分子生物學技術在沙門氏菌檢測中的應用

摘 要：沙門氏菌是一種常見的人畜共患食源性病原體，對公眾健康構成嚴重威脅，影響了食品行業的健康發展，已成為全球關注的焦點之一。本文綜述分子生物學在沙門氏菌檢測中的應用，以期為政府監管部門及第三方檢測機構的研究提供參考。

關鍵詞：沙門氏菌；分子生物學檢測技術；應用

Application of Molecular Biology Techniques in Salmonella Detection

ZHAI Pingping， ZHU Yingfei*， FAN Hongwei， ZHAN Zhongxu， XIONG Lixia

（Jiangxi Provincial Institute of Inspection， Testing and Certification Food Inspection and Testing Institute，

Nanchang 330000， China）

Abstract： Salmonella is a common zoonotic food-borne pathogen， which poses a serious threat to public health and affects the healthy development of the food industry， and has become one of the focus of global concern. In this paper， the application of molecular biology in Salmonella detection is reviewed in order to provide reference for the research of government supervision departments and third party detection institutions.

Keywords： Salmonella; molecular biology techniques; application

沙門氏菌是一種主要的食源性病原體，可導致嚴重的人類和動物疾病，具有較高的發病率和死亡率[1-2]。由于傳統的沙門氏菌檢測方法費時費力，因此快速、準確的檢測技術對食品安全和診斷該類食源性疾病至關重要。常規的沙門氏菌檢測步驟包括細菌分離、生化鑒定和血清學確證試驗等[3]。雖然該方法可靠，但耗時（需要5～7 d）。此外，不同細菌之間可能發生生化交叉反應[4]。近年來基于核酸分子檢驗技術的發展速度較快，此類技術具有敏感、特異、快速和簡單等優勢。隨著時代的進步，該技術在我國檢驗檢疫領域的應用也不斷擴大。我國要求市級以上疾病預防控制中心具有核酸分子檢測技術的能力，旨在有效監管食品安全[5]。目前，各種基于分子生物學方法，如PCR、qPCR、數字PCR以及等溫擴增等，具有快速性、特異性和敏感性，已成功用于食品中沙門氏菌的檢測。

1 常規PCR檢測技術

常規PCR檢測技術因不涉及樣品的預富集或樣品處理，具有簡單、高效（耗時3～4 h）和高靈敏度（5～10 CFU·mL-1）的特點[6]。AHMED等[7]使用常規培養法和PCR檢測技術鑒定牛肉和雞肉等食品樣本中的沙門氏菌，其中常規培養法需要花費7 d時間，樣本檢出率為21.3%，而PCR檢測技術顯示在收到樣本后到檢測完成在12 h內，檢出率為23.3%。相比傳統培養法，常規PCR檢測技術在沙門氏菌檢測中的耗時更短、檢出率更高，已被廣泛用于食源性病原體檢測。

2 實時熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR技術（Quantitative Real-time PCR，qPCR）已成為一種通用方法[8-9]。XIONG等[10]開發并驗證了快速雙重實時聚合酶鏈反應，用于準確識別和定量檢測腸炎沙門氏菌，熔解曲線和凝膠電泳分析結果表明，所設計的引物對lygD和invA的擴增具有很強的特異性，雙重實時PCR從40種沙門氏菌菌株（包含29種沙門血清型）和12種非沙門氏菌菌株中鑒定出腸炎沙門氏菌，每次反應能檢測到4個腸炎沙門氏菌DNA拷貝，與傳統培養方法相比，預富集6 h后，該檢測方法可從雞蛋樣品中鑒定出腸炎沙門氏菌和沙門氏菌屬分離株，且靈敏度更高。qPCR技術由于能夠檢測非常低濃度的目標樣品，且檢測速度快，靈敏度高，已被廣泛應用于各種病原體的檢測中。

3 數字PCR技術

數字PCR（Digital PCR，dPCR）技術是一種新的核酸擴增方法，能夠對不同的污染樣本進行非常低的濃度定量[11]。FANG等[12]成功開發了一種新型三重液滴數字PCR技術，用于同時鑒定和絕對定量沙門氏菌及其兩種重要血清型（腸炎菌和傷寒菌）。該方法的檢測限分別低至5 fg·μL-1 gDNA和

10 CFU·mL-1純培養物。此外，與qPCR相比，三重液滴數字PCR技術用于檢測人為污染的食品樣品時，檢測限較低，為10～102 CFU·mL-1。與qPCR相比，三重液滴數字PCR技術具有高度特異性、靈敏性和絕對定量能力，檢驗結果更靈敏[13]，適用于樣本中低濃度的沙門氏菌檢測。

4 等溫擴增技術

4.1 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術是最具創新性的分子技術之一，主要用于診斷包括沙門氏菌在內的多種病原體[14]，具有良好的特異性和靈敏度[15]。DOMESLE等[16]利用環介導等溫擴增技術-比濁法和熒光法分別檢測了300種測試菌株，包括247種沙門氏菌（包含185個血清型）和53種非沙門氏菌。結果表明，兩種檢驗方法具有100%的特異性，不同血清型的

6種沙門氏菌菌株的檢測限范圍為1.3～28個細胞。在檢測動物食品中低濃度水平的沙門氏菌時，環介導等溫擴增技術比熒光技術更敏感，并且可以提前

3 d獲得結果。環介導等溫擴增技術的檢測速度更快，靈敏度更高，已成為沙門氏菌篩查的快速、可靠和穩健的方法。

4.2 重組酶聚合酶擴增技術

重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技術具有靈敏度高、成本低的特點，被廣泛應用于沙門氏菌的日常檢驗中。LI等[17]建立了檢測沙門氏菌的比色重組酶聚合酶擴增方法，通過對沙門氏菌的invA基因設計RPA引物，等溫擴增產生雙鏈DNA擴增子，并通過光敏比色測定直接定量。結果表明，該方法的最低可檢測濃度為

5×103 CFU·mL-1，可以快速且低成本地檢測沙門氏菌。

4.3 滾環擴增技術

滾環擴增（Rolling Circle Amplification，RCA）技術作為一種新型的核酸等溫擴增技術，近年來在沙門氏菌檢驗中得到廣泛應用[18]，具有特異性強、靈敏度高、可測序分析驗證結果等優點[19]。WANG等[20]建立了一種基于跳躍式滾環擴增結合光敏比色測定食品中沙門氏菌的新方法。結果表明，該方法的檢出限低至13 CFU·mL-1，可快速、靈敏地檢測食品中的沙門氏菌。此外，該方法無須昂貴的儀器，可以用于其他食源性病原體或其他含有核酸的生物樣本的即時檢測。

4.4 聚合酶螺旋反應技術

聚合酶螺旋反應（Polymerase Spiral Reaction，PSR）技術在沙門氏菌檢測中具有較高的靈敏度和特異性。XU等[21]建立了一種針對沙門氏菌保守入侵基因的聚合酶螺旋反應檢測技術。結果表明，環介導等溫擴增技術的檢測限為50 CFU·mL-1，具有簡單、靈敏、快速的特點，為食源性疾病的預防和檢測提供了參考。

4.5 解旋酶依賴性擴增技術

解旋酶依賴性擴增技術，作為一種靈敏度高、特異性強、快速高效、便捷精準的核酸等溫擴增技術，在病原體檢測研究中得到廣泛應用[22]。DU等[23]開發了一種快速、簡單、便攜的沙門氏菌檢測方法，即將嗜熱解旋酶依賴擴增與橫向流動分析相結合，可在90 min內進行視覺信號檢測。結果表明，該方法對DNA和純培養細菌的檢出限分別為73.4～80.7 fg

和35～40 CFU。特異性分析顯示，沙門氏菌與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、產氣腸桿菌、志賀氏菌和空腸彎曲桿菌無交叉反應。該方法可用于食品樣品中沙門氏菌的快速檢測，適用于設備有限的地區。

5 PMA-PCR檢測技術

PCR技術無法區分來自非存活細胞和存活細胞的DNA擴增，食品樣品中死亡或受損細胞泄漏的大量DNA也可能被擴增，導致出現活細胞數量的高估和潛在的假陽性檢測結果的情況[24]。PMA-PCR檢測技術只擴增活細胞中目標基因，死亡或受損的細胞中的基因擴增則被抑制，很好地解決了這一難題。HUANG等[25]采用生物信息學方法篩選單增李斯特菌和沙門氏菌高特異性引物，并將其組合構建雙qPCR系統，使用單疊氮化丙啶來彌補qPCR無法區分活細胞和非活細胞的缺陷，建立了快速、高特異性、靈敏的AuNPs-SD-PMA-qPCR檢測技術。此外，與qPCR系統相比，該技術顯著增強了活菌擴增的熒光信號，對乳制品中單增李斯特菌和沙門氏菌富集

6 h后，檢測限低至5×101 CFU·g-1。PMA-PCR檢測技術可以區分活細胞和死細胞，從而減少了假陽性結果的發生概率。

6 結語

由于影響公共衛生的食源性疾病暴發現象日益增加，對食源性病原體的快速、可靠、敏感和廉價的檢測方法的需求增加。PCR、qPCR、dPCR和等溫擴增技術等現有的分子檢測方法已廣泛應用于臨床和實驗室。此外，分子生物學檢測方法也存在一些挑戰和局限性，亟待解決。分子生物學檢測技術的發展和改進對于食源性病原體的檢測更加可靠、靈敏和節省時間，可以提供快速、準確的數據分析結果。

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