基于APLN/PI3K/Akt信號通路探討柴胡疏肝散加減對三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響

〔摘要〕 目的 基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序探究柴胡疏肝散加減含藥血清通過愛帕琳肽（APLN）/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響。方法 采用SD大鼠制備柴胡疏肝散加減含藥血清和對照血清。不同比例對照血清和含藥血清干預(yù)MDA-MB-231細(xì)胞24 h，通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力，篩選最佳比例;采用轉(zhuǎn)錄組測序分析對照血清組和含藥血清組細(xì)胞中差異表達基因和信號通路。將APLN siRNA或過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以敲低或過表達APLN;采用CCK-8法、劃痕與Transwell侵襲實驗分別檢測含藥血清聯(lián)合APLN敲低或過表達干預(yù)后細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力;采用RT-PCR以及Western blot法分別檢測APLN、PI3K、Akt基因與蛋白的表達情況。結(jié)果 與對照血清組比較，含藥血清組中細(xì)胞的增殖活力、遷移與侵襲能力降低（Plt;0.05）。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，相對于對照血清組，含藥血清組中上調(diào)116個基因，下調(diào)66個基因;這些差異基因主要富集于PI3K/Akt、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等腫瘤相關(guān)的信號通路。在Top30差異基因中，含藥血清降低APLN基因和蛋白的表達（Plt;0.05），并抑制APLN下游PI3K/Akt信號通路的激活（Plt;0.05）;APLN敲低進一步增強含藥血清對細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及PI3K/Akt通路激活的抑制作用（Plt;0.05），而APLN過表達則削弱了含藥血清的上述作用（Plt;0.05）。結(jié)論 柴胡疏肝散加減含藥血清可通過負(fù)調(diào)控APLN的表達拮抗PI3K/Akt信號通路的激活來抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，以達到抗癌的療效。

〔關(guān)鍵詞〕 柴胡疏肝散加減;三陰性乳腺癌;APLN/PI3K/Akt信號通路;增殖;遷移;侵襲

〔中圖分類號〕R285.5"""""""" 〔文獻標(biāo)志碼〕A""""""""" 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.02.006

〔收稿日期〕2024-09-19

〔基金項目〕無錫市衛(wèi)生健康委員會重點項目（Z202203）。

〔通信作者〕*蔣立新，男，教授，主任中醫(yī)師，E-mail：15961665000@163.com。

Effects of modified Chaihu Shugan Powder on proliferation， migration， and invasion of triple-negative breast cancer cells based on APLN/PI3K/Akt signaling pathway

ZHU Sixun1， YAO Chang2， YANG Jing1， SU Bin1， ZHAO Qianxin1， JIANG Lixin1*

1. Department of Breast Surgery， Jiangyin Hospital of Chinese Medicine， Wuxi， Jiangsu 214400， China; 2. Department of Breast Surgery， Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine， Nanjing， Jiangsu 210000， China

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of modified Chaihu Shugan Powder medicated serum on proliferation， migration， and invasion of triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells through the APLN/PI3K/Akt signaling pathway based on transcriptome sequencing. Methods SD rats were used to prepare modified Chaihu Shugan Powder medicated serum and control serum. MDA-MB-231 cells were treated with different proportions of control and medicated serums for 24 h. Cellular proliferation activity was assessed using the CCK-8 assay to determine the optimal proportion. Transcriptome sequencing was employed to analyze differentially expressed genes and signaling pathways in cells from the control serum group and the medicated serum group. Cells were transfected with APLN siRNA or overexpression plasmid to knock down or overexpress APLN. The CCK-8 assay， wound healing assay， and Transwell invasion assay were used to check cellular proliferation， migration， and invasion abilities， respectively， after intervention with the medicated serum combined with APLN knockdown or overexpression. RT-PCR and Western blot were utilized to determine the expressions of APLN， PI3K， and Akt genes and proteins. Results Compared with the control serum group， the cellular proliferation activity， migration， and invasion abilities in the medicated serum group decreased （Plt;0.05）. Transcriptomic results showed that， compared with the control serum group， 116 genes were significantly upregulated and 66 genes were downregulated in the medicated serum group. These differential genes were primarily enriched in tumor-related signaling pathways such as PI3K/Akt and mitogen-activated protein kinase （MAPK）. Among the top 30 differential genes， the medicated serum reduced the expressions of APLN gene and protein （Plt;0.05） and inhibited the activation of the APLN downstream PI3K/Akt signaling pathway （Plt;0.05）. APLN knockdown further enhanced the inhibitory effects of the medicated serum on cell proliferation， migration， invasion， and PI3K/Akt pathway activation （Plt;0.05）， whereas APLN overexpression attenuated these effects of the medicated serum （Plt;0.05）. Conclusion The modified Chaihu Shugan Powder medicated serum can inhibit the proliferation， migration， and invasion of triple-negative breast cancer cells by negatively regulating APLN expression， thereby antagonizing the activation of PI3K/Akt signaling pathway and exerting anti-cancer effects.

〔Keywords〕 modified Chaihu Shugan Powder medicated serum; triple-negative breast cancer; APLN/PI3K/Akt signaling pathway; proliferation; migration; invasion

本文引用： 朱思洵， 姚" 昶， 楊" 靜， 蘇" 彬， 趙倩馨， 蔣立新. 基于APLN/PI3K/Akt信號通路探討柴胡疏肝散加減對三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2025， 45（2）： 228-238.

乳腺癌是婦科最常見的癌癥，也是全球癌癥死亡的主要原因之一[1]。三陰性乳腺癌（triple-negative

breast cancer，TNBC）作為一種特殊的乳腺癌亞型，占乳腺癌的15%～20%[2]。由于TNBC分化差，侵襲性強，預(yù)后易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。TNBC缺乏相關(guān)受體標(biāo)記物，致使患者很難進行靶向治療。接受化學(xué)治療的患者，只有不到30%的有治療效果，但復(fù)發(fā)率和死亡率仍高于非TNBC亞型[3]。因此，開發(fā)新的治療藥物，探尋其作用機制，對TNBC治療具有重要意義。

中藥復(fù)方因其具有改善腫瘤癥狀、緩解放化學(xué)治療不適、提高患者生存質(zhì)量等優(yōu)勢，成為腫瘤輔助治療的有效方法[4-5]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，TNBC主要分為肝郁氣滯、痰瘀互結(jié)、氣血兩虛等類型，其治療應(yīng)從疏肝理氣、活血化瘀、補氣養(yǎng)血著手[6]。柴胡疏肝散源于《景岳全書》，具有疏肝理氣、活血止痛等功效，符合TNBC治療之策。最近一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散加減聯(lián)合阿霉素-環(huán)磷酰胺（adriamycin-cyclophosphamide，AC）方案和紫杉醇治療晚期乳腺癌患者可提高客觀緩解率，降低中醫(yī)證候積分，比單純AC方案和紫杉醇治療更佳[7]。此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散可能通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad等信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、周期等細(xì)胞功能治療乳腺癌[8]，但具體機制有待進一步研究。

本課題組在柴胡疏肝散原方上加入黃芪、浙貝母、半邊蓮、鬼針草、夏枯草，形成柴胡疏肝散加減方劑（命名回春方）。黃芪具有益氣扶正之效，鬼針草具有清熱散瘀之效，浙貝母、半邊蓮、夏枯草具有散結(jié)、除瘤、排毒之效，柴胡疏肝散加減有望在TNBC上起到更好的治療效果，但其內(nèi)在機制需要初步探究。因此，本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序探究柴胡疏肝散加減含藥血清通過愛帕琳肽（apelin，APLN）/PI3K/Akt信號通路對MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響，揭示其治療乳腺癌的作用機制，為柴胡疏肝散加減治療TNBC提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1" 實驗動物與細(xì)胞

SPF級雄SD大鼠10只，8周齡，體質(zhì)量200～220 g，由斯貝福（蘇州）生物技術(shù)股份有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2022-0006，飼養(yǎng)于實驗動物中心。動物飼養(yǎng)條件為溫度（23±3） ℃，相對濕度50%～70%，12 h/12 h晝夜循環(huán)，常規(guī)飲食。MDA-MB-231細(xì)胞購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司（以下簡稱凱基生物），批號：KGG3220-1。

1.2" 主要藥物及試劑

柴胡疏肝散加減中北柴胡（批號：2301764101）、醋香附（批號：2205018101）、川芎（批號：2208323101）、枳殼（批號：2207120101）、芍藥（批號：2112177101）、橘絡(luò)（批號：21030781）、甘草（批號：2301226101）、黃芪（批號：2301088101）、浙貝母（批號：2301526101）、半邊蓮（批號：2201429101）、鬼針草（批號：230116015）、夏枯草（批號：2203008101）均購自蘇州市天靈中藥飲片有限公司。

Leibovitz's L-15培養(yǎng)基（含雙抗）（批號：KGL1801-500）、胰酶消化液（批號：KGL2102-100）、CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒（批號：KGA9306-1000）、DEPC水（批號：KGF2201-100）、GAPDH抗體（批號：KGC6102-1）、羊抗兔IgG-HRP（批號：KGC6202-0.1）、羊抗小鼠IgG-HRP（批號：KGC6203-0.1）、基質(zhì)膠（批號：KGL5101-1）、結(jié)晶紫染色液（批號：KGE1202-100）、KeygenMAX 3000轉(zhuǎn)染試劑（批號：KGA9705-1.5）、全蛋白提取試劑盒（批號：KGB5303-100）、BCA蛋白含量檢測試劑盒（批號：KGB2101-250）均購自凱基生物;胎牛血清（批號：10099-141，美國Gibco公司）;異丙醇（批號：67-63-0）、氯仿（批號：67-66-3）、無水乙醇（批號：64-17-5）均購自南京化學(xué)試劑有限公司;cDNA第一鏈合成試劑盒（批號：RR036B）、TB Green Premix Ex Taq II（批號：RR820A），均購自日本TaKaRa公司;TRIzol（批號：15596-026，美國Invitrogen公司）;APLN（批號：sc-293441，美國Santa Cruz Biotechnology公司）;PI3K抗體（批號：ab191606）、Akt抗體（批號：ab179463）、p-Akt抗體（批號：ab81283）均購自英國Abcam公司;p-PI3K抗體（批號：AF3241，江蘇親科生物研究中心有限公司）。

1.3" 主要儀器

超凈工作臺（型號：SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）;紫外光度儀（型號：UV-2450，日本Shimadzu公司）;熒光定量PCR循環(huán)儀（型號：7500，美國ABI公司）;高速冷凍離心機（型號：SorvallTM ST16R，美國Thermo Fisher Scientific公司）;生物倒置顯微鏡（型號：IX51，日本OLYMPUS公司）;酶標(biāo)儀（型號：ELx800，美國BioTek公司）;PCR儀（型號：Veriti 96 well Thermal cycler，美國ABI公司）。

2 方法

2.1" 柴胡疏肝散加減含藥血清的制備

柴胡疏肝散加減由北柴胡6 g、醋香附10 g、川芎3 g、枳殼6 g、芍藥15 g、橘絡(luò)10 g、甘草3 g、黃芪20 g、浙貝母10 g、半邊蓮30 g、鬼針草10 g、夏枯草15 g組成，統(tǒng)一煎煮3次，每次45 min。篩網(wǎng)濾掉殘渣，收集3次藥液合并，經(jīng)濃縮為0.75 g/mL柴胡疏肝散加減濃縮液。過濾除菌后，分裝，-20 ℃保存，避免反復(fù)凍融。10只大鼠適應(yīng)1周后，隨機分為含藥血清組和對照血清組，每組5只。根據(jù)人與大鼠藥物劑量換算系數(shù)[9]，含藥血清組大鼠給予12 g/kg灌胃，對照血清組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃7 d，末次灌胃2 h后CO2麻醉，股動脈取血。全血低溫靜置2～4 h后，3 000 g、4 ℃離心30 min。取上清液，56 ℃滅活30 min，0.22 μm過濾除菌，超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2" 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組

MDA-MB-231細(xì)胞用含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2～3 d換液一次。首先用不同比例（0、0.5%、1%、2%、4%、8%、16%、32%）的對照血清和柴胡疏肝散加減含藥血清分別干預(yù)MDA-MB-231細(xì)胞24 h，篩選最佳干預(yù)比例。APLN siRNA（si-APLN，正向：5'-GCCCAGAGGGUCAAGGAAUTT-3';反義鏈：5'-AUUCCUUGACCCUCUGGGCTT-3'）、siRNA陰性對照（si-NC，正義鏈：5'-UUCUCCGAACG?UGUCACGUTT-3';反向：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'）、APLN過表達質(zhì)粒（oe-APLN）以及過表達空質(zhì)粒pcDNA3.1（+）（oe-NC）由凱基生物構(gòu)建。APLN過表達質(zhì)粒構(gòu)建主要步驟如下：通過National Center for Biotechnology Information （NCBI）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站獲得APLN編碼區(qū)序列（coding sequence，CDS），PCR擴增目的片段，利用EcoRI和BamHI雙酶切pcDNA3.1（+）質(zhì)粒和目的片段，T4連接酶連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、單克隆菌落篩選與鑒定、質(zhì)粒抽提等步驟獲得pcDNA3.1（+）-APLN融合質(zhì)粒，即oe-APLN。

為驗證APLN基因敲低和過表達效率，將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞隨機分為五組：對照組、si-NC組、si-APLN組、oe-NC組、oe-APLN組。si-NC、si-APLN、oe-NC或oe-APLN通過KeygenMAX 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞。48 h后，進行RT-PCR檢測。

另將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞隨機分成6組：對照血清組、柴胡疏肝散加減含藥血清組（含藥血清組）、柴胡疏肝散加減含藥血清聯(lián)合siRNA陰性對照組（含藥血清+si-NC組）、柴胡疏肝散加減含藥血清聯(lián)合APLN敲低組（含藥血清+si-APLN）、柴胡疏肝散加減含藥血清聯(lián)合過表達陰性對照組（含藥血清+oe-NC組）以及柴胡疏肝散加減含藥血清聯(lián)合APLN過表達組（含藥血清+oe-APLN組）。采用KeygenMAX 3000轉(zhuǎn)染試劑分別將si-NC、si-APLN、oe-NC、oe-APLN轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，用10%柴胡疏肝散加減含藥血清繼續(xù)干預(yù)24 h。收集細(xì)胞，用于后續(xù)檢測。

2.3" CCK-8檢測細(xì)胞的增殖活力

將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞消化、收集細(xì)胞，不完全培養(yǎng)基重懸。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液（5×104個/mL）。根據(jù)分組干預(yù)后，每孔加入10 μL的CCK-8反應(yīng)液，37 ℃孵育2 h，搖床上輕輕混勻，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔吸光度值。根據(jù)吸光度值計算各組細(xì)胞抑制率。

2.4" 轉(zhuǎn)錄組測序檢測細(xì)胞中基因表達情況

轉(zhuǎn)錄組測序于南京派森諾基因科技有限公司進行。主要步驟如下：對照血清組（control）和10%柴胡疏肝散加減含藥血清組（CSS）中MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)RNA提取、Oligo（dT）磁珠富集總RNA、mRNA片段化、反轉(zhuǎn)錄cDNA、cDNA文庫構(gòu)建等步驟后，通過Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫進行質(zhì)檢。質(zhì)檢合格后，采用基于Illumina測序平臺的第二代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）對文庫進行測序。原始下機數(shù)據(jù)過濾后，比對到人的參考基因組上。根據(jù)比對結(jié)果，計算每個基因的表達量。在此基礎(chǔ)上，進一步對樣品進行基因表達差異分析、聚類分析以及GO和KEGG富集分析。

2.5" 劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移能力

將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞接種到6孔板中。待細(xì)胞融合度達80%左右，用200 μL無菌槍頭在6孔板中劃2條平行直線。PBS洗去懸浮細(xì)胞，按照分組進行干預(yù)。分別于培養(yǎng)0 h和24 h置于倒置顯微鏡下（放大100倍）拍照，測量0 h和24 h細(xì)胞劃痕寬度，統(tǒng)計細(xì)胞相對遷移距離。

2.6" Transwell檢測細(xì)胞的侵襲能力

將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞消化接種到6孔板中，按分組處理細(xì)胞。細(xì)胞消化離心，于無血清培養(yǎng)中重懸。將4 ℃預(yù)冷的基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基稀釋6倍，加入Transwell上室，鋪滿小室底部。37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1～3 h。將重懸的細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整密度為5×104個/mL。取100 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室，下室加入500 μL含20% FBS的培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell小室，用棉簽將上室中未侵襲的細(xì)胞去除，晾干。下室加入500 μL結(jié)晶紫（4%多聚甲醛配制），放入小室染色30 min。PBS清洗，隨機選擇視野拍照（放大200倍）、計數(shù)。

2.7" RT-PCR檢測細(xì)胞中APLN、PIK3C3與Akt mRNA表達情況

根據(jù)產(chǎn)品說明書，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，并用紫外光度儀測定總RNA的濃度和純度。使用cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過NCBI設(shè)計基因特異性引物，并由凱基生物合成。以GAPDH作為內(nèi)參基因。采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ和熒光定量PCR循環(huán)儀進行定量分析。PCR反應(yīng)程序為95 ℃，5 min;95 ℃，15 s;60 ℃，20 s;72 ℃，40 s;共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。APLN、PIK3C3與Akt引物序列見表1。

2.8" Western blot檢測細(xì)胞中APLN、磷酸化PI3K、磷酸化Akt蛋白表達情況

使用全蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞中總蛋白，并采用BCA蛋白含量檢測試劑盒檢測總蛋白含量。蛋白變性后于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中分離目的蛋白，并通過轉(zhuǎn)膜將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。5%牛血清白蛋白溶液封閉1～2 h，1×TBST中漂洗2～3次。加入一抗過夜孵育，二抗37 ℃孵育1～2 h，ECL顯色。使用ChemiDoc MP Imaging System成像。使用ImageJ軟件對結(jié)果進行灰度分析。

2.9" 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用t檢驗進行兩組間比較，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行多組比較，并通過LSD方法進行事后比較。數(shù)據(jù)以“x±s”表示，Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPad Prism 9.0軟件作圖。

3 結(jié)果

3.1" 柴胡疏肝散加減含藥血清對MDA-MB-231細(xì)胞增殖活力的影響

與對照血清組比較，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖活力呈柴胡疏肝散加減含藥血清濃度依賴性遞減，其中10%柴胡疏肝散加減含藥血清對MDA-MB-231細(xì)胞增殖活力的抑制率達20%，具有顯著抑制效果。因此，選擇10%含藥血清干預(yù)MDA-MB-231細(xì)胞。詳見圖1。

3.2" 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

3.2.1nbsp; 火山圖和聚類熱圖" 采用DESeq對對照血清組和柴胡疏肝散加減含藥血清組細(xì)胞中基因表達進行差異分析，篩選條件為：|log2（Fold change）|gt;1，顯著性Plt;0.05?；鹕綀D顯示，與對照血清組比較，柴胡疏肝散加減含藥血清組細(xì)胞中有116個基因顯著上調(diào)，66個基因顯著下調(diào)（圖2A）。聚類熱圖顯示，差異基因表達量在組內(nèi)重復(fù)性較好，組間差異顯著（圖2B）。

3.2.2" 差異表達基因的GO富集分析" 為了探究柴胡疏肝散加減含藥血清對MDA-MB-231細(xì)胞中差異表達基因主要生物學(xué)功能的影響，采用GO富集分析揭示其生物學(xué)功能。GO富集分析按功能分成3個部分：細(xì)胞組分（cell component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過程（biological process，BP）。在CC中，差異基因主要富集于CCAAT增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT enhance-binding protein homologous protein，CHOP）-激活轉(zhuǎn)錄因子3（activated transcriptional factor 3，ATF3）復(fù)合物、基底外質(zhì)膜等;在MF中，差異基因主要富集于DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、過渡金屬離子結(jié)合等;在BP中，差異基因主要富集于組織發(fā)育、動物器官發(fā)育、上皮細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)等。詳見圖3。

3.2.3" 差異表達基因的KEGG富集分析" KEGG富集分析顯示兩組間差異基因主要富集于PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、環(huán)磷酸腺苷信號通路等。PI3K/Akt、MAPK是經(jīng)典的腫瘤信號通路，提示柴胡疏肝散加減含藥血清可能通過PI3K/Akt與MAPK信號通路抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖活力。詳見圖4。

3.2.4" 柴胡疏肝散加減含藥血清調(diào)控的關(guān)鍵靶點篩選" 柴胡疏肝散加減含藥血清處理后MDA-MB-231細(xì)胞中顯著上調(diào)和下調(diào)的Top30基因見表2。在這些差異基因中，柴胡疏肝散加減含藥血清顯著抑制調(diào)控PI3K/Akt信號通路的APLN基因的表達。詳見表2和圖5。

3.3" 各組MDA-MB-231細(xì)胞中APLN基因敲低和過表達驗證

與對照組相比，si-NC組中APLN mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），而si-APLN組中APLN mRNA相對表達量降低（敲低效率約80%）（Plt;0.05）。與oe-NC組相比，oe-APLN組中APLN mRNA相對表達量增加了37.45倍（37.08/0.99）（Plt;0.05）。詳見表3。

3.4" 各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖活力比較

含藥血清組中細(xì)胞增殖活力低于對照血清組（Plt;0.05）。含藥血清+si-APLN組中細(xì)胞增殖活力低于含藥含藥血清+si-NC組（Plt;0.05）;含藥血清+oe-APLN組中細(xì)胞增殖活力高于含藥含藥血清+oe-NC組（Plt;0.05），但仍低于對照血清組（Plt;0.05）。與含藥血清組比較，含藥血清+si-NC組和含藥血清+oe-NC組中細(xì)胞增殖活力差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。詳見表4。

3.5" 各組MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力

與對照血清組比較，含藥血清組、含藥血清+si-APLN組及含藥血清+oe-NC組中細(xì)胞的遷移距離均減少（Plt;0.05）;與含藥血清+si-NC組比較，含藥血清+si-APLN組中細(xì)胞的遷移距離減少（Plt;0.05）;與含藥血清+oe-NC組比較，含藥血清+oe-APLN組中細(xì)胞的遷移距離增加（Plt;0.05）;與含藥血清組比較，含藥血清+si-NC組和含藥血清+oe-NC組中細(xì)胞的遷移距離差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。詳見圖6及表5。

3.6" 各組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力

與對照血清組比較，含藥血清組、含藥血清+si-APLN組及含藥血清+oe-APLN組中細(xì)胞的侵襲數(shù)量均減少（Plt;0.05）;與含藥血清+si-NC組比較，含藥血清+si-APLN組中細(xì)胞的侵襲數(shù)量減少（Plt;0.05）;與含藥血清+oe-NC組比較，含藥血清+oe-APLN組中細(xì)胞的侵襲數(shù)量增加（Plt;0.05）;與含藥血清組比較，含藥血清+si-NC組和含藥血清+oe-NC組中細(xì)胞的侵襲數(shù)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。詳見圖7及表6。

3.7" 各組MDA-MB-231細(xì)胞中APLN、PIK3C3、Akt mRNA表達情況

與對照血清組比較，含藥血清組和含藥血清+si-APLN組細(xì)胞中APLN和PIK3C3 mRNA相對表達量均減少（Plt;0.05）;與含藥血清+si-NC組比較，含藥血清+si-APLN組細(xì)胞中APLN和PIK3C3 mRNA相對表達量減少（Plt;0.05）;與含藥血清+oe-NC組比較，含藥血清+oe-APLN組中APLN和PIK3C3 mRNA相對表達量增加（Plt;0.05）。細(xì)胞中Akt mRNA相對表達量在各組中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。詳見表7。

3.8" 各組MDA-MB-231細(xì)胞中APLN、磷酸化PI3K與磷酸化Akt蛋白表達情況

含藥血清組和含藥血清+si-APLN組細(xì)胞中APLN、PI3K、磷酸化PI3K與磷酸化Akt蛋白相對表達量低于對照血清組（Plt;0.05）。含藥血清+si-APLN組細(xì)胞中APLN、PI3K、磷酸化PI3K與磷酸化Akt蛋白相對表達量低于含藥血清+si-NC組（Plt;0.05），而含藥血清+oe-APLN組細(xì)胞中APLN、PI3K、磷酸化PI3K與磷酸化Akt蛋白相對表達量高于含藥血清+oe-NC組（Plt;0.05）。含藥血清+si-NC組和含藥血清+oe-NC組細(xì)胞中APLN、PI3K、磷酸化PI3K與磷酸化Akt蛋白相對表達量與含藥血清組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。Akt蛋白相對表達量在各組間均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。詳見圖8和表8。

4 討論

TNBC是一種高度侵襲性和異質(zhì)性的乳腺癌亞型，目前尚缺乏有效的治療方案[10]，深入研究其發(fā)病及治療機制具有重要的臨床意義[11]。我國最早對乳腺癌的描述見于晉朝的《肘后備急方》，因乳腺癌局部堅硬如石，遂稱為“乳疳”“乳巖”等。治療乳之實證，以“通”為法，應(yīng)以疏肝理氣、養(yǎng)血柔肝為治則;若肝氣郁滯，血脈失和，則發(fā)為乳巖[12-13]。因此，對于TNBC，應(yīng)從肝論治，疏肝理氣，活血化瘀是治療TNBC的基本方針[14]。

中藥因其具有顯著的抗癌性與低毒性，常用于癌癥的綜合治療[15]。柴胡疏肝散作為中醫(yī)基礎(chǔ)方，主治肝氣郁滯之證，具有疏肝理氣之效，多年來廣泛應(yīng)用于臨床[7，16]，可有效治療肝郁氣滯型乳腺癌[7，14]。柴胡疏肝散中北柴胡疏肝理氣，為君藥;枳殼理氣寬中，香附理血中之滯、川芎疏肝開郁，芍藥柔肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，芍藥配甘草，酸甘化陰，共養(yǎng)肝體，為臣藥。諸藥合用，共奏疏肝解郁之效[14]。據(jù)報道，柴胡疏肝散及其加減可對乳腺癌（包括TNBC）化學(xué)治療起到增敏作用[7，17]，其活性成分槲皮素和木犀草素可抑制TNBC細(xì)胞增殖并促進PTX化學(xué)治療敏感[17]。在本文中，柴胡疏肝散加減含藥血清抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，通過轉(zhuǎn)錄組測序揭示了對照血清組和含藥血清組細(xì)胞中差異表達基因主要富集于PI3K/Akt、MAPK等信號通路，與XIAO等[8]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示柴胡疏肝散治療乳腺癌的分子機制基本一致。

PI3K/Akt和MAPK信號通路的異常激活是導(dǎo)致TNBC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與預(yù)后不良的重要因素。許多研究探討了中藥復(fù)方通過PI3K/Akt、MAPK信號通路抑制TNBC進展。例如，乳積方作為一種傳統(tǒng)中藥復(fù)方，通過抑制PI3K/Akt通路將TNBC細(xì)胞周期阻滯于S期，進而發(fā)揮抗腫瘤作用[18];白蒲黃顆粒通過抑制MAPK信號通路誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞DNA損傷，進而抑制其增殖[19]。在本實驗中，柴胡疏肝散加減含藥血清干預(yù)后差異表達基因顯著富集于PI3K/Akt、MAPK信號通路，提示柴胡疏肝散加減含藥血清可能通過PI3K/Akt、MAPK信號通路來干預(yù)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。

APLN作為一種脂肪因子家族成員，調(diào)節(jié)多種代謝功能，如胰島素分泌、血壓、體液平衡等[20]。近年來，許多研究報道APLN參與細(xì)胞增殖、淋巴管與新血管生成等生理過程[20]，被認(rèn)為是多種癌癥治療的靶點[21-23]。在乳腺癌中，多項臨床研究顯示APLN與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期強相關(guān)，其高表達與預(yù)后不良有關(guān)[24]，提示APLN可作為乳腺癌治療的潛在靶點。此外，APLN誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖與侵襲[25]，而抑制APLN信號通路可能增加乳腺癌細(xì)胞放療敏感性[26]。APLN作為Apelin信號通路上核心成員，許多研究證實APLN激活PI3K/Akt信號通路，促進癌癥進展，如肝癌[27]、宮頸癌[28]、胰腺癌[29]等。然而，APLN對TNBC細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響尚未有研究報道。在本研究中，柴胡疏肝散加減含藥血清干預(yù)后降低MDA-MB-231細(xì)胞中APLN mRNA的表達，并抑制PI3K/Akt信號通路激活;APLN敲低進一步增強柴胡疏肝散加減含藥血清對MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及PI3K/Akt信號通路激活的抑制作用，而APLN過表達則起到相反作用，提示柴胡疏肝散加減含藥血清可通過調(diào)控APLN/PI3K/Akt信號通路抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲，為柴胡疏肝散加減干預(yù)TNBC提供了理論基礎(chǔ)和治療靶點，也為后續(xù)針對患者中APLN表達的高低開展精準(zhǔn)治療提供了可能。

綜上，柴胡疏肝散加減含藥血清對MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用可通過負(fù)調(diào)控APLN/PI3K/Akt信號通路的激活來實現(xiàn)。TNBC增殖與轉(zhuǎn)移與細(xì)胞周期調(diào)控異常相關(guān)，接下來將探究柴胡疏肝散加減是否通過調(diào)控APLN/PI3K/Akt信號通路影響細(xì)胞周期和凋亡來抑制TNBC細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。此外，本研究缺乏PI3K/Akt信號通路激動劑或抑制劑干預(yù)實驗，動物水平上也缺少柴胡疏肝散加減調(diào)控該信號通路抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的證據(jù)，有待于進一步研究。同時，柴胡疏肝散加減對TNBC患者的治療效果尚未系統(tǒng)性研究，后續(xù)將完善臨床資料收集，包括柴胡疏肝散加減單獨和聯(lián)合化學(xué)治療藥物對TNBC治療效果的相關(guān)數(shù)據(jù)，明確柴胡疏肝散加減對TNBC患者的治療和增敏作用。

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（本文編輯" 蘇" 維）