農(nóng)作物種子核酸真空抽濾快速提取方法的研究

摘要：為解決轉(zhuǎn)基因檢測中植物種子核酸提取步驟多、效率低的難題，發(fā)明了非接觸式連接裝置，組裝了真空抽濾快速提取裝置，改進了核酸提取方法。該方法提取的種子核酸質(zhì)量和濃度符合需求，核酸完整性好、無降解、無擴增抑制物，有效解決了種子樣品核酸快速提取的技術(shù)難題。對轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的檢測結(jié)果表明，該核酸提取方法適用于農(nóng)作物種子的轉(zhuǎn)基因檢測。

關(guān)鍵詞：核酸提取；分子檢測；種子；真空抽濾

Research on Vacuum Filtration Method in Rapid Extraction of

Nucleic Acid from Crop Seeds

ZHANG Haibo，ZHANG Hongjun，LEI Jun，ZHANG Ying

（Shaanxi Seed Working Station，Xi’an 710018）

分子檢測方法越來越多地應(yīng)用于農(nóng)作物種子的轉(zhuǎn)基因成分和品種真實性檢測項目中，這些方法通常以核酸檢測為主，以PCR擴增為核心[1]。PCR擴增的首要步驟是核酸提取。因為有細(xì)胞壁，植物的核酸提取不同于動物組織，過程比較復(fù)雜，尤其是農(nóng)作物種子干物質(zhì)較多，核酸提取更為困難[2]。種子核酸提取是進行PCR擴增的基礎(chǔ)，是獲得高質(zhì)量檢測結(jié)果的前提，但因其步驟多且費時長，也是整個方法的限速步驟。

目前農(nóng)作物種子主流的核酸提取方法需要用到十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、飽和酚、氯仿等化學(xué)試劑，這些試劑對人體有毒有害，不宜長期使用。商業(yè)化試劑盒法多采用離心過濾柱式，提取時間長、操作復(fù)雜，難以對大批量樣品進行核酸提取，且產(chǎn)生的離心管等垃圾較多。堿煮法雖然快速，但是核酸質(zhì)量不高，且不易保存，無法進行復(fù)檢[3]。

為解決核酸快速高效提取問題，本研究發(fā)明了一種用于核酸抽濾的非接觸式連接裝置[4]，改進了核酸提取真空抽濾技術(shù)。該技術(shù)快速、簡便、可操作性好、實用性強，能夠使PCR技術(shù)在農(nóng)作物種子分子檢測中得到更為廣泛的普及和推廣。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本試驗中玉米、小麥和水稻的種子為陜西省農(nóng)作物種子檢驗站收藏，轉(zhuǎn)基因玉米粉末Bt11（ERM-BF412BK）由歐洲標(biāo)準(zhǔn)局（IRMM，Institute for reference materials and measurements）制作，并通過上海安譜實驗科技股份有限公司購買。

吸附柱法植物核酸提取試劑盒（MolPure Plant DNA Kit）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司（Yeasen Biotechnology），實時熒光PCR擴增試劑（Pro Taq HS預(yù)混型探針法qPCR試劑盒AG11704）購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，擴增引物和探針由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 核酸抽濾快速提取法 核酸抽濾快速提取使用吸附柱法植物核酸提取試劑盒提供的試劑，其中洗脫和離心步驟由本研究設(shè)計的真空抽濾方法代替。具體提取步驟如下：將種子樣品磨碎，稱取100mg放入2mL離心管中，加入400μL裂解液和5μL RNase，混勻后60℃加熱10min，期間混勻數(shù)次；加入130μL去蛋白液，混勻后12000r離心5min；取上清400μL，加入600μL結(jié)合液，混勻加入吸附柱中；將吸附柱通過發(fā)明的連接裝置與真空抽濾提取系統(tǒng)連接，打開真空泵，待液體全部吸入真空腔中后，加2次漂洗液漂洗；將吸附柱取下，12000r離心2min，恒溫震蕩儀烘干5min，加入洗脫液200μL，12000r離心1min，獲得的溶液為所提取的核酸。

1.2.2 試劑盒提取方法 利用吸附柱法植物核酸提取試劑盒提取試驗材料的核酸，具體操作步驟參照試劑盒使用說明書，其中起始種子材料的質(zhì)量以及最終的核酸洗脫液體積與核酸抽濾快速提取法保持一致，以便將兩種核酸提取方法所提取核酸的質(zhì)量進行比較。

1.2.3 核酸質(zhì)量檢測 提取的核酸使用紫外分光光度計ND2000（賽默飛世爾科技公司，Thermo Fisher Scientific）測定核酸的純度和濃度，核酸純度由260nm吸光值和280nm吸光值的比值判定，1.6～2.0為符合要求。核酸濃度由260nm吸光值計算，260nm吸光值為1.0表明核酸濃度為50ng/μL。使用8g/L瓊脂糖凝膠電泳和EB染色檢測核酸樣品的完整性，沒有嚴(yán)重拖尾表明提取的核酸未降解，符合試驗要求。

1.2.4 內(nèi)源基因PCR擴增 采用GB/T 19495.4—2018《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 實時熒光定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測方法》中的方法，根據(jù)玉米、小麥和水稻的內(nèi)源基因zSSIIb、Wx012和SPS基因檢測方法，分別合成Taqman探針實時熒光PCR的引物。Taqman探針實時熒光PCR擴增條件及擴增程序依據(jù)上述執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。擴增使用ABI StepOne Plus實時熒光PCR儀（美國Applied Biosystems）進行，使用儀器自帶軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因玉米檢測分析 采用農(nóng)業(yè)部2122號公告—14—2014《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測 抗蟲和耐除草劑玉米Bt11及其衍生品種定性PCR方法》中的轉(zhuǎn)基因玉米Bt11檢測方法，合成Bt11內(nèi)源基因和轉(zhuǎn)化體特異性檢測的Taqman探針和實時熒光PCR引物。對使用核酸抽濾快速提取方法提取的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的核酸進行實時熒光檢測。Taqman探針實時熒光PCR擴增條件及擴增程序依據(jù)上述執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，擴增循環(huán)數(shù)為45個循環(huán)，擴增使用ABI StepOne Plus實時熒光PCR儀進行，使用儀器自帶軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸抽濾快速提取裝置 為改良離心過濾柱式提取時間長、操作復(fù)雜、產(chǎn)生垃圾多等問題，本研究首先設(shè)計了一種用于核酸抽濾的非接觸式連接裝置。該連接裝置結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。該裝置由連接管和吸附柱組成，連接管的下端固定連接有連接頭，與真空腔連接。吸附柱的外側(cè)設(shè)有連接部，與連接管螺紋槽連接，連接頭的下端內(nèi)側(cè)設(shè)有密封圈，連接管的內(nèi)側(cè)設(shè)有單向閥，防止逆流。在第二堵蓋的背面增設(shè)帶有軟磁層的打標(biāo)槽，可以方便利用軟磁層磁吸帶有標(biāo)簽紙的鐵片，利用標(biāo)簽紙可以方便對對應(yīng)使用的連接管進行打標(biāo)。當(dāng)連接管重復(fù)使用時，可以方便地將對應(yīng)的標(biāo)簽紙鐵片取下更換，不需要按照傳統(tǒng)的方式直接將標(biāo)簽紙粘在連接管上，避免更換撕揭不便等問題。

利用圖1的非接觸式連接裝置，聯(lián)合使用真空腔和真空泵，組建了核酸抽濾快速提取裝置，詳見圖2示意圖。核酸抽濾快速提取裝置由非接觸式連接裝置、真空腔和真空泵3部分組成。真空腔頂部每排有10個小孔，可同時插10個非接觸式連接裝置，下部有廢液口。真空腔通過連接軟管與真空泵連接。真空泵可提供-760mmHg的真空度，考慮到整個裝置的氣密性，一般使用時達到-600mmHg的真空度時即可實現(xiàn)真空抽濾。

2.2 核酸質(zhì)量分析 使用試劑盒提取法和核酸抽濾快速提取法分別提取玉米、水稻和小麥粉末樣品各10份，其中玉米樣品標(biāo)記為1～10號，水稻樣品為11～20號，小麥樣品為21～30號。核酸質(zhì)量和核酸濃度測定結(jié)果分別如圖3和圖4所示。

對于核酸質(zhì)量，A260/280的比值在1.6～2.0之間的為核酸質(zhì)量合格，可用于種子的分子檢測。試劑盒提取法獲取的玉米、水稻和小麥核酸A260/280A260/280的比值中位值分別是1.77、1.75、1.79，核酸抽濾快速提取法獲取的玉米、水稻和小麥核酸A260/280的比值中位值分別是1.74、1.76、1.73。從圖3可以看出，試劑盒法和快速提取法獲得的核酸，A260/280的比值都在1.6～1.9之間，符合分子檢驗要求。兩組數(shù)據(jù)無顯著差異，說明兩種方法提取的核酸質(zhì)量無較大差別。由圖4可知，提取的玉米、水稻、小麥核酸濃度分別在62.5～83.0ng/μL、56.0～82.0ng/μL、53.0～83.5ng/μL之間，中位值分別是66.0ng/μL、67.0ng/μL和66.0ng/μL，符合檢測要求。

2.3 核酸完整性分析 使用0.8%的瓊脂糖對提取的核酸進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，采用核酸抽濾快速提取法提取的玉米、水稻和小麥的核酸在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳試驗中亮度高、彌散少、無拖尾，說明提取的核酸量足、降解少、大小一致，滿足進行下一步轉(zhuǎn)基因成分分析的要求。

2.4 內(nèi)源基因擴增結(jié)果 使用實時熒光PCR方法，對核酸抽濾快速提取法提取的核酸進行內(nèi)源基因擴增，結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出，玉米、水稻和小麥的內(nèi)源基因zSSIIb（圖6A）、SPS（圖6B）和Wx012（圖6C）都能夠得到完整擴增，Ct值（循環(huán)閾值）在24～26之間，說明提取的玉米、水稻和小麥核酸不存在擴增抑制物，適合進行轉(zhuǎn)基因成分的PCR檢測。

2.5 轉(zhuǎn)基因玉米Bt11檢測結(jié)果分析 以轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為檢測對象，應(yīng)用核酸抽濾快速提取方法提取核酸。分別對玉米內(nèi)源基因zSSIIb和Bt11轉(zhuǎn)化體特異性片段進行實時熒光擴增，結(jié)果如圖7所示。轉(zhuǎn)基因玉米Bt11內(nèi)源基因zSSIIb（圖7A）和Bt11轉(zhuǎn)化體（圖7B）特異性片段都擴增出了典型的S型擴增曲線，Ct值分別是24.33和24.26。檢測結(jié)果表明，本研究建立的核酸抽濾快速提取方法適合進行轉(zhuǎn)基因作物的核酸提取和實時熒光檢測。

3 討論與結(jié)論

核酸提取是植物轉(zhuǎn)基因檢測的基礎(chǔ)性、關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，核酸質(zhì)量的高低直接影響轉(zhuǎn)基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[5]。為了提高轉(zhuǎn)基因檢測中核酸提取的速度和通量，本研究用真空抽濾方法代替離心的方法，改進了核酸提取技術(shù)，發(fā)明了非接觸式連接裝置，組裝了核酸抽濾快速提取裝置。經(jīng)測定，提取的種子核酸A260/280比值在1.6～2.0之間，濃度中位值分別是66.0ng/μL、67.0ng/μL和66.0ng/μL。0.8%的瓊脂糖電泳提示核酸完整度好，無降解拖尾。內(nèi)源基因擴增表明提取的核酸無擴增抑制物。使用非接觸式連接裝置，避免了樣品之間產(chǎn)生污染，有利于種子轉(zhuǎn)基因檢測結(jié)果質(zhì)量控制[6]。

核酸抽濾快速提取技術(shù)解決了實驗室種子檢測中提取種子樣品核酸的技術(shù)難題。由于使用了真空抽濾技術(shù)，核酸提取步驟由原來的14步減少為7步，一次提取所用時間由原來的142min縮短到58min，所需時間減少約60%，效率提升140%以上。該方法減少了提取環(huán)節(jié)，提高了核酸提取的效率和通量，保證了提取純度。使用了非接觸方式抽濾，使離心管和廢液收集管可重復(fù)使用，節(jié)約了實驗耗材，克服了樣品間易污染的難題，可高效助力種子分子檢測。

參考文獻

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05-02

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（收稿日期：2024-10-12）