基于蛋白質組學的絲素蛋白微生物降解機理

摘 要：為了揭示絲綢的微生物降解機理，利用蛋白質組學結合熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡、X射線衍射技術研究了絲綢在米曲霉代謝物降解前后宏觀和微觀結構變化，并探討了降解作用在絲綢微生物劣化過程中的地位。形貌分析發(fā)現(xiàn)，絲綢經(jīng)過米曲霉代謝物降解后發(fā)生了明顯的黃變現(xiàn)象，表面纖維大量脫落；二級結構分析表明，絲蛋白分子構象遭到了破壞，結晶度明顯下降；蛋白質組學分析顯示，絲素蛋白重鏈、絲素蛋白輕鏈和P25都發(fā)生了不同程度的降解，而且重鏈蛋白的降解程度更高。經(jīng)過測試分析，推測出一種絲素蛋白米曲霉劣化模型：米曲霉通過降解作用側重分解絲素蛋白重鏈，絲素蛋白結晶區(qū)域結構崩塌，轉變?yōu)樗缮⒌姆蔷ЫY構，絲綢喪失原有的物理化學性能，逐漸被降解破壞。該研究結果對于深入了解古代絲綢劣化機理具有重要意義，可為制定針對性的絲綢文物保護和修復策略提供參考。

關鍵詞：絲綢；降解機理；X射線衍射；二級結構；蛋白質組學

中圖分類號：TS141

文獻標志碼：A

文章編號：1009-265X（2025）02-0042-07

絲綢文物作為中國文化的重要組成部分，具有豐富的歷史意義和文化價值^［1-2］。然而，絲綢作為一種蛋白質纖維極易被破壞^［3-5］，尤其是土壤中豐富的微生物可以通過同化作用（以絲綢作為營養(yǎng)源維持生命活動）和降解作用（通過分泌代謝產(chǎn)物降解絲綢）破壞絲綢結構。米曲霉作為一種真菌，具有強大的酶分泌能力，能夠產(chǎn)生多種水解酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。這些酶類在絲綢的降解過程中發(fā)揮了關鍵作用。絲綢主要由蛋白質纖維構成，而米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶能夠特異性地作用于這些蛋白質纖維，使其發(fā)生水解反應，進而實現(xiàn)絲綢的降解，導致絲綢文物喪失其蘊含的科學、藝術和文化價值，因此，深入研究絲纖維的微生物老化過程對于制定有效的絲綢文物保護策略至關重要^［6］。

蠶絲是一種天然的蛋白質纖維，絲綢文物的劣化也可以看作是絲素蛋白的劣化^［7-8］。蛋白質具有復雜的多級結構，每一級結構的改變都會影響到絲素蛋白的結構及性能^［9-10］。絲綢劣化機理的研究離不開先進的分析檢測技術^［11-14］。在蛋白質組分析中，常采用液相色譜-質譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS）作為主要手段。該過程首先將蛋白質樣品通過蛋白酶將蛋白質分解成肽段，胰蛋白酶主要在精氨酸和賴氨酸殘基的C端切割蛋白質肽鍵。隨后，通過液相色譜技術對肽段進行分離。分離后的肽段經(jīng)電噴霧（ESI）技術電離，并注入質譜儀中進行分析。通過將實驗所得的原始質譜數(shù)據(jù)與理論蛋白質序列數(shù)據(jù)庫進行比對，從而鑒定出肽段及其對應的蛋白質^［15］。泮林丹等^［16-17］利用蛋白質組學和代謝組學相結合的方法研究了兩種不同的細菌對絲綢的影響，結果表明結構松散的蛋白質更容易被銅綠假單胞菌降解，而嗜麥芽窄食單胞菌則是均勻地破壞各種蛋白質。絲蛋白鏈中無定形區(qū)的破壞會暴露微晶體嵌段，進一步加劇絲肽溶出。Wang等^［18］利用蛋白質組學和免疫學技術開發(fā)了一種蠶絲種屬的鑒定方法。Guo等^［19］利用蛋白質組學對桑蠶絲的成分進行分析，鑒定出了129個蛋白質，其中30個被注釋為蛋白酶抑制劑，這解釋了桑蠶繭具有抗菌性的原因。

為了揭示絲織品的微生物機理，本文重點研究降解作用對絲綢的影響，將絲綢置于無菌的米曲霉代謝物溶液中降解處理，模擬絲綢文物的微生物降解過程，以獲得絲綢文物微生物降解初期的人工模擬樣品，并通過掃描電子顯微鏡和X射線衍射技術分析降解后絲纖維的宏觀形貌及絲蛋白二級結構的變化，然后進一步運用蛋白質組學技術從蛋白分子水平研究絲綢微生物降解機理。本文可為絲綢的降解機理研究提供新視角和新思路，有望進一步推進絲綢劣化機理的研究。

1 實驗

1.1 原料和試劑

現(xiàn)代絲綢（杭州富絲工貿(mào)有限公司），米曲霉（AS3.802，上海魯微科技有限公司），馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（杭州百思生物技術有限公司），氯化鈣（分析純，上海麥克林生化科技有限公司），胰蛋白酶（Trypsin，普洛麥格（北京）生物技術有限公司），乙醇（分析純，杭州高晶精細化工有限公司），碳酸氫銨（NH4HCO3，美國Sigma-Aldric公司），乙腈（美國Sigma-Aldric公司），十二烷基磺酸鈉（SDS，美國Bio-Rad Laboratories公司），尿素（美國Bio-Rad Laboratories公司），三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl，美國Bio-Rad Laboratories公司），二硫叔糖醇（DTT，美國Bio-Rad Laboratories公司），吲哚-3-乙酸（IAA，美國Bio-Rad Laboratories公司），甲酸（FA，美國Thermo Fisher Scientific公司），去離子水（實驗室自制）。

1.2 實驗設備

FD-IA-50真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司），DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（杭州儀器制造有限公司），TF-86-30LA超低溫冰箱（上海拓紛機械設備有限公司），5430R離心機（德國Eppendorf AG公司），JSM 5610LV熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本電子JEOS公司），ARL XTRA X-射線衍射儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），GenPure純水儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），Q-Exactive HF-X質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），Easy-nLC1200色譜系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司），Nikon D5100數(shù)碼單反相機（日本尼康株式會社），F(xiàn)A2104電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司），YXQ-50SⅡ立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 老化樣品的制備

用接種環(huán)挑取一環(huán)米曲霉二代斜面菌株，使用劃線法接種在固體PDA培養(yǎng)皿里，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，恒溫培養(yǎng)箱溫度設定為28 ℃，濕度控制在60%。培養(yǎng)完成后，將長滿米曲霉的培養(yǎng)基置于立式高壓蒸汽滅菌鍋中，120 ℃滅菌處理30 min。滅菌完成后，在超凈臺中用200 mL無菌水沖洗培養(yǎng)基，得到米曲霉代謝物溶液。將60 g/m2的絲綢置于波長為253.5 nm的紫外光下滅菌1 min，滅菌完成后將絲綢剪裁成若干2 cm×10 cm的長條狀，隨后將絲綢置于100 mL代謝物溶液中。為了防止微生物污染，將代謝物和絲綢的混合溶液密封后置于4 ℃冰箱中分別降解20 d和40 d。降解完成后使用去離子水超聲清洗3遍，室溫風干后制得絲綢劣化樣S20和S40，未經(jīng)米曲霉降解處理的絲綢同樣進行消毒及清洗步驟作為對照樣。

1.3.2 絲素蛋白的提取

絲綢降解樣和對照樣進行相同處理。稱取5 mg樣品置于250 μL鈣醇溶液（CaCl2、H2O和C2H5OH摩爾比為1∶2∶8）中^［20］，在98 ℃水浴中加熱溶解30 min。冷卻至室溫后，將絲素蛋白溶液倒入截留分子質量為3500 KDa的透析袋中，用去離子水在4 ℃下透析72 h。去離子水更換頻率：0～12 h，1 h 1次；12～24 h，2 h 1次；24～48 h，4 h 1次；48～72 h，6 h 1次。透析完成后將絲素蛋白溶液置于TF-86-30LA超低溫冰箱中冷凍4 h，隨后使用FD-IA-50真空冷凍干燥機進行冷凍干燥處理，得到絲素蛋白粉末。

1.3.3 絲素蛋白的酶解

取100 μg樣品加入100 μL SDT裂解液（4% SDS，100 mM Tris-HCl）中，然后加入100 μL DTT（1 mol/L）沸水浴5 min，冷卻至室溫，離心取上清。在上清液中加入200 μL UA 緩沖液（8 mol/L尿素，150 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0）混合均勻，將混合均勻后的溶液轉入至10 KD超濾離心管中離心15 min，轉速設置為12000 r/min，棄上清。將沉淀物溶解在10 μL IAA（50 mmol/L IAA尿素溶液）中，600 r/min振蕩1 min。室溫下遠離光源孵化30 min后加入100 μL UA 緩沖液純化樣品，12000 r/min離心10 min，再重復此步驟2次。加入100 μL NH4HCO3緩沖液，14000 r/min離心10 min，重復2次。加入40 μL 酶解液（將6 μg胰蛋白酶溶解在40 μL NH4HCO3 緩沖液中），600 r/min振蕩1 min，37 ℃酶解16～18 h。轉移至新收集管，12000 r/min離心10 min，去除沉淀物。使用脫鹽柱對酶解后的肽段進行脫鹽處理，去除絲素蛋白提取液中的鹽離子，肽段真空干燥后加入0.1% FA溶液，OD280測定肽段濃度確定其符合測試標準，以備下一步分析使用。

1.4 測試與表征

1.4.1 表面形貌測試

數(shù)碼拍照：分別取絲綢對照及降解樣品，置于攝影棚內，相同光源下使用Nikon D5100數(shù)碼單反相機拍攝數(shù)碼照片。觀察絲綢對照樣及降解樣顏色變化，評價絲綢樣品降解程度。

掃描電子顯微鏡拍照：將絲綢對照及降解樣品分別剪裁為3 mm×3 mm的小方塊，在樣平臺上粘貼導電膠帶，隨后將待測樣品粘貼在導電膠帶上，噴金180 s，使用JSM 5610LV熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡對降解前后的絲綢樣品進行表面形貌觀察，拍攝放大1000倍的樣品微表面照片。

1.4.2 二級結構測試

采用美國Thermo Fisher Scientific公司的ARL XTRA X射線衍射儀分別對絲綢對照及降解樣品進行測試。隨后利用Origin軟件對譜圖進行分峰擬合處理，計算絲素蛋白中不同二級結構的相對含量。

1.4.3 液相色譜質譜連用蛋白分析

使用納升流速Easy nLC1200色譜系統(tǒng)（Thermo Scientific）對酶解后的肽段進行色譜分離。用0.1%甲酸水溶液（緩沖液A液）平衡色譜柱，將樣品放入補集柱（100 μm×20 mm，5 μm，C18，隨后進入色譜分析柱（75 μm×150 mm，3 μm，C18）梯度分離，樣品的流速設置為300 nL/min。緩沖液B液（0.1%甲酸、80%乙腈和水混合溶液）線性梯度為：0～2 min，2%～5%；2～44 min，5%～8%；44～51 min，28%～40%；51～53 min，40%～100%；53～60 min，維持在100%。完成肽段分離步驟后，使用Q-Exactive HF-X質譜儀（Thermo Scientific）分析60 min，檢測模式為正離子，分析參數(shù)參考常用設置^［20］。

采用Uniprotd蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//www.UniProt.org/）中的Bombyx mori （Silk moth）蛋白數(shù)據(jù)庫對數(shù)據(jù)進行搜庫處理。質譜數(shù)據(jù)庫檢索軟件為MaxQuant 2.0.1.0。MaxQuant搜庫軟件分析參數(shù)設置如下：肽的最大修飾數(shù)：6，第一次搜索母離子質量容差：20 mg/L，主搜索母離子質量容差：4.5 mg/L，二級碎片離子的質量容差：20 mg/L，固定修飾：半胱氨酸氨基甲基烷基化，可變修飾：甲硫氨酸氧化及蛋白N端乙酰化，蛋白鑒定和PSM鑒定的FDR：0.01。

2 結果與分析

2.1 表面形貌分析

絲織品降解前后的形貌變化可以直觀地體現(xiàn)絲綢的老化程度，為了探究絲織品形貌的變化，分別用Nikon D5100數(shù)碼單反相機和JSM 5610LV熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡對降解前后的絲綢進行了形貌觀測。圖1為絲織品降解前后的數(shù)碼照片，從圖中可以看出，未經(jīng)處理的絲綢是白色的，并伴有一定的光澤感，經(jīng)過不同時間的米曲霉代謝物降解之后絲織品表面出現(xiàn)了黃變現(xiàn)象，觸感也由細膩變得粗糙。隨著老化時間的延長，絲織品表面形貌破壞程度變得更加嚴重，說明米曲霉代謝物可以對絲綢表面形貌造成嚴重破壞。

不同老化處理在絲纖維表面留下的痕跡是不同的，可以通過研究各種環(huán)境影響因素下絲纖維的形貌變化來推測絲素蛋白內部發(fā)生的結構變化及劣化降解機理。絲織品降解前后的掃描電鏡圖片如圖2所示，由圖可知，未經(jīng)老化的絲綢對照樣表面整體呈現(xiàn)出一種比較光滑平整的狀態(tài)，降解后纖維表面出現(xiàn)了明顯的纖維脫落現(xiàn)象，并在纖維軸向留下了明顯的條紋狀裂痕。隨著降解時間的延長，絲纖維表面的損傷程度愈加嚴重。顯而易見，米曲霉代謝物具有降解絲織品的能力，米曲霉可以通過降解作用劣化絲綢。

2.2 X射線衍射及結晶度分析

絲素蛋白二級結構的變化對絲綢的性能有著重要的影響，絲素蛋白的結晶區(qū)域主要由β-折疊結構排列而成，結晶區(qū)的相對含量決定了絲纖維的物理化學性能，X射線衍射技術被廣泛地應用于蛋白二級結構的研究中。圖3為米曲霉代謝物降解絲綢樣的X射線衍射圖譜，從圖中可以看出，在20.7°位置出現(xiàn)了一個明顯的寬帶特征衍射峰，研究表明，此峰代表絲素蛋白的結晶峰^［21-22］。絲素蛋白被米曲霉代謝物降解之后，峰型并未發(fā)生明顯改變，但特征峰的強度發(fā)生了改變，隨著降解時間的延長，特征峰強度表現(xiàn)出下降的趨勢，這暗示著絲素蛋白結晶度下降，結晶區(qū)結構被降解破壞。

為了進一步分析絲素蛋白結晶度的變化趨勢，利用Origin軟件對X射線衍射圖譜進行分峰擬合處理，將寬帶特征衍射峰分為結晶峰和非晶峰，以結晶峰面積的相對含量表示絲素蛋白的結晶度。絲素蛋白X射線衍射分峰擬合及結晶度變化如圖4所示，18.9°和20.7°處的特征峰代表絲素蛋白的結晶峰，由圖可知，未處理的絲綢樣的結晶度大約為55.72%，老化樣S20和S40的結晶度分別降為47.97%和34.61%，證實了絲素蛋白的結晶度隨著降解時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢，結果說明米曲霉代謝物對絲素蛋白結晶區(qū)域的降解作用更明顯，導致絲素蛋白二級結構發(fā)生改變，進而影響絲綢的物理及化學性能。

2.3 蛋白質組學分析

為了進一步探究絲素蛋白結構的變化，利用蛋白質組學技術從蛋白分子層面對降解前后的絲綢經(jīng)行分析。絲素蛋白重鏈、輕鏈和P25是絲蛋白中的主要蛋白質^［16］，圖5（a）為米曲霉降解絲綢樣中歸屬于絲素蛋白重鏈、輕鏈和P25的肽段種類圖，由圖可知，對照樣中歸屬于絲素蛋白重鏈、輕鏈和P25的多肽分別為23、12種和9種，降解40 d后分別下降為11、6種和2種，隨著老化時間的延長，多肽種類在不斷下降，說明米曲霉代謝物會降解構成絲蛋白的多肽，破壞絲素蛋白的結構。

蛋白質豐度測試是先將蛋白質酶切成肽段，對肽段經(jīng)行檢測，隨后再將肽段匹配到母體蛋白質，進而獲得蛋白質豐度結果，絲素蛋白的完整性會顯著影響其豐度檢測結果，可以通過蛋白質的豐度來推算其結構完整性。對照樣品的總蛋白豐度為4.16×10¹¹，經(jīng)過米曲霉代謝物降解后的S20和S40的總蛋白豐度分別為2.71×10¹⁰和3.01×109，隨著降解時間的延長，總蛋白豐度呈下降趨勢，說明降解后的蛋白質中的酶切位點斷裂導致可識別多肽的數(shù)量降低。圖5（b）為3種主要蛋白質的豐度變化圖，由圖可知，絲素蛋白重鏈、輕鏈和P25的豐度都呈現(xiàn)出下降趨勢，且絲素蛋白重鏈的豐度下降最快，說明米曲霉代謝物對絲素蛋白各種成分均有明顯的破壞作用，且重鏈的降解程度更深。絲素蛋白重鏈是絲素蛋白中豐度最高的蛋白，其中含有規(guī)則的GX-repeat編碼區(qū)，尤其是高度重復的“GAGAGS”編碼區(qū)是影響絲綢結晶度的主要因素^［23-24］，因此絲蛋白的結晶度呈現(xiàn)下降趨勢，與XRD分析結果一致，說明絲素蛋白的結晶區(qū)受到了更為嚴重的破壞。

3 結論

本文通過將米曲霉與絲綢共培養(yǎng)，獲得人工老化樣品，使用鈣醇溶液提取樣品的絲素蛋白，并從表面形貌、二級結構和蛋白分子層面探討了米曲霉代謝物降解絲綢的降解機理，主要結論如下：

a）隨著降解時間的延長，絲綢表面形貌會發(fā)生黃變現(xiàn)象，表面由光滑變得粗糙，并在表面留下了軸向裂紋，說明米曲霉代謝物具有降解絲綢的能力。

b）隨著老化時間的延長，絲蛋白的二級結構遭到了嚴重破壞，結晶區(qū)和非晶區(qū)結構都受到了不同程度的破壞，結晶度明顯下降，說明絲素蛋白的結晶結構更容易被代謝物降解。由此推測，隨著老化時間的延長，結構緊密的結晶區(qū)域將受到米曲霉代謝物的影響，逐漸被破壞。

c）隨著米曲霉作用時間的延長，絲素蛋白的多肽數(shù)量和蛋白質總豐度都出現(xiàn)了明顯的下降，說明絲素蛋白可以被代謝物降解，且構成絲素蛋白結晶區(qū)域的重鏈豐度下降速率最快，說明絲素蛋白的結晶區(qū)域降解程度更深。然而米曲霉代謝物種類繁多，具體的降解途徑需要更深入的研究。

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Mechanism of microbial degradation of silk fibroin based on proteomics

DING" Chuanmiao，" PAN" Lindan，" CHEN" Hao，" WANG" Bing

（School of Materials Science amp; Engineering， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China）

Abstract：

Silk cultural relics， with their historical， cultural， and artistic value， offer invaluable insights into ancient civilizations. However， like all natural materials， silk is highly susceptible to physical， chemical and biological factors， losing its original value. Therefore， the preservation and restoration of silk cultural relics have always been the focus of cultural relic protection， and in-depth research on the microbial degradation process of silk fibers is of great importance to formulate effective strategies for the protection. The complex multi-level structure of silk fibroin leads to its complicated degradation mechanism， changes in each level of structure may lead to the degradation of silk. And the changeable environment also brings difficulties to the research of aging and degradation of silk cultural relics. The scarcity and non-renewability of silk cultural relics are also major challenges for cultural relics conservationists. To overcome these difficulties， the artificial simulation aging method can be used to study the aging and degradation behavior of silk fibroin.

To reveal the microbial degradation mechanism of silk， this paper investigated the macroscopic and microscopic structural changes of silk before and after degradation of Aspergillus oryzae metabolites using proteomics combined with thermal field emission scanning electron microscopy and XRD techniques. The results of morphological analysis showed that the color of silk changed significantly after aging， and a large number of fibres's shedding and axial cracks appeared on the surface of silk fibres. The results of secondary structure analysis showed that the molecular conformation of silk proteins was damaged， and the degree of crystallinity was significantly decreased. The proteomics results showed that both the number of polypeptides and the total abundance of proteins in silk fibroin decreased significantly， indicating that silk fibroin can be degraded by metabolites， and the abundance of heavy chains constituting the crystalline region of silk fibroin decreased the fastest.

A model of deterioration of silk fibroin by Aspergillus oryzae is postulated： Aspergillus oryzae focuses on the decomposition of fibroin heavy chain through degradation， and the structure of the crystalline region of the silk fibroin collapses into a loose amorphous structure， and the silk loses its original physicochemical properties， and is eventually completely degraded and destroyed. This study is of great significance for the in-depth understanding of the deterioration mechanism of ancient silk and provides an important basis for the targeted protection and restoration strategies for silk cultural relics.

Keywords：

silk; degradation mechanism; XRD; secondary structure; proteomics