捏脊療法對孤獨癥譜系障礙大鼠不同腦區BDNF及CREB蛋白表達的影響

〔摘要〕 目的 探討捏脊療法干預孤獨癥譜系障礙（ASD）模型大鼠對其前額葉、海馬及小腦區域中腦源性神經營養因子（BDNF）、環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（CREB）表達的影響。方法 將ASD模型大鼠隨機分為模型組、捏脊組，每組6只;同時隨機選取6只正常大鼠為空白組。捏脊組在大鼠23日齡開始捏脊療法，21次/d，連續干預28 d;空白組和模型組僅模擬抓取和固定。干預結束次日完成曠場實驗，記錄活動行為數據（總路程、站立次數、理毛次數），并于曠場實驗次日取材。采用免疫組織化學法和Western blot檢測前額葉、海馬和小腦區域中BDNF及CREB蛋白表達。結果 與空白組相比，模型組活動總路程增長、站立次數減少、理毛次數增多（Plt;0.01）;與模型組相比，捏脊組活動總路程減少、站立次數增加、理毛次數減少（Plt;0.05）。與空白組比較，模型組前額葉區、海馬區、小腦區BDNF、CREB蛋白表達均減少（Plt;0.05，Plt;0.01）;與模型組比較，捏脊組前額葉區、海馬區、小腦區BDNF、CREB蛋白表達均增加（Plt;0.05，Plt;0.01）。與空白組相比，模型組前額葉區、海馬區、小腦區BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度均減少（Plt;0.05，Plt;0.01）;與模型組相比，捏脊組前額葉區、海馬區、小腦區BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度均增加（Plt;0.05，Plt;0.01）。結論 捏脊療法能夠有效改善ASD大鼠的行為表征，其作用機制可能與上調ASD大鼠前額葉、海馬、小腦區的BDNF、CREB蛋白表達水平有關。

〔關鍵詞〕 孤獨癥譜系障礙;捏脊;督脈;多腦區;腦源性神經營養因子;環磷酸腺苷反應元件結合蛋白;腦神經發育

〔中圖分類號〕R244.1"""""""" 〔文獻標志碼〕A""""""""" 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.02.009

〔收稿日期〕2024-07-11

〔基金項目〕國家自然科學基金青年項目（81704194）;福建省自然科學基金項目（2022J01366）;福建省財政廳教育和科研專項項目（x2020002-財政專項）;福建省屬公益類科研院所基本科研專項項目（2023R1003006）。

〔通信作者〕*林麗莉，女，博士，教授，博士研究生導師，E-mail：438488409@qq.com。

Effects of spine-pinching manipulation on protein expressions of BDNF and CREB in different brain regions of autistic spectrum disorder rats

TANG Qing1， HONG Yanling1， SU Lihong1， GUO Ronghui1， LIN Lili1，2*

1. School of Acupunctureamp;Moxibustion and Tuina， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou， Fujian 350122， China; 2. Fujian Academy of Chinese Medical Sciences， Fuzhou， Fujian 350001， China

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of spine-pinching manipulation on the expressions of brain derived neurotrophic factor （BDNF） and cyclic adenosine phosphate response element binding protein （CREB） in the prefrontal， hippocampal， and cerebellar regions of autism spectrum disorder （ASD） model rats. Methods The model rats with ASD were randomly divided into model group and spine-pinching manipulation group， with six rats in each group. Additionally， six normal rats were randomly selected as blank group. The spine-pinching manipulation group received spine-pinching manipulation starting from postnatal day 23， 21 times/day， for a continuous intervention of 28 days. The blank and model groups underwent simulated grasping and fixing only. The open field test was conducted the day after the intervention ended， and the activity behavior data （total distance， standing times， and grooming times） were recorded， and the samples were collected on the day after the open field test. The protein expressions of BDNF and CREB in the prefrontal， hippocampus， and cerebellar regions were checked by immunohistochemistry and Western blot. Results Compared with the blank group， the total distance of activity increased， standing times decreased， and grooming times increased in the model group （Plt;0.01）. Compared with the model group， the total distance of activity in spine-pinching manipulation group decreased， the standing times increased， and the grooming times decreased （Plt;0.05）. Compared with the blank group， the protein expressions of BDNF and CREB in the prefrontal， hippocampus， and cerebellar regions were lower in the model group （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the model group， the protein expressions of BDNF and CREB in the prefrontal， hippocampus， and cerebellar regions of the spine-pinching manipulation group increased （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the blank group， the average optical density of BDNF and CREB proteins in the prefrontal， hippocampus， and cerebellar regions of the model group decreased （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the model group， the average optical density of BDNF and CREB proteins in the prefrontal， hippocampus， and cerebellar regions of the spine-pinching manipulation group increased （Plt;0.05， Plt;0.01）. Conclusion Spine-pinching manipulation can effectively improve the behavioral characteristics of ASD rats， and its mechanism of action may be related to the upregulation of BDNF and CREB protein expressions in the prefrontal， hippocampus， and cerebellar regions of ASD rats.

〔Keywords〕 autism; spine-pinching manipulation; Du meridian; multiple brain regions; brain derived neurotrophic factor; cyclic adenosine phosphate response element binding protein; cranial nerve development

本文引用： 唐" 青， 洪燕玲， 蘇麗紅， 郭榕蕙， 林麗莉. 捏脊療法對孤獨癥譜系障礙大鼠不同腦區BDNF及CREB蛋白表達的影響[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2025， 45（2）： 259-266.

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder， ASD），又名孤獨癥，其患者具有不同程度社交障礙、溝通缺陷、狹隘興趣及刻板行為的核心特征，是一種廣泛性發育障礙，也是結合現代心理學、神經病學等相關科學的一個綜合性疾病[1]。近代腦科學研究發現，ASD患兒存在小腦、海馬、皮質等多個腦區的腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor， BDNF）、環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein， CREB）表達異常[2]。其中，BDNF是關鍵的神經營養因子，對神經元軸突和樹突生長、突觸可塑性、神經遞質釋放、學習記憶及認知功能等具有重要的調節作用[3]。CREB是BDNF介導基因表達的關鍵調節因子，BDNF通過與其特異性受體TrkB結合，引發受體的磷酸化反應，進而激活一系列第二信使傳導通路，這些通路最終指向CREB的激活，激活的CREB對受損神經元的修復過程起著促進作用，有助于改善神經細胞病理狀態，并加速神經功能缺損的恢復進程[4]。兩者在ASD患兒大腦神經發育過程中的異常，影響患兒的認知與行為功能[5-6]。

捏脊療法最早見于《肘后備急方·治卒腹痛方第九》記載：“拈取其脊骨皮深取痛引之，從龜尾至頂，乃止，未愈更為之。”其獨特之處在于醫者運用捏、拿、提等一系列手法刺激背部督脈及兩側膀胱經。其中，督脈“上至風府，入屬于腦”，又為“陽脈之?！?，主導全身陽氣運行，又為滋養腦髓、充盈髓海的重要通道，膀胱經與督脈交于頭頂，其分支“從巔入絡腦”，更有諸五臟六腑之背俞穴分布于背側膀胱經。故捏脊療法具有調理臟腑陰陽、行氣和血、培固元氣、通督榮腦等功效，是目前臨床治療小兒腦病常用的中醫外治手法之一[7]。團隊前期研究表明，捏脊療法對ASD大鼠的社交及重復刻板樣行為等具有明顯的改善效果[8]，且發現捏脊療法可上調ASD大鼠海馬區神經可塑性的相關蛋白[9]，但尚未研究該療法對多個相關腦區的同步影響。故本研究通過進一步監測抗癲癇藥丙戊酸鈉（sodium valproate， VPA）誘導的ASD模型大鼠前額葉、海馬及小腦3個腦區中BDNF、CREB蛋白表達以及其行為學變化，探討捏脊療法改善ASD大鼠行為表征的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1" 動物

本實驗選取6～8周齡、SPF級的Wistar大鼠作為實驗對象，雌雄各15只，雌性體質量范圍為180～230 g，雄性體質量為250～300 g，均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號：SYXK（閩）2019-0007，喂養于福建中醫藥大學實驗動物中心。動物飼養條件：恒定溫度（22 ℃）、濕度（50%），采用12 h光照與12 h黑暗的交替照明制度，自由攝食與飲水，普通飼料喂養。實驗已通過福建中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（倫理審批號：2022-185）。

1.2" 主要試劑與儀器

VPA（美國Sigma-Aldrich公司，批號：P4543）;即用型SABC-POD（小鼠/兔IgG）免疫組織化學染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、ECL化學發光檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：SA1020、AR1027-3、AR1191）;BCA蛋白定量試劑盒、PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物醫藥科技有限公司，批號：P0010、PG112）;一抗BDNF（美國Abcam公司，批號：Ab108319）;一抗CREB、一抗BDNF、山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：28792-1-AP、HZ-1335、SA0001-1、SA0001-2）。

曠場實驗檢測系統（上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XJ1117）;生物組織自動脫水機（亞光醫用電子技術有限公司，型號：ZT-14S1）;石蠟切片機、倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司，型號：BIOCUT、DMI8）;多功能酶標儀（瑞士Tecan公司，型號：Multifunctional Enzyme Marker）;電泳儀、ChemiDocTM成像系統（美國Bio-Rad公司，型號：Mini-PROTEAN、ChemiDoc XRS+）。

1.3" 模型制備與分組

ASD大鼠模型制備參考SCHNEIDER等[10]所采用的方法。將雌雄大鼠按照1∶1比例進行配對合籠，次日清晨對雌鼠進行檢查，一旦發現陰道栓脫落，記為孕0.5 d，并立即將雌鼠與雄鼠分開單獨飼養。根據隨機數字表法，將全部孕鼠隨機分配至造模組與空白對照組。造模組孕鼠于孕期第12.5天腹腔注射VPA溶液，劑量為600 mg/kg，對出生后的VPA模型仔鼠進行一系列發育行為學檢測（體質量、睜眼時間、方向趨向性功能測試、足底熱痛試驗、游泳試驗），篩選出符合ASD特征的個體。而空白對照組孕鼠于同期接受等體積生理鹽水注射，其產出的正常仔鼠作為空白對照。篩選合格的VPA模型仔鼠，利用隨機數字表法平均分配至模型組和捏脊組，每組6只。同時，隨機選取6只正常仔鼠作為空白組。

1.4" 干預方法

捏脊療法干預需兩名實驗人員參與，具體操作步驟為：實驗者A佩戴毛線手套以固定仔鼠頭部，而實驗者B則參照臨床捏脊療法的操作規范，以雙手拇指與食指指腹相對施力，自仔鼠尾根部沿脊中線向上捏提至大椎穴處（大鼠大椎穴位于后背正中第7頸椎與第1胸椎之間，參照唐勇主編的《實驗針灸學》[11]確定），此為1次捏脊操作。此過程需重復進行21遍，自第3遍起，每捏3次提1次?？瞻捉M和模型組僅模擬抓取固定，不進行捏脊療法。干預療程為28 d。

1.5" 曠場實驗

干預完成后進行曠場實驗。曠場箱為規格70 cm×70 cm×40 cm的黑色方形箱，確保實驗環境光線為80～100 lux且無背景噪音干擾。實驗箱上方設置相機進行錄像。實驗開始前，將待測大鼠提前1 h送入實驗室以適應環境，選擇大鼠非活躍時段（8：00—16：00）進行實驗。實驗操作時，將單只待測大鼠置于曠場箱指定位置后，記錄大鼠5 min在曠場箱內的活動行為數據（包括總路程、站立次數、理毛次數）。

1.6" 取材

曠場實驗后次日進行取材。通過腹腔注射濃度為0.3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）對大鼠進行麻醉，麻醉后沿腹中線剖開胸腔，以充分暴露心臟。隨后剪開右心耳，用生理鹽水緩慢灌注左心室，直至血液完全沖凈，肺部及其他內臟呈現蒼白。斷頭后剝離顱骨，使全腦得以充分顯露，從嗅球部位將全腦完整剝離。最后將全腦沿中線一分為二：一半置入提前預冷好的4%多聚甲醛中固定24～36 h，待進行免疫組織化學檢測;另一半則使用鑷子鈍性分離出海馬組織，利用手術刀片切取前額葉與小腦組織，迅速將組織樣本轉移至-80 ℃冰箱冷凍。

1.7" 指標檢測

1.7.1" 免疫組織化學法" 對組織進行梯度脫水、透明、透蠟、包埋、切片、撈片、攤片和烤片。將完成包埋的蠟塊取出進行切片，厚度為4 μm。再依次放入二甲苯Ⅰ（15 min）、二甲苯Ⅱ（15 min）、100%乙醇Ⅰ（5 min）、100%乙醇Ⅱ（5 min）、95%乙醇（5 min）、80%乙醇（5 min）、70%乙醇（5 min）、純水（5 min）進行脫蠟復水。接著浸入檸檬酸鈉溶液中，加蓋密封，加熱至沸騰狀態20～25 min后，取出冷卻至室溫，以PBS溶液清洗3次，每次5 min。滴加3%內源性過氧化物酶溶液孵育，結束后PBS溶液清洗3次，每次5 min。后于37 ℃烘箱孵育載玻片20～30 min，同時滴加非特異性染色阻斷劑。配制一抗（BDNF 1∶400、CREB 1∶400），滴至載玻片上后放入4 ℃冰箱中孵育過夜。次日于37 ℃恒溫箱中復溫1 h，使用PBS溶液清洗3次，每次5 min。此后，滴加生物素標記的羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育30 min，再次用PBS溶液清洗3次，每次5 min。最后，滴加鏈霉親和素-生物素復合物，于室溫下孵育30 min，用PBS溶液清洗3次，每次5 min。采用DAB染色法，配制顯色液，顯色完成后放入純水中終止染色，后用蘇木素復染、自來水反藍。將切片經80%乙醇（3 min）、95%乙醇（3 min）、100%乙醇Ⅰ（3 min）、二甲苯Ⅰ（3 min）、二甲苯Ⅱ（3 min）脫水，封片。最后使用光學顯微鏡拍攝，采用Image J軟件計算平均光密度。

1.7.2" Western blot檢測" 以Western blot檢測大鼠前額葉、海馬、小腦組織區域中BDNF、CREB蛋白的相對表達量。6只大鼠前額葉、海馬、小腦組織分別加入對應體積的裂解液，充分研磨勻漿，取上清液。BCA法測定蛋白濃度，根據所測得的蛋白濃度值制備凝膠，上樣后按10 V電泳20 min、80 V電泳15～20 min（跑完濃縮膠）、120 V電泳30～40 min（跑分離膠）的順序進行電泳，恒流400 mA轉膜20～40 min，封閉15～20 min后孵育一抗（BDNF 1∶2 000、CREB 1∶12 000），再收入4 ℃冰箱中孵育過夜。回收一抗后用TBST溶液洗滌5 min，重復3次。接著加二抗試劑（兔抗1∶5 000、鼠抗1∶2 000）孵育1 h，結束后用TBST溶液洗滌5 min，重復3次。最后采用Image J圖像分析軟件分析各條帶的平均吸光度。

1.8" 統計學分析

數據分析采用SPSS 24.0統計軟件進行處理，計量資料采用“x±s”進行表述。對于符合正態性的數據采取單因素方差分析分析，方差齊者采用LSD檢驗，方差不齊者采用Games Howell檢驗;不符合正態分布的數據采用非參數檢驗分析。以Plt;0.05判定差異有統計學意義。

2 結果

2.1" 3組大鼠曠場實驗檢測結果

與空白組相比，模型組活動總路程出現顯著增長（Plt;0.01）、理毛次數顯著增多（Plt;0.01）、站立次數顯著減少（Plt;0.01）;與模型組相比，捏脊組活動總路程減少（Plt;0.05）、理毛次數減少（Plt;0.05）、站立次數增多（Plt;0.05）。詳見表1。

2.2" 3組大鼠腦組織BDNF、CREB蛋白免疫組織化學結果

2.2.1" 3組大鼠前額葉區BDNF、CREB蛋白結果

與空白組相比，模型組前額葉區BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度顯著減少（Plt;0.01）;與模型組相比，捏脊組前額葉區BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度顯著增多（Plt;0.01）。詳見表2、圖1。

2.2.2" 3組大鼠海馬區BDNF、CREB蛋白結果" 與空白組比較，模型組海馬區BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度顯著減少（Plt;0.01）;與模型組比較，捏脊組海馬區BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度增多（Plt;0.05，Plt;0.01）。詳見表3、圖2。

2.2.3" 3組大鼠小腦區BDNF、CREB蛋白結果" 與空白組比較，模型組小腦區BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度減少（Plt;0.05，Plt;0.01）;與模型組比較，捏脊組小腦區BDNF、CREB蛋白陽性平均光密度顯著增多（Plt;0.01）。詳見表4、圖3。

2.3" 3組大鼠腦組織BDNF、CREB蛋白Western blot檢測結果

2.3.1" 3組大鼠前額葉區BDNF、CREB蛋白結果

與空白組比較，模型組前額葉區BDNF、CREB蛋白表達水平減少（Plt;0.05）;與模型組比較，捏脊組前額葉區BDNF、CREB蛋白表達水平增多（Plt;0.05，Plt;0.01）。詳見表5、圖4。

2.3.2" 3組大鼠海馬區BDNF、CREB蛋白結果" 與空白組比較，模型組海馬區BDNF、CREB蛋白表達減少（Plt;0.05）;與模型組比較，捏脊組海馬區BDNF、CREB蛋白表達增多（Plt;0.05，Plt;0.01）。詳見表6、圖5。

2.3.3" 3組大鼠小腦區BDNF、CREB蛋白結果" 與空白組比較，模型組小腦區BDNF、CREB蛋白表達減少（Plt;0.05，Plt;0.01）;與模型組比較，捏脊組小腦區BDNF、CREB蛋白表達增多（Plt;0.05，Plt;0.01）。詳見表7、圖6。

3 討論

中醫學病名中無“孤獨癥”，其相關癥狀可見于“童昏”“無慧”“胎弱”等范疇。ASD之病機可析為本與標兩層：本者，源自先天之不足，腦髓失于濡養;標者，系因肝氣失于調暢，氣血虧虛，加之腦絡瘀阻、痰濁等病理產物蒙蔽神明所致[11]?，F代醫學認為，ASD屬于神經發育障礙，發病的復雜性涉及遺傳、環境及心理等多元因素的綜合作用[12]。而現代研究發現，ASD患兒行為異常與其不同腦區的神經生物學變化有關，例如海馬、前額葉皮質、小腦等[13]。團隊前期實驗發現，捏脊療法可明顯改善ASD大鼠的社交及重復刻板樣行為[8]，并可調節其海馬區神經可塑性[9]。在此基礎上，本研究進一步探究捏脊療法對ASD大鼠多個出現異常變化腦區的同步影響作用。

VPA誘導的ASD模型大鼠存在較高的構建效度及可重復性，與ASD患兒的神經生物學以及臨床表型存在高度相似性，是目前較為成熟的ASD動物模型[14]。本研究發現，與空白組相比，模型組活動總路程出現顯著增長、理毛次數顯著增多、站立次數顯著減少;與模型組相比，捏脊組活動總路程減少、理毛次數減少、站立次數增多。這一發現提示，捏脊療法能夠促進ASD模型大鼠對新環境的探索欲望，減少其刻板行為的發生，并有助于減輕焦慮狀態。這些結果進一步支持了捏脊療法在改善ASD相關行為癥狀方面的潛在作用。

BDNF作為腦內豐富且功能多樣的神經營養因子，通過調節基因表達和細胞信號通路，指導神經元沿著特定譜系分化，形成具有特定功能的成熟神經元，不僅促進軸突生長、樹突分支形成，還參與突觸的形成與成熟，在神經網絡的構建與功能整合、神經保護功能以及神經元生長發育過程中扮演著核心角色[15]。大量研究證據揭示，ASD患兒體內BDNF的表達存在異常現象[16]，具體表現為ASD患兒血液中BDNF水平的顯著下降[17]。在ASD動物模型，尤其是大鼠模型中，同樣觀察到多個腦區BDNF表達量的顯著降低[18-19]。而BDNF基因敲除小鼠模型的研究進一步證實，BDNF缺乏會導致異常突觸的發生，進而影響模型小鼠的認知與行為功能[5]。CREB作為重要的核轉錄因子，是不同通路最后共同作用的蛋白，在中樞神經系統調控中承擔核心角色，作為繼發于外源性刺激的信號蛋白能應激表達[20]，其生理功能在各系統中均有廣泛表現，并參與介導了腦神經的保護作用[21]。研究證明，抑制BDNF-CREB信號傳導可能與圍產期暴露于BDE-47和/或VPA引起的樹突狀損傷以及隨之而來的ASD樣行為有關[22]。CREB作為BDNF的轉錄激活因子，屬于BDNF-ERK-CREB分子信號級聯通路下游，該信號通路與ASD發病的生物學機制密切相關[23]。本實驗結果顯示，VPA誘導的ASD大鼠前額葉、海馬、小腦區域中均觀察到BDNF與CREB蛋白表達水平的顯著下降，這一現象提示這些腦區內神經遞質的合成與釋放在這個過程中受到抑制，導致突觸間信息傳遞功能受損，神經細胞發育異常，進而引發一系列行為功能障礙。

BDNF廣泛分布在哺乳動物的海馬、大腦皮質和小腦等區域，其中海馬與大腦皮質中的BDNF濃度尤為顯著[24]。對于神經系統疾病，針刺可以同時促進大腦海馬、皮質及小腦等區域中BDNF的表達量，經由不同通路最后共同作用于CREB，使其磷酸化，從而促進神經再生，并在多個腦區中產生效應，其機制可能與調控BDNF/CREB信號途徑關鍵分子的表達與功能有關，促進神經元的恢復而發揮干預神經系統疾病的作用[25]。考慮到團隊前期研究主要聚焦于海馬區[9，21，26]，本研究擴大了觀察范圍，納入前額葉和小腦區。本實驗結果顯示，ASD模型大鼠經過捏脊療法干預后，其前額葉、海馬、小腦區的BDNF與CREB蛋白表達均上調，提示捏脊療法能有效地對多個腦區神經可塑性相關蛋白產生積極影響。

綜上所述，捏脊療法作為一種非藥物干預手段，展現出對ASD大鼠重復刻板行為及焦慮癥狀的改善潛力，這一作用機制可能與捏脊療法引發的特定腦區生物標志物上調有關，即前額葉、海馬、小腦區域內BDNF、CREB等關鍵蛋白含量的提升。本研究的局限性在于捏脊療法干預采用人工手法進行，忽略了捏脊療法的力度、刺激強度等規范化問題，有待后續研究進一步規范與標準化。

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（本文編輯" 匡靜之）