不同部位云產雪茄煙葉品質及微生物群落結構的研究

摘要""為研究不同部位云產雪茄煙葉的品質及微生物群落結構，以雪茄品種云雪39號的不同部位（上部二級葉C1、中部二級葉C2和下部二級葉C3）為研究對象，考察其感官質量，通過氣相色譜質譜法（GC-MS）測定中性致香成分含量，通過α-多樣性、β-多樣性等分析微生物群落結構變化。結果表明，感官質量方面，云雪39號不同部位感官質量評分由高到低依次為中部煙葉C2gt;上部煙葉C1gt;下部煙葉C3，中部煙葉香氣量足、香韻豐富、雜氣少、刺激弱、余味和舒適性較好；中性致香成分方面，3種部位雪茄煙葉檢測出主要中性致香成分29種，中性致香成分總含量及各香氣類型含量均為中部煙葉C2最高；微生物群落結構方面，不同部位雪茄煙葉的表面微生物群落結構組成和相對豐度存在差異，下部煙葉C3樣品OTU總數和特有OTU數均最多，細菌群落多樣性較豐富，假單胞菌屬、泛菌屬和未命名菌屬是造成煙葉微生物群落結構差異的關鍵菌屬，不同部位雪茄煙葉代謝通路集中在信號轉導和細胞過程、氨基酸代謝、脂肪酸代謝和遺傳信息處理，不同部位的雪茄煙葉同種代謝通路存在差異。本文為雪茄煙葉產品配方的進一步開發及發酵功能微生物篩選提供參考。

關鍵詞""云產雪茄煙葉；部位；感官質量；中性致香成分；微生物群落結構；代謝途徑

中圖分類號""Q939.96；TS44+4 """"""文獻標識碼""A """"""文章編號""1007-7731（2025）04-0097-07

DOI號""10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.04.020

Research on the quality and microbial community structure of different parts of Yunnan produced cigar tobacco leaves

ZHOU Xiao "HE Fuying YU Ziyun XU Zhengrong DONG Junzhong WANG Bingbing LI Tian LIU Yan "LU Xin

（¹Yuxi Agriculture Vocation-Technical College， Yuxi 653100， China;

²Tobacco Industry Service Center of Yuanjiang County， Yuanjiang 653300， China）

Abstract "To investigate the quality and microbial community structure of different parts of Yunnan produced cigar tobacco leaves， the sensory quality of different parts （upper secondary leaf C1， middle secondary leaf C2， and lower secondary leaf C3） of cigar variety Yunxue 39 was examined. The content of neutral aroma components was determined by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）， and the changes in microbial community structure were analyzed by alpha diversity， beta diversity， etc. The results showed that in terms of sensory quality， the sensory quality scores of different parts of Yunxue 39 were ranked from high to low as followed："C2 for the middle tobacco leavesgt;C1 for the upper tobacco leavesgt;C3 for the lower tobacco leaves. The middle tobacco leaves had sufficient aroma， rich fragrance， less impurities， weak stimulation， good aftertaste and comfort; in terms of neutral aroma components， 29 main neutral aroma components were detected in cigar leaves from 3 different parts. The total content of neutral aroma components and the content of various aroma types were the highest in the C2 tobacco leaves from the central part; in terms of microbial community structure， there were differences in the composition and relative abundance of surface microbial communities in different parts of cigar tobacco leaves. The C3 sample of lower tobacco leaves had the highest total number of OTUs and unique OTUs， and the bacterial community diversity was relatively rich. Pseudomonas， Pantoea， and unnamed genera were the key bacterial genera that cause differences in the microbial community structure of tobacco leaves. The metabolic pathways of cigar tobacco leaves in different parts were concentrated in signal transduction and cellular processes， amino acid metabolism， fatty acid metabolism， and genetic information processing， and there were differences in the same metabolic pathways in cigar tobacco leaves in different parts. This article provides references for further development of cigar tobacco product formula and screening of fermentation functional microorganisms.

Keywords "Yunnan produced cigar tobacco leaves; part; sensory quality; neutral aroma components; microbial community structure; metabolic pathways

雪茄香氣馥郁、風味獨特，其煙葉需經過發酵、醇化等特殊環節，才能滿足雪茄制品配方應用需求，而微生物在發酵過程中扮演著重要角色^[1-2]。因此，研究不同部位雪茄煙葉品質與微生物菌落特征具有重要意義。目前，相關學者聚焦海拔高度對烤煙煙葉感官品質及化學成分的影響^[3-4]以及煙草內源、外源性微生物影響煙葉發酵品質的機制^[5]等方面。吳麗君等^[6]研究表明，云南雪茄煙葉人工發酵過程中化學成分與細菌菌落變化相互影響。張碰元等^[7]分析了醇化方式對津巴布韋煙葉微生物和香味成分的影響，發現醇化時間和醇化庫對菌落的相對豐度具有一定影響。胡婉蓉等^[8]研究發現，添加發酵介質會影響雪茄煙葉非揮發性有機酸總質量分數的變化，有利于改善其感官質量。趙銘欽等^[9]研究表明，生物制劑處理后的發酵煙葉中，大馬酮、二氫大馬酮和巨豆三烯酮等香氣成分含量增加。余玉莎等^[10]研究發現，米根霉（Rhizopus oryzae）能增加煙葉部分致香成分。陳興等^[11]證明了從醇化煙葉表面分離篩選到的西姆芽孢桿菌（Bacillus siamensis）能有效改善煙葉內在質量。結合云產雪茄煙葉不同部位的感官品質、揮發性成分及微生物菌落特征機制的研究鮮少報道。本試驗以雪茄茄芯品種云雪39號為研究對象，探索其不同部位雪茄煙葉的感官品質、中性致香成分含量及微生物菌落特征，為雪茄煙葉配方開發及功能性微生物篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙葉：云雪39號（上部二級葉C1、中部二級葉C2和下部二級葉C3），采自云南玉溪元江縣甘莊街道撮科收費站旁，海拔720.9 m，102.172° E，23.778° N。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：二氯甲烷（分析純，四川西隴科學有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，四川西隴科學有限公司）；乙酸苯乙酯標準品（≥98%，美國Sigma公司）。主要儀器：R-220SE旋轉蒸發儀（瑞士Büchi公司）；Milli-Q Element型超純水儀（美國Millipore公司）；BSA224S-CW電子天平（德國Sartorius公司）；7890A/5975C氣質聯用儀（美國Agilent公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理及感官質量評價 以不同部位雪茄煙葉為單一變量，統一采收后經雪茄煙晾房相同工藝完成晾制；將晾制好的樣品在相對濕度（60±2）%、溫度（22±1）℃環境下平衡48 h后，采用相同煙管卷制，由專業評吸人員參考YC/T 138—1998《煙草及煙草制品"感官評價方法》^[12]進行感官質量評價。

1.3.2 中性致香成分測定 精密稱量雪茄煙葉樣品絕干質量12.500 g，參考鄭建宇等^[13]的試驗方法，以乙酸苯乙酯為內標，使用蒸餾萃取（SDE）方法提取揮發性成分，并通過氣相色譜質譜法（GC-MS）進行分析。

1.3.3 微生物多樣性與群落結構 樣品的微生物擴增子測序委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成，使用799F（AACMGGATTAGATACCCKG）和1193R（ACGTCATCCCCACCTTCC）對16S rRNA基因V5-V7區進行PCR擴增。基于Illumina NovaSeq測序平臺進行PE250測序，對有效數據在97%水平上進行α-多樣性、β-多樣性和操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）聚類分析，并利用Silva 138.1數據庫進行物種注釋。

2 結果與分析

2.1 不同部位雪茄煙葉的感官質量評價

不同部位雪茄煙葉的感官質量評價如表1所示。樣品感官質量量化分數由高到低依次為中部煙葉C2gt;上部煙葉C1gt;下部煙葉C3，其中中部煙葉C2感官質量最好，其表現在香氣量足、香韻豐富、雜氣少、刺激弱以及余味和舒適性較好；上部煙葉C1香氣量足、雜氣少、略有顆粒感、刺激較弱，但煙氣濃度高導致質感下降；下部煙葉C3感官質量較差，香氣量弱、刺激較大、有熱刺感。

2.2 不同部位雪茄煙葉的中性致香成分

參考煙草香氣前體物質分類方法^[14]，將主要中性致香成分進行分類，不同部位雪茄煙葉主要中性致香成分含量如表2所示。3個部位煙葉共檢測出主要中性致香成分29種，其中苯丙氨酸轉化產物3種，西柏烷類降解產物1種，類胡蘿卜素降解產物13種，葉綠素降解產物1種，其他類別11種，各類成分含量差異較大，單體化合物新植二烯含量最高。中性致香成分總含量由高到低依次為中部煙葉C2gt;上部煙葉C1gt;下部煙葉C3，其中中部煙葉C2總含量最高，為281.83 μg/g。

中部煙葉C2苯丙氨酸轉化產物含量最高，為34.77 μg/g；下部煙葉C3含量最低，為2.78 μg/g。其中中部煙葉C2苯乙醇含量最高，為16.20 μg/g，苯甲醇僅在中部煙葉C2中檢測到。各部位樣品中均檢測到茄酮，其中中部煙葉C2含量最高，為10.07 μg/g；下部二級C3含量最低，為5.33 μg/g。

煙草香味成分中，大部分化合物為類胡蘿卜素降解產物，其是煙草中重要的萜烯類化合物之一。由表2可知，中部煙葉C2類胡蘿卜素降解產物含量最高，為94.66 μg/g；下部煙葉C3含量最低，為81.66 μg/g，大馬士酮、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯和巨豆三烯酮A/B/C/D在中部煙葉C2中含量均最高。不同部位樣品中，新植二烯是含量最大的單體化合物。所有樣品中均檢測到新植二烯，其在中部煙葉C2中含量最高，為85.31 μg/g；上部煙葉C1最低，為59.60 μg/g。

其他類型中性致香成分中，中部煙葉C2含量最高，為57.02 μg/g；下部煙葉C3最低，為36.29 μg/g，3-（2，6，6-三甲基-1-環己烯基）-2-丙烯醛、植酮、鄰苯二甲酸二丁酯、（1R，2E，4S，7E，11E）-4-異丙基-1，7，11-三甲基-2，7，11-環十四烷并三烯-1-醇、（2E，6E，11Z）-3，7，13-三甲基-10-（2-丙基）-2，6，11-環十四碳三烯-1，13-二醇和香紫蘇醇在中部煙葉C2中含量均最高，各類致香成分可直接或間接影響雪茄煙葉的感官質量。

2.3 不同部位雪茄煙葉的微生物多樣性與群落結構

2.3.1 α-多樣性分析 α-多樣性可反映單樣本內微生物群落的豐度和多樣性。在97%分類水平上，各煙葉樣品中微生物群落的α-多樣性結果如表3所示。不同部位雪茄煙葉的微生物覆蓋率在99.8%～99.9%，說明樣品取樣合理，測序結果能夠準確反映雪茄煙葉微生物群落的多樣性。稀釋曲線主要用于表征樣品的測序深度，由圖1可知，隨樣本序列數的增加，不同部位雪茄煙葉微生物群落的Sobs指數呈先上升后趨于平緩的趨勢。說明測序深度基本能夠反映雪茄煙葉微生物群落。

2.3.2 β-多樣性分析 β-多樣性反映不同樣本間的多樣性差異。不同部位雪茄煙葉中微生物群落主坐標分析如圖2所示，第一和第二主坐標對微生物結構變異的貢獻率分別為55.30%和25.19%，不同部位樣本間的離散程度較大，微生物群落組成相似度較低，說明不同部位雪茄煙葉的微生物群落結構組成差異較大。

2.3.3 OTU分析 基于OTU水平繪制了雪茄煙葉表面微生物群落韋恩圖，用于表示微生物群落結構在OTU水平的分布情況。由圖3可知，不同部位雪茄煙葉共有的OTU數為88個，OTU總數由多到少排序依次為下部煙葉C3gt;中部煙葉C2gt;上部煙葉C1，下部煙葉C3的OTU總數和特有OTU數均最多，分別為1 313和1 092個，明顯高于其他部位。

2.3.4 微生物群落組成及相對豐度分析 不同部位雪茄煙葉中微生物在門水平上的群落結構變化如圖4所示，雪茄煙葉微生物組成主要包括5個優勢門類，分別是變形菌門（Proteobacteria）、藍菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota）。變形菌門是雪茄樣品中主要優勢菌門，上部煙葉C1、中部煙葉C2和下部煙葉C3的相對豐度分別為93.22%、76.89%和61.51%；藍菌門在中部煙葉C2和下部煙葉C3中占比較大，相對豐度分別為17.04%和9.78%。在屬水平上雪茄煙葉中相對豐度前20的微生物如圖4所示，主要優勢菌屬有5個，分別是假單胞菌屬（Pseudomonas）、泛菌屬（Pantoea）、未命名菌屬、弧菌屬（Vibrio）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas），其中假單胞菌屬為優勢菌屬，其相對豐度表現為上部煙葉C1（49.94%）gt;中部煙葉C2（20.56%）gt;下部煙葉C3（10.82%）；泛菌屬和未命名菌屬在中部煙葉C2樣品中占絕對優勢，相對豐度分別為28.09%和17.04%。表明不同部位雪茄煙葉在門和屬水平上的微生物相對豐度存在差異。

2.3.5 微生物代謝功能分析 參考KEGG數據庫注釋結果^[15-16]，選取不同部位雪茄煙葉相對豐度排名前10的功能信息，生成功能相對豐度柱狀圖。由圖5可知，不同部位樣品相對豐度排名前10的主要代謝通路集中在信號轉導、細胞過程（K03406、K02029、K02030、K02015、K01992、K01990和K06147），氨基酸代謝（K00799）、脂肪酸代謝（K00059）和遺傳信息處理（K03088），表明不同部位煙葉表面微生物群落參與了基本的代謝過程。在上部煙葉C1中，部分信號轉導和細胞過程、氨基酸代謝通路活躍度明顯高于其他部位；在下部煙葉C3中，脂肪酸代謝、遺傳信息處理通路活躍度高于其他部位，說明不同部位的同種代謝通路豐度存在差異。

3 討論

3.1 不同部位煙葉的感官質量及中性致香成分

各樣品感官質量量化分數由高到低依次為中部煙葉C2gt;上部煙葉C1gt;下部煙葉C3，這與主要中性致香成分總含量排序一致。中部煙葉C2感官質量綜合評分最高，香氣量足、香韻豐富、余味好，這與其苯丙氨酸轉化產物、西柏烷類降解產物和類胡蘿卜素降解產物等各類型香氣成分含量高密切相關。中部煙葉C2的苯甲醇和苯乙醇含量最高，苯甲醇可提供煙葉弱花香，苯乙醇具有清甜的玫瑰花香韻，對增香掩雜具有積極作用。茄酮是煙草中西柏烷類降解產物的代表，是煙草中含量最為豐富的致香成分之一，可增加煙草香韻，使煙氣豐滿、醇和且細膩。中部煙葉C2的茄酮含量最高，說明其煙葉品質較佳。中部煙葉C2類胡蘿卜素降解產物中的大馬士酮、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯和巨豆三烯酮A/B/C/D等單體化合物含量均較高，大馬士酮具有強烈的玫瑰花香、果香；香葉基丙酮可賦予雪茄樣品微玫瑰香、清甜香；β-紫羅蘭酮稀釋時有紫羅蘭花香氣，木香香韻；二氫獼猴桃內酯有淡清涼感，可提高舒適性；巨豆三烯酮在煙葉中起發香作用，使煙氣濃度增加，具有增香掩雜作用。中部煙葉C2的新植二烯含量最高，上部煙葉C1最低，新植二烯是煙葉中重要的非色素類萜烯之一，新植二烯具有減少刺激、醇和煙氣以及進一步降解形成其他低分子質量香氣成分的作用。

3.2 不同部位煙葉的微生物群落結構及代謝功能

試驗表明，不同部位雪茄煙葉微生物群落結構組成差異較大，既有共性也有差異，可能與煙葉生長部位相關，下部煙葉接近土壤，溫濕度適宜微生物的生長和繁殖，這與包可翔等^[17]研究結果相似。

微生物群落組成及相對豐度分析結果表明，不同部位雪茄煙葉在門和屬水平上微生物的組成既有相同又有差異，不同部位會影響雪茄煙葉的微生物群落結構與優勢菌群，以優勢菌屬差異較為明顯，假單胞菌屬是上部煙葉C1的優勢菌屬，而泛菌屬和未命名菌屬則在中部煙葉C2中占據優勢。假單胞菌屬具有降解煙堿的能力，影響雪茄煙葉吸食勁頭，進而影響感官品質^[8]。腸桿菌屬（Enterobacter）是中部煙葉C2的獨有菌屬，其是形成代表性風味化合物的重要貢獻者之一^[18]，已被證實可利用煙草中存在的果膠、糖和有機酸等物質^[19-20]，同時對植物生長、代謝和有害生物防治有積極作用^[21]，因此推測腸桿菌屬可能對雪茄煙葉感官品質產生一定的積極作用。

由于不同部位雪茄煙葉中的微生物群落組成和相對豐度存在差異，形成的功能基因有所不同，進一步影響煙葉糖類、脂肪、氨基酸和碳水化合物等物質代謝。微生物自身代謝可將蛋白質、氨基酸和脂肪酸等不具備香味特征的大分子物質轉化為具有香味特征的揮發性小分子物質，進而影響感官質量。碳水化合物代謝途徑的中間產物可為許多物質的合成提供原料，如芳香族氨基酸的合成等^[22]，此外，氨基酸可與還原糖發生美拉德反應，是煙草中一類重要的致香反應，與煙葉感官品質密切相關^[23]。

4 結論

（1）本試驗以品種云雪39號的不同部位煙葉為研究對象，通過感官質量評價和主要中性致香成分分析發現，煙草各部位的感官質量評分排序與主要中性致香成分含量排序結果一致，中部煙葉C2的感官質量綜合評分最高，可能與對應的中性致香成分總量和部分單體香氣成分含量較高有關。

（2）通過α、β多樣性分析以及OTU分析發現，OTU總數由多到少排序依次為下部煙葉C3gt;中部煙葉C2gt;上部煙葉C1，下部煙葉C3中微生物群落多樣性較豐富；不同部位煙葉的優勢菌門、優勢菌屬相對豐度存在差異，從而導致不同部位的同種代謝通路也存在差異。在煙葉發酵過程中，部分微生物代謝產物自身是香氣物質，部分代謝產物對煙葉化學成分變化起催化作用，間接促進大分子物質的分解、轉化和增香化合物的產生，進一步影響不同部位雪茄煙葉的感官質量和中性致香成分含量。

（3）本研究以不同部位雪茄煙葉為變量，較為系統地分析其感官質量、中性致香成分含量和微生物群落結構特征，可為不同部位雪茄煙葉的應用與開發以及發酵功能微生物的篩選提供參考。

參考文獻

[1] SMYTH E M，CHATTOPADHYAY S，BABIK K，et al. The bacterial communities of little cigars and cigarillos are dynamic over time and varying storage conditions[J]. Frontiers in microbiology，2019，10：2371.

[2] WANG F，ZHAO H W，XIANG H Y，et al. Species diversity and functional prediction of surface bacterial communities on aging flue-cured tobaccos[J]. Current microbiology，2018，75（10）：1306-1315.

[3] 孫曉偉，趙銘欽，翟欣. 畢節不同海拔條件對烤煙風格的影響[J]. 中國煙草學報，2014，20（6）：85-89.

[4] 侯冰清，劉中威，劉永新. 海拔對不同基因型烤煙煙葉化學成分和致香成分含量的影響[J]. 江西農業學報，2020，32（10）：87-92.

[5] 張彤彤，趙君，余君，等. 貝萊斯芽孢桿菌提升雪茄茄衣煙葉發酵品質機制研究[J]. 輕工學報，2023，38（6）：93-101.

[6] 吳麗君，張鴿，陳曉娜，等. 云南雪茄煙葉人工發酵過程中化學成分與細菌群落變化及其相關性分析[J]. 中國煙草學報，2023，29（4）：124-134.

[7] 張碰元，黃家樂，劉遠上，等. 醇化方式對津巴布韋煙葉微生物和香味成分的影響[J]. 煙草科技，2023，56（3）：6-16.

[8] 胡婉蓉，蔡文，鄭召君，等. 發酵介質和發酵過程對雪茄煙葉品質的影響[J]. 煙草科技，2023，56（2）：41-52.

[9] 趙銘欽，李芳芳，李曉強，等. 不同生物制劑處理對發酵烤煙香氣物質含量的影響研究[J]. 云南農業大學學報，2007，22（4）：519-524.

[10] 余玉莎，孫媛，李祖紅，等. 米根霉發酵對煙葉常規成分及主要致香成分的影響[J]. 云南農業大學學報（自然科學），2017，32（2）：379-385.

[11] 陳興，"張天棟，"黨立志，"等. 利用西姆芽孢桿菌改善煙葉品質的研究[J]. 云南農業大學學報（自然科學），2016，31（2）： 322-327.

[12] 國家煙草專賣局. 煙草及煙草制品"感官評價方法：YC/T 138—1998[S]. 北京：中國標準出版社，1998.

[13] 鄭建宇，劉晶，周桂園，等. 超濾膜組合技術對煙草提取物化學成分的影響[J]. 煙草科技，2019，52（12）：70-78.

[14] 史宏志，劉國順. 煙草香味學[M]. 北京：中國農業出版社，1998.

[15] WOLFE B E，BUTTON J E，SANTARELLI M，et al. Cheese rind communities provide tractable systems for in situ"and in vitro"studies of microbial diversity[J]. Cell，2014，158（2）：422-433.

[16] 張龍艷，陳京晶，劉興，等. 基于高通量測序的玉米和刺梨種植地土壤細菌群落多樣性[J]. 貴州農業科學，2023，51（12）：23-30.

[17] 包可翔，林儉，何偉，等. 不同產地和部位對片煙自然醇化過程中細菌群落結構的影響[J]. 煙草科技，2017，50（4）：10-17.

[18] ZHANG Q Y，GENG Z Z，LI D L，et al. Characterization and discrimination of microbial community and co-occurrence patterns in fresh and strong flavor style flue-cured tobacco leaves[J]. Microbiology Open，2020，9（2）：e965.

[19] WADE ABBOTT D，BORASTON A B. Structural biology of pectin degradation by Enterobacteriaceae[J]. Microbiology and molecular biology reviews，2008，72（2）：301-316.

[20] RACHMAN M A，FURUTANI Y，NAKASHIMADA Y，et al. Enhanced hydrogen production in altered mixed acid fermentation of glucose by Enterobacter aerogenes[J]. Journal of fermentation and bioengineering，1997，83（4）：358-363.

[21] NIE L，SHAH S，RASHID A，et al. Phytoremediation of arsenate contaminated soil by transgenic canola and the plant growth-promoting bacterium Enterobacter cloacae"CAL2[J]. Plant physiology and biochemistry，2002，40（4）：355-361.

[22] 于建軍，李琳，龐天河，等. 煙葉發酵研究進展[J]. 河南農業大學學報，2006，40（1）：108-112.

[23] 過偉民，郭建華，董洪旭，等. 烤煙游離氨基酸與感官品質的關聯及烘烤過程的變化規律研究[J]. 中國煙草學報，2018，24（6）：16-25.

（責任編輯：吳思文）