哮喘肝郁證病證結合小鼠模型的建立與評價

〔摘要〕 目的 建立C57BL/6小鼠哮喘肝郁證病證結合模型并進行評價。方法 50只C57BL/6小鼠隨機分為空白組、哮喘組、哮喘肝郁組、布地奈德組、柴樸湯組。除空白組外，其余4組小鼠均采用屋塵螨（HDM）25 μg滴鼻，1次/d，5 d/周，持續4周進行哮喘造模，其中哮喘肝郁組、布地奈德組和柴樸湯組同期聯合予以慢性不可預知性溫和刺激（CUMS），1次/d，持續28 d制備哮喘肝郁證模型。布地奈德組（吸入用布地奈德混懸液0.5 g/L霧化吸入）和柴樸湯組（柴樸湯12.48 g/kg灌胃）于造模第15～28天接受治療。觀察各組小鼠一般狀況、體質量，并進行糖水偏好實驗、強迫游泳實驗，檢測肺功能及血清促腎上腺皮質激素（ACTH）、白細胞介素-6（IL-6）水平，HE染色及Masson染色觀察肺組織病理情況。結果 第28天實驗結束后，與空白組比較，哮喘組與哮喘肝郁組一般狀況評分、肺阻力（RL）、ACTH及IL-6均顯著升高（Plt;0.01），用力肺活量（FVC）及呼氣峰流量（PEF）均明顯減少（Plt;0.01），HE染色及Masson染色示氣道周圍炎癥細胞浸潤及膠原纖維沉積明顯;哮喘肝郁組體質量、糖水偏好指數明顯下降（Plt;0.01），游泳不動時間明顯增加（Plt;0.01）。與哮喘組比較，哮喘肝郁組體質量、糖水偏好指數、FVC及PEF均明顯下降（Plt;0.01），游泳不動時間、ACTH及IL-6均顯著升高（Plt;0.01），HE染色及Masson染色示氣道周圍炎癥細胞浸潤及膠原纖維沉積更嚴重。與哮喘肝郁組比較，布地奈德組及柴樸湯組一般狀況評分、游泳不動時間、RL及IL-6均明顯下降（Plt;0.01），體質量、FVC及PEF均明顯升高（Plt;0.01），HE染色及Masson染色示氣道周圍炎癥細胞浸潤及膠原纖維沉積減輕;柴樸湯組糖水偏好指數明顯升高（Plt;0.01），ACTH明顯下降（Plt;0.01）。與布地奈德組比較，柴樸湯組體質量及糖水偏好指數均升高（Plt;0.05），游泳不動時間減少（Plt;0.05），HE染色及Masson染色示氣道周圍炎癥細胞浸潤及膠原纖維沉積程度更輕。結論 采用HDM 25 μg滴鼻，1次/d，5 d/周，持續4周，同時聯用28 d CUMS能夠成功構建小鼠哮喘肝郁證病證結合模型。

〔關鍵詞〕 哮喘;肝郁證;動物模型;病證結合;柴樸湯

〔中圖分類號〕R285.5"""""""" 〔文獻標志碼〕A""""""""" 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.02.003

〔收稿日期〕2024-10-29

〔基金項目〕湖南省教育廳科學研究項目（22B0383）;湖南省研究生科研創新項目（CX20230819）;湖南中醫藥大學校級研究生創新課題（2023CX117）;湖南中醫藥大學-湖南明康中錦醫療科技發展有限公司聯合基金項目（2022MKZJ08）;長沙市自然科學基金項目（kq2208184）。

〔通信作者〕*戴愛國，男，博士，主任醫師，教授，博士研究生導師，E-mail：daiaiguo@hnucm.edu.cn。

Establishment and evaluation of a mouse model combining asthma with liver qi stagnation pattern

PENG Guoran1，2， CHENG Beibei2，3， DING Rongzhen2，3， DAI Aiguo2，3，4*

1. School of Integrated Chinese and Western Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. Key Laboratory of Vascular Biology and Translational Medicine， Education Department of Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Research Laboratory of Respiratory Diseases， School of Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 4. Respiratory Medicine Department， the First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Abstract〕 Objective To establish and evaluate a model combining asthma with liver qi stagnation pattern in C57BL/6 mice. Methods Fifty C57BL/6 mice were randomized into blank group， asthma group， asthma with liver qi stagnation group， budesonide group， and Chaipo Decoction （CPD） group. Except for the blank group， the other four groups of mice were intranasally administered with 25μg of house dust mite （HDM） once a day， five days a week， for four weeks to induce the asthma model. Among them， the asthma with liver qi stagnation group， budesonide group， and CPD group were simultaneously subjected to chronic unpredictable mild stress （CUMS） once a day for 28 days to establish the asthma with liver qi stagnation pattern model. The budesonide group （receiving nebulized inhalation of budesonide suspension at 0.5 g/L） and the CPD group （receiving gastric gavage of CPD at 12.48 g/kg） were treated from day 15 to day 28 of modeling. The general condition and body weight of mice in each group were observed， sucrose preference test and forced swimming test were conducted， and lung function and serum levels of adrenocorticotropic hormone （ACTH） and interleukin-6 （IL-6） were measured. Additionally， pathological conditions of lung tissue were observed via HE staining and Masson staining. Results At the end of the 28-day experiment， compared with the blank group， the asthma group and the asthma with liver qi stagnation group showed significant increases in general condition scores， pulmonary resistance （RL）， and levels of ACTH and IL-6 （Plt;0.01）， as well as significant decreases in forced vital capacity （FVC） and peak expiratory flow （PEF） （Plt;0.01）. HE staining and Masson staining revealed marked infiltration of inflammatory cells and deposition of collagen fibers around the airways. Additionally， the asthma with liver qi stagnation group exhibited significant decreases in body weight and sucrose preference index （Plt;0.01）， along with a significant increase in immobility time during swimming （Plt;0.01）. Compared with the asthma group， the asthma with liver qi stagnation group showed significant decreases in body weight， sucrose preference index， FVC， and PEF （Plt;0.01）. Furthermore， there were significant increases in immobility time during swimming， ACTH， and IL-6 levels （Plt;0.01）. HE staining and Masson staining revealed more severe inflammatory cell infiltration and collagen fiber deposition around the airways. Compared with the asthma with liver qi stagnation group， the budesonide group and the CPD group showed significant decreases in general condition score， immobility time during swimming， RL， and IL-6 levels （Plt;0.01）， and significant increases in body weight， FVC， and PEF （Plt;0.01）. HE staining and Masson staining revealed reduced inflammatory cell infiltration and collagen fiber deposition around the airways. Furthermore， the CPD group showed a significant increase in sucrose preference index （Plt;0.01） and a significant decrease in ACTH level （Plt;0.01）. Compared with the budesonide group， the CPD group showed significant increases in body weight and sucrose preference index （Plt;0.05）， as well as a decrease in immobility time during swimming （Plt;0.05）. HE staining and Masson staining revealed milder inflammatory cell infiltration and collagen fiber deposition around the airways. Conclusion A mouse model combining asthma with liver qi stagnation pattern can be successfully established by intranasal administration of HDM 25 μg， once daily， five days a week for four weeks， combined with 28 days of CUMS.

〔Keywords〕 asthma; liver qi stagnation pattern; animal model; combination of disease and pattern; Chaipo Decoction

本文引用： 彭果然， 程貝貝， 丁蓉珍， 戴愛國. 哮喘肝郁證病證結合小鼠模型的建立與評價[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2025， 45（2）： 204-211.

哮喘是一種由慢性氣道炎癥引起的影響全球3億多人的呼吸系統疾病，其臨床癥狀包括喘鳴、氣促、胸悶、咳嗽等反復發作，嚴重影響患者的生活質量[1]。隨著現代社會工作和生活節奏的加快，因壓力過大、情志不遂而表現為肝郁證的人日益增多，在哮喘患者群體中經中醫辨證為肝郁證者頗為常見。此類患者往往因哮喘難以根治、癥狀反復發作、需要長期用藥治療而深感困擾，情志不遂日久成肝郁。哮喘肝郁證患者較多，但其發病機制尚不清楚，且哮喘肝郁證的病證結合動物模型的制備尚未形成公認的標準。各課題組根據自身對哮喘肝郁證的理解，選用相應的動物模型制備方法及評價指標，實驗結論的可靠性受到質疑，也不利于科研成果的評價。因此，亟須建立規范的哮喘肝郁證病證結合動物模型。本課題組在前期研究[2-3]的基礎上進行優化，建立哮喘肝郁證病證結合小鼠模型，并對其一般狀況、體質量、糖水偏好指數、游泳不動時間、肺功能、肺組織病理學等指標進行綜合評價。同時，應用具有疏肝行氣解郁、理肺化痰平喘功效的中藥復方柴樸湯“以方測證”確認模型構建成功，以期為中醫藥防治哮喘肝郁證的動物實驗提供較為理想的模型，從而推動哮喘肝郁證的發病機制研究及相關藥物開發。

1 材料

1.1" 動物

50只6周齡SPF級C57BL/6雌性小鼠均由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[動物許可證號：SC?XK（湘）2021-0002，合格證號：430727241102164147]，在湖南中醫藥大學SPF級實驗動物中心飼養，實驗單位許可證編號為SYXK（湘）2019-0009，飼養條件包括12 h光暗周期（日光燈照射），室溫（25±1.5） ℃，濕度45%±10%。在無特殊實驗要求的情況下，小鼠可以自由飲水和進食。本實驗已獲得湖南中醫藥大學動物倫理委員會的批準，批準編號為HNUCM21-2407-17。

1.2" 藥物

柴樸湯顆粒由柴胡、法半夏、厚樸、黃芩、人參、茯苓、大棗、紫蘇葉、炙甘草、生姜按照配伍比例7∶5∶3∶3∶3∶3∶3∶2∶2∶1組成，為全成分中藥配方顆粒。中藥均購于廣東一方制藥有限公司，批號分別為：A2070263、A2101473、A2073144、A2033693、A2090353、A208A

163、A2081403、A2121543、A2111503、A2121483。吸入用布地奈德混懸液（商品名：天晴速暢;批準文號：國藥準字H20203063;規格：2 mL∶1 mg;正大天晴藥業集團股份有限公司，批號：240510497）。

1.3" 主要試劑

屋塵螨（house dust mite， HDM）提取物（GREER公司，貨號：XPB91D3A25）;促腎上腺皮質激素（adre?nocorticotropic hormone， ACTH）、白細胞介素（interleukin，IL）-6 ELISA檢測試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：2409M12、2409M09）;HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒（中國碧云天有限公司，批號：C0105S、C0189S）。

1.4" 主要儀器

小動物肺功能檢測儀（北京普升科技有限公司，型號：DSI Buxco-PFT）;壓縮式霧化器（北京歐姆龍醫療器械有限公司，型號：NE-C28）;透明動物霧化箱（自制）;高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：H1750R）;BioTek吸收光酶標儀（北京質研科技有限公司，型號：800 TS）。

2 方法

2.1" 動物模型制備及處理

50只SPF級C57BL/6雌性小鼠，按體質量分層隨機分為5組，即空白組、哮喘組、哮喘肝郁組、布地奈德組、柴樸湯組，每組10只。適應性喂養1周后開始實驗。哮喘組參照文獻[4]制備模型，采用HDM

25 μg（溶于35 μL生理鹽水中）滴鼻，1次/d，5 d/周，持續4周。小鼠出現呼吸急促、點頭樣呼吸、腹肌明顯收縮、背部弓起、頻繁搔鼻和抓耳等癥狀，表明哮喘模型構建成功。哮喘肝郁證組、布地奈德組、柴樸湯組在此基礎上同時予以28 d慢性不可預知性溫和刺激（chronic unpredictable mild stress， CUMS）進行干預。刺激方式參照前期研究[2-3]及文獻報道[5]并進行優化：4 ℃冷水游泳5 min;懸尾刺激5 min;夾尾刺激5 min;束縛2 h;去除墊料6 h;45°傾斜鼠籠6 h;潮濕墊料24 h。上述刺激方式每日1種，1次/d，每種刺激方式均使用4次，且每周每種刺激方式只使用1次，隨機安排，使動物不能預知次日的刺激方式，并且確保連續2 d不出現同樣的刺激方式。

柴樸湯組根據《藥理實驗方法學》[6]中人體和動物的藥物量效劑量表，以臨床等效劑量作為小鼠的給藥劑量，從實驗第15天起給予柴樸湯0.2 mL（12.48 g/kg）灌胃，1次/d，連續14 d。布地奈德組從實驗第15天起參照文獻[7]予吸入用布地奈德混懸液0.5 g/L霧化吸入，1次/d，30 min/次，連續14 d。

2.2" 評價指標與檢測方法

2.2.1" 小鼠一般狀況評估" 觀察各組小鼠造模前后的精神、皮毛、行為及呼吸等表現。參照文獻[8]進行一般狀況評分：精神狀況（正常為1分;稍差為2分;較差為3分;明顯變差為4分;精神萎靡為5分）;皮毛狀態（柔順有光澤為1分;稍微雜亂，略微失去光澤為2分;雜亂少光澤為3分;皮毛干燥明顯、較為枯槁，基本無光澤為4分;嚴重枯槁，無光澤為5分）;活動度（活動靈巧為1分;活動略顯遲緩為2分;反應明顯緩慢為3分;活動減少，行動遲鈍，僅在受到較強刺激時才有輕微移動為4分;扎堆不動，幾乎無活動，完全缺乏對外界刺激的反應為5分）;抓取反抗程度（反抗明顯為1分;反抗一般為2分;輕微反抗為3分;反抗極少為4分;基本無反抗為5分）;呼吸情況（呼吸平穩為1分;呼吸稍急促為2分;呼吸較急促為3分;呼吸明顯急促為4分;呼吸極度急促，點頭樣淺表呼吸為5分）。評分越高代表小鼠的一般狀況越差。

2.2.2" 小鼠體質量監測" 于第1天造模開始前及第28天實驗結束后測定各組小鼠當日的體質量。

2.2.3" 糖水偏好實驗" 參照前期研究[2]，各組小鼠在正式實驗前禁水24 h以提高其對糖水的渴望度。測試于第1天造模開始前和第28天實驗結束后，分別在同一時間（12：00）進行。每只小鼠被放入獨立籠中，同時提供50 mL純水和50 mL的1%蔗糖水，并記錄2 h內糖水和純水消耗量。糖水偏好指數計算公式：糖水偏好指數=（糖水消耗量/總液體消耗量）×100%，該指數用于評估小鼠的抑郁狀態[2]。

2.2.4" 強迫游泳實驗" 實驗前24 h進行15 min的游泳訓練，以幫助小鼠適應水環境。在第1天造模開始前和第28天實驗結束后，同一時間（15：00），在直徑為18 cm、高度為20 cm的透明玻璃杯中加入水，水深調整為10 cm（即玻璃杯的半高度），水溫控制在23～25 ℃。將小鼠放入水中游泳6 min，記錄最后4 min內小鼠的游泳不動時間。游泳不動時間較長為抑郁樣行為的標志，表明動物的“絕望行為”增加[9]。

2.2.5" 肺功能檢測" 第28天實驗結束后，每組隨機選取5只小鼠，麻醉后行氣管插管，采用小動物肺功能儀測量各組小鼠用力肺活量（forced vital capacity， FVC）、呼氣峰流量（peak expiratory flow， PEF）及肺阻力（lung resistance， RL），以評估造模和不同處理對小鼠肺功能的影響。

2.2.6" ACTH及IL-6測定" 每組剩下的5只小鼠麻醉后摘眼球取血，離心機4 ℃、3 000 r·min-1，離心15 min（離心半徑8 cm）后提取血清，對血清進行ELISA檢測。按照試劑盒說明書，用標準品配制標準曲線，以便后續定量分析。血清樣品平衡至室溫后按要求稀釋，分別加入酶標板中，與標準品一起進行檢測。加入特異性抗體后，樣品孵育并洗滌，去除未結合物。加入酶標二抗和TMB顯色劑，通過酶促反應顯色后，用終止液停止反應，并用酶標儀在450 nm波長下讀取各孔的吸光度。通過標準曲線計算各組樣品中ACTH及IL-6的濃度，并進行統計分析。

2.2.7" 肺組織病理學觀察" 在第28天實驗結束后，將小鼠肺組織固定于4%多聚甲醛溶液中24 h，隨后經梯度乙醇脫水、二甲苯透明和石蠟包埋。將包埋的組織切片（厚度約為4 μm）進行常規HE和Masson染色處理。具體步驟為：脫蠟、蘇木素染色、分化、返藍、伊紅染色或磷鎢酸-磷鉬酸處理和苯胺藍染色、脫水、透明和封片。染色后在顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織的結構變化，并拍照記錄，用于評估不同處理對肺組織病理結構的影響。

2.3" 統計學分析

數據使用SPSS 25.0軟件進行分析，計量數據均符合正態分布用“x±s”描述。各組間的均數比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），如方差齊則進一步采用LSD法或Dunnett T3法進行多重比較，如方差不齊則采用Kruskal-Wallis非參數檢驗。Plt;0.05表示差異具有統計學意義。所有統計檢驗均為雙側檢驗。

3 結果

3.1" 各組小鼠一般狀況評估

第1天造模開始前，各組小鼠的一般狀態無差異，皮毛光亮順滑，活動靈巧，抓取反抗明顯，呼吸平穩，一般狀況評分比較，差異均無統計學意義（Pgt;0.05）。第28天實驗結束后，空白組與第1天造模開始前的一般狀態無差異。哮喘組小鼠皮毛缺少光澤，活動反應緩慢，抓取反抗一般，呼吸明顯急促伴有哮鳴音，與空白組比較一般狀況評分顯著升高（Plt;0.01）。哮喘肝郁組皮毛枯槁無光澤，精神萎靡，喜扎堆不動，抓取無反抗，點頭樣淺表呼吸，與空白組比較一般狀況評分顯著升高（Plt;0.01）;與哮喘組比較一般狀況評分有所升高，但差異無統計學意義（Pgt;0.05）。與哮喘肝郁組比較，布地奈德組及柴樸湯組小鼠一般狀況均顯著改善，一般狀況評分均降低（Plt;0.01）。與布地奈德組比較，柴樸湯組一般狀況評分有所下降，但差異無統計學意義（Pgt;0.05）。詳見表1。

3.2" 各組小鼠體質量比較

第1天造模開始前，各組小鼠的體質量比較，差異均無統計學意義（Pgt;0.05）。第28天實驗結束后，與空白組比較，哮喘組體質量稍有下降，但差異無統計學意義（Pgt;0.05）。與空白組及哮喘組比較，哮喘肝郁組體質量明顯下降（Plt;0.01）。與哮喘肝郁組比較，布地奈德組、柴樸湯組體質量顯著增加（Plt;0.01）。與布地奈德組比較，柴樸湯組體質量增加（Plt;0.05）。詳見表2。

3.3" 各組小鼠糖水偏好指數比較

第1天造模開始前，各組小鼠的糖水偏好指數比較，差異均無統計學意義（Pgt;0.05）。第28天實驗結束后，與空白組比較，哮喘組糖水偏好指數稍下降，但差異無統計學意義（Pgt;0.05）。與空白組及哮喘組比較，哮喘肝郁組糖水偏好指數明顯下降（Plt;0.01）。與哮喘肝郁組比較，柴樸湯組糖水偏好指數明顯增加（Plt;0.01）。與布地奈德組比較，柴樸湯組糖水偏好指數增加（Plt;0.05）。詳見表3。

3.4" 各組小鼠游泳不動時間比較

第1天造模開始前，各組小鼠的游泳不動時間比較，差異均無統計學意義（Pgt;0.05）。第28天實驗結束后，與空白組比較，哮喘組游泳不動時間稍增加，但差異無統計學意義（Pgt;0.05）。與空白組及哮喘組比較，哮喘肝郁組游泳不動時間明顯增加（Plt;0.01）。與哮喘肝郁組比較，布地奈德組及柴樸湯組游泳不動時間均明顯降低（Plt;0.01）。與布地奈德組比較，柴樸湯組游泳不動時間降低（Plt;0.05）。詳見表4。

3.5" 各組小鼠肺功能指標比較

與空白組比較，哮喘組與哮喘肝郁組小鼠FVC及PEF顯著下降（Plt;0.01），RL顯著升高（Plt;0.01）;與哮喘組比較，哮喘肝郁組FVC及PEF顯著下降（Plt;0.01）;與哮喘肝郁組比較，布地奈德組及柴樸湯組FVC及PEF明顯增加（Plt;0.01），RL明顯下降（Plt;0.01）。詳見表5。

3.6" 各組小鼠血清ACTH、IL-6比較

與空白組比較，哮喘組和哮喘肝郁組ACTH及IL-6均顯著升高（Plt;0.01）;與哮喘組比較，哮喘肝郁組ACTH及IL-6均顯著升高（Plt;0.01）;與哮喘肝郁組比較，布地奈德組IL-6明顯下降（Plt;0.01），柴樸湯組ACTH及IL-6均明顯下降（Plt;0.01）。詳見表6。

3.7" 各組小鼠病理學觀察結果

小鼠HE染色結果顯示：空白組小鼠肺組織中肺泡結構完整，肺泡間隔較薄，肺組織形態正常，無明顯炎癥細胞浸潤，組織結構清晰，未見明顯病理性改變;哮喘組小鼠肺組織可見明顯的氣道壁增厚、平滑肌層增生，伴隨大量炎癥細胞浸潤，肺泡腔縮小，部分區域出現炎性浸潤和黏液堆積;與哮喘組相比，哮喘肝郁組的氣道壁增厚更加明顯，平滑肌層顯著增生，炎癥細胞浸潤更加嚴重，伴有明顯的黏液堆積，肺組織結構受損，表現出更為嚴重的病理改變;布地奈德組小鼠氣道壁增厚和平滑肌增生有所減輕，炎癥細胞浸潤減少，肺泡結構較為完整，病理性損傷較哮喘組和哮喘肝郁組有所改善;與布地奈德組比較，柴樸湯組氣道壁和平滑肌層增生明顯減輕，炎癥細胞浸潤減少。詳見圖1。

小鼠Masson染色結果顯示：空白組小鼠肺組織肺泡結構完整，氣道壁薄，肺泡間隔無明顯膠原纖維沉積，組織結構正常;哮喘組小鼠肺組織中氣道壁增厚，周圍有較明顯的膠原纖維沉積，表現為藍色染色加深，尤其是在氣道周圍和平滑肌層，肺組織出現纖維化特征，提示氣道重塑和纖維化;與哮喘組相比，哮喘肝郁組的氣道壁增厚更顯著，平滑肌增生更加嚴重，氣道周圍的膠原纖維沉積顯著增加，藍色染色區域擴展，纖維化程度加重，顯示出更明顯的病理改變;與哮喘肝郁組相比，布地奈德組氣道壁厚度有所降低，膠原纖維沉積減少，氣道平滑肌增生有所緩解，藍色染色區域縮小，纖維化程度得到一定改善;與布地奈德組相比，柴樸湯組的肺組織結構進一步改善，氣道壁厚度顯著降低，膠原纖維沉積顯著減少，藍色染色區域較少。詳見圖2。

4 討論

哮喘是一個全球范圍內的公共衛生問題，其患病率逐年上升，嚴重影響患者的生活質量[10]。隨著現代社會生活節奏的加快和工作壓力的增加，情志因素在哮喘發病中的作用逐漸受到關注。研究表明，心理壓力可通過神經內分泌和免疫系統的變化，影響哮喘的發展并加重哮喘癥狀[11-12]。中醫學認為，肝主疏泄，調暢情志，性喜條達而惡抑郁。肝失條達，疏泄失司，則氣機郁滯，津液輸布不利，凝聚成痰，使肺氣宣降失司，肺氣上逆，發為哮喘。臨床上哮喘患者經中醫辨證為肝郁證的比例較高，如一項對305例哮喘急性發作患者的研究中，辨證為肝郁證的患者占68.2%[13]。在另一項對110例哮喘患兒的研究中，肝郁證患兒的比例達33.64%[14]。然而，目前尚無公認的哮喘肝郁證動物模型制備方案，且缺乏標準化的造模評價指標，限制了對該病證結合機制的深入研究。

國內外研究中常使用小鼠、大鼠和豚鼠來建立哮喘模型，其中小鼠，尤其是C57BL/6小鼠，由于其免疫遺傳背景清楚、品系單純、對致敏因子敏感，被廣泛應用于哮喘研究[15]。此外，C57BL/6小鼠對CUMS反應敏感[16]，是肝郁證模型研究的首選品系。肝郁證以情志抑郁為主要表現，臨床上常以女性為主。既往研究顯示，雌性小鼠更容易出現抑郁樣的負面情緒，對慢性應激比雄性小鼠更敏感[17]。因此，本實驗選擇C57BL/6雌性小鼠作為研究對象。在既往研究中，哮喘動物模型通常通過卵清蛋白與氫氧化鋁聯合使用進行致敏，但這種方法與臨床哮喘發病的實際情況并不一致。HDM是哮喘患者中最常見的過敏原之一，約85%的患者對其過敏[18-19]。因此，在哮喘動物造模中使用HDM能夠更好地模擬臨床哮喘的過敏性反應。在哮喘模型基礎上，為更好地模擬肝郁證狀態，通常采用慢性束縛法[20]或CUMS法[2-3]進行肝郁證造模。肝郁證多因情志抑郁，所思不遂而引起，在制作肝郁證動物模型時，采用慢性束縛限制動物活動是有效的造模手段[21]。但是，連續使用單一的慢性束縛方法會導致小鼠產生耐受性[20]。相比之下，CUMS方法更為合適，因為其應激因子強度較低，能夠長期應用，更加符合肝郁證的發病機制[22]。本研究通過聯合使用HDM滴鼻和CUMS構建哮喘肝郁證病證結合的小鼠模型，成功模擬了哮喘肝郁證的病理狀態。哮喘組表現出皮毛無光澤、活動減弱和呼吸急促等典型哮喘癥狀，而哮喘肝郁組小鼠表現出更為明顯的情緒抑郁、活動減少等肝郁癥狀。與空白組和哮喘組相比，哮喘肝郁組小鼠一般狀況評分顯著增加，說明本研究所采用的造模方法可以有效模擬哮喘肝郁證的病理特征，為后續干預措施的效果評價提供了可靠的動物模型。

柴樸湯是本課題組長期研究用于治療哮喘的中藥復方，由小柴胡湯（出自《傷寒論·辨太陽病脈證并治》）和半夏厚樸湯（出自《金匱要略·婦人雜病脈證并治第二十二》）組成，其功效為疏肝行氣解郁、理肺化痰平喘，從中醫“以方測證”的角度分析，柴樸湯適用于哮喘肝郁證。本研究結果表明，與哮喘組比較，哮喘肝郁組一般狀態、肺功能及肺組織病理形態更差，體質量及糖水偏好指數均減少，游泳不動時間延長，血清ACTH及IL-6均增加。柴樸湯干預可有效改善構建的哮喘肝郁證模型小鼠的一般狀況、體質量、糖水偏好指數、游泳不動時間、肺功能及肺組織病理損傷，血清ACTH及IL-6明顯下降。且柴樸湯組在改善小鼠體質量、糖水偏好指數及游泳不動時間方面均優于布地奈德組。從中醫證候治療方面反證小鼠哮喘肝郁證動物模型構建成功。本研究采用HE和Masson染色對小鼠肺組織進行病理學觀察，結果顯示，哮喘和哮喘肝郁小鼠的氣道壁增厚、平滑肌層增生，并伴隨大量炎癥細胞浸潤及膠原纖維沉積，提示存在顯著的哮喘樣病變。而柴樸湯組小鼠的肺組織結構接近正常，氣道壁和平滑肌層增生顯著減輕，炎癥細胞浸潤及膠原纖維沉積減少，提示柴樸湯對哮喘肝郁證小鼠的氣道炎癥及氣道重塑具有顯著的改善作用。

綜上所述，本研究構建的哮喘肝郁證模型具備“病”“證”特點，通過對小鼠一般狀況的觀察，同時結合體質量、糖水偏好指數、游泳不動時間、肺功能指標、血清ACTH及IL-6、小鼠肺組織病理形態，以及以方測證多方面評價哮喘肝郁證模型構建成功。但是本研究也存在不足，對于哮喘肝郁證有代表性的檢測指標僅考慮了文獻報道相關的ACTH[23]與IL-6[24]，這兩個指標是否是哮喘肝郁證有別于哮喘其他證型的典型指標尚不清楚，仍需要進一步研究。基因組學、轉錄組學、蛋白質組學及代謝組學等技術，為研究哮喘肝郁證有別于其他證型的典型指標提供了更多手段和方法，希冀通過繼續研究不斷優化造模方案及評價指標，構建更加符合中西醫臨床病證特點的哮喘肝郁證動物模型。

參考文獻

[1] LIU T， WOODRUFF P G， ZHOU X B. Advances in non-type 2 severe asthma： From molecular insights to novel treatment strategies[J]. European Respiratory Journal， 2024， 64（2）： 2300826.

[2] 鄭鑫鎣， 劉" 巍， 吳曉玲， 等. 肝郁型哮喘小鼠模型MAL、CADM1、IL-6、IL-8、IL-33、TSLP、STAT3表達的實驗研究[J]. 湖南中醫雜志， 2022， 38（2）： 169-173.

[3] 劉" 鑫， 劉姿琴， 楊蘇琴， 等. 柴樸湯對肝郁型哮喘小鼠CADM1、MAL、IL-33、TSLP表達的影響[J]. 中南醫學科學雜志， 2021， 49（5）： 502-505.

[4] WOO L N， GUO W Y， WANG X， et al. A 4-week model of house dust mite （HDM） induced allergic airways inflammation with airway remodeling[J]. Scientific Reports， 2018， 8（1）： 6925.

[5] LI H N， XIANG Y J， ZHU Z M， et al. Rifaximin-mediated gut microbiota regulation modulates the function of microglia and protects against CUMS-induced depression-like behaviors in adolescent rat[J]. Journal of Neuroinflammation， 2021， 18（1）： 254.

[6] 魏" 偉， 吳希美， 李元建. 藥理實驗方法學[M]. 4版. 北京： 人民衛生出版社， 2010： 70-71.

[7] 武國宇. 布地奈德吸入給藥對慢性支氣管哮喘小鼠HpARIh/STAT信號通路的影響[J]. 現代藥物與臨床， 2020， 35（12）： 2307-2311.

[8] 劉萌萌， 路" 靜， 李唯嘉， 等. 3種抑郁癥大鼠模型代謝組學的比較[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2024， 30（16）： 149-159.

[9] 王孟迪， 姚勤偉， 薛" 濤， 等. 3種抗抑郁中藥方作用比較研究[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2021， 41（9）： 1327-1333.

[10] CLOUTIER M M， DIXON A E， KRISHNAN J A， et al. Managing asthma in adolescents and adults： 2020 asthma guideline update from the national asthma education and prevention program[J]. JAMA， 2020， 324（22）： 2301-2317.

[11] MIYASAKA T， DOBASHI-OKUYAMA K， TAKAHASHI T， et al. The interplay between neuroendocrine activity and psychological stress-induced exacerbation of allergic asthma[J]. Allergology International， 2018， 67（1）： 32-42.

[12] OHNO I. Neuropsychiatry phenotype in asthma： Psychological stress-induced alterations of the neuroendocrine-immune system in allergic airway inflammation[J]. Allergology International， 2017， 66： S2-S8.

[13] 楊惠琴， 呂全勝， 王" 玲， 等. 新疆烏魯木齊地區305例支氣管哮喘患者的中醫證型分布規律[J]. 新疆中醫藥， 2013， 31（6）： 111-112.

[14] 葉" 進， 王憶勤， 李福鳳， 等. 肝郁型哮喘兒童心理行為問題調查[J]. 上海中醫藥雜志， 2002， 36（6）： 22-24.

[15] 吳" 瑞， 李秀敏， 苗明三. 基于中西醫臨床病證特點的哮喘動物模型分析[J]. 中藥藥理與臨床， 2020， 36（2）： 253-257.

[16] 楊一帆， 王" 豆， 李" 濤， 等. 慢性不可預知溫和刺激抑郁模型及其評價指標的研究進展[J]. 山東醫藥， 2021， 61（25）： 96-99.

[17] 張" 婷. 小膠質細胞在慢性應激誘發小鼠抑郁樣行為性別差異中的作用及機制研究[D]. 上海： 中國人民解放軍海軍軍醫大學， 2023.

[18] ALVAREZ-SIMON D， AIT YAHIA S， AUDOUSSET C， et al. Local receptor-interacting protein kinase 2 inhibition mitigates house dust mite-induced asthma[J]. European Respiratory Journal， 2024， 64（4）： 2302288.

[19] 解立旭， 馮旰珠. 重度哮喘小鼠模型的建立方法及實驗應用[J]. 中華結核和呼吸雜志， 2022， 45（5）： 514-518.

[20] 胡" 駿， 鄭" 紅， 沈" 慧， 等. 基于病證結合方證對應理論研究肝郁證哮喘模型的尿液代謝組學表征[J]. 華夏醫學， 2017， 30（6）： 7-12.

[21] 張曉龍. 肝郁證動物模型實驗研究評述[J]. 中醫學報， 2016， 31（3）： 398-401.

[22] LI X J， QIU W Q， DA X L， et al. A combination of depression and liver Qi stagnation and spleen deficiency syndrome using a rat model[J]. Anatomical Record， 2020， 303（8）： 2154-2167.

[23] 金光亮， 南" 睿， 郭霞珍. 慢性應激肝郁證大鼠模型的建立[J]. 北京中醫藥大學學報， 2003， 26（2）： 18-21.

[24] 錢" 夢， 謝" 鳴， 張媛鳳， 等. 肝郁證雌雄大鼠神經-內分泌變化的比較[J]. 北京中醫藥大學學報， 2019， 42（7）： 549-554.

（本文編輯" 周" 旦）