甲基糠醛含量與中藥材色澤變化具有一定的相關性。為了進一步表征乳酸菌發酵牛乳產物的外觀顏色，為其外觀品質鑒別提供量化數據支撐，本研究建立了一種高效液相色譜法檢測乳酸菌發酵牛乳產物中5-羥甲基糠醛含量的方法，并進行了方法學考察，以期有效測定乳酸菌發酵牛乳產物中5-羥甲基糠醛的含量，為乳酸菌發酵牛乳產物的質量控制及關鍵技術指標提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

乳酸菌發酵牛乳噴干粉，購于某公司。

ME204 TE電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；1200液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；SB-500DTY超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TD5M臺式低速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；IQ 7000超純化水儀（廈門精益興業科技有限公司）。

5-羥甲基糠醛對照品（批號111626，純度≥99%），中國食品藥品檢定研究院；甲醇（分析純），國藥化學試劑有限公司；乙腈（色譜純），天津市大茂化學試劑廠；甲酸（分析純），西隴科學股份有限公司；超純化水。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB -Aq 色譜柱（250 mm×

4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：0.1%甲酸溶液-乙腈（98∶2，V/V）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：284 nm；進樣量：10 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取5-羥甲基糠醛對照品約3.024 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇，超聲使其溶解并定容，得到濃度約為30.24 μg·mL-1的5-羥甲基糠醛對照品儲備液。精密吸取儲備液2 mL，置于10 mL容量瓶中，用純化水定容至刻度線，得到濃度約為6.048 μg·mL-1的對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取乳酸菌發酵牛乳噴干粉5 g，置于50 mL

容量瓶中，加入純化水約40 mL，超聲10 min使其溶解，放冷，使用純化水定容至刻度線，搖勻，經

0.45 μm微孔濾膜過濾，得到供試品溶液。

1.2.4 專屬性

按照1.2.2項的方法制備對照品溶液，1.2.3項的方法制備供試品溶液，精密量取適量對照品溶液、空白溶液、供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按照1.2.1項下的色譜條件進行檢測，記錄相應的色譜圖。

1.2.5 線性范圍

分別取適量1.2.2項下的對照品儲備液，配制成濃度分別為0.030 2、0.302 4、0.604 8、1.209 6、

3.024 0、6.048 0 μg·mL-1和15.120 0 μg·mL-1的5-羥甲基糠醛標準系列溶液；依次注入高效液相色譜儀，按照1.2.1項下的色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。以5-羥甲基糠醛標準系列溶液的濃度為橫坐標，以其對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 檢出限與定量限

以3倍左右信噪比作為方法的檢出限，以10倍左右信噪比作為方法的定量限。在空白溶液中加入已知濃度的5-羥甲基糠醛對照品溶液，經過梯度稀釋后，得到不同濃度的樣品溶液，依次注入高效液相色譜儀，按照1.2.1項下的色譜條件進行檢測。

1.2.7 精密度

精密稱取5 g乳酸菌發酵牛乳噴干粉6份，按照1.2.3項的方法制備樣品溶液，共6個平行，依次注入高效液相色譜儀，按照1.2.1項下的色譜條件進行檢測，記錄相應色譜圖，計算峰面積。

1.2.8 準確度

精密稱取已知5-羥甲基糠醛含量（4.322 8 μg·g-1）的乳酸菌發酵牛乳噴干粉4.0 g各6份，置于50 mL容量瓶中，精密加入對照品儲備液20.5 mL，加純化水約40 mL，超聲處理10 min，放冷，使用純化水定容至刻度線。注入高效液相色譜儀，按照1.2.1項下的色譜條件進行檢測，記錄相應色譜圖，按照峰面積計算5-羥甲基糠醛的含量，計算回收率。

1.2.9 穩定性

按照1.2.3的方法制備供試品溶液，分別在供試品溶液放置0、2、4、6、8、12 h和24 h后，依次注入高效液相色譜儀，按照1.2.1項下的色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，計算峰面積。

1.2.10 耐用性

按照1.2.3的方法制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，分別在流速增減0.1 mL·min-1、柱溫增減2 ℃、流動相比例增減1%的色譜條件下進行檢測，記錄色譜圖，計算峰面積。

2 結果與分析

2.1 專屬性考察結果

對照品溶液、空白溶液、樣品溶液相對應的色譜圖見圖1。空白溶液在對照品溶液及供試品溶液5-羥甲基糠醛出峰處，沒有出現干擾峰，說明該方法專屬性較好，沒有雜質干擾。

2.2 線性范圍考察結果

以5-羥甲基糠醛對照品標準系列溶液的濃度為橫坐標，以其對應的峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析，其線性關系見圖2。線性回歸方程為y=

1.351 7x+0.010 2，R2=0.999 9，表明5-羥甲基糠醛濃度在0.030 2～15.120 0 μg·mL-1線性關系良好。

2.3 檢出限與定量限

分別以信噪比（S/N）=5和信噪比（S/N）=13.5確定方法的檢出限和定量限，計算得到該方法中5-羥甲基糠醛的檢出限為0.004 536 μg·mL-1，定量限為0.018 144 μg·mL-1。

2.4 精密度考察結果

精密度考察結果見表1。結果表明，同一濃度下6份供試品峰面積的相對標準偏差為0.09%，表明該方法儀器精密度良好，重復性好，能夠滿足檢測要求。

2.5 準確度考察結果

準確度考察結果見表2。結果表明，6份樣品的回收率在89.19%～92.19%，平均回收率為90.90%，相對標準偏差為1.29%，表明該方法回收率穩定、準確度高。

2.6 穩定性考察結果

穩定性考察結果見表3。結果表明，供試品溶液放置0、2、4、6、8、12 h和24 h后，其峰面積的相對標準偏差為1.44%，說明該方法下5-羥甲基糠醛在24 h內穩定性良好。

2.7 耐用性考察結果

耐用性考察結果見表4。結果表明，在流速增減0.1 mL·min-1、柱溫增減2 ℃、流動相比例增減1%的色譜條件下，對照品溶液中5-羥甲基糠醛含量的相對標準偏差為0.47%，表明該方法的耐用性良好。

3 結論

本研究建立了一種高效液相液相色譜法測定乳酸菌發酵牛乳噴干粉中5-羥甲基糠醛含量的方法。根據2020年版《中華人民共和國藥典》中“9101分析方法驗證指導原則”，該方法專屬性好，穩定性強，耐用性良好，適用于乳酸菌發酵牛乳產物中5-羥甲基糠醛含量的測定。

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