UPLC-MS/MS法測定花椒中黃曲霉毒素的含量

摘 要：本文建立了超高效液相色譜-串聯質譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）測定花椒中4種黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）的方法。試樣采用84%乙腈-水溶液提取，液-液分配凈化，采用UPLC-MS/MS儀器進行檢測，外標法定量。結果表明，4種黃曲霉毒素在各自線性范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.999，AFB1和AFG1的檢出限為0.25 μg·kg-1，AFB2和AFG2的檢出限為0.15 μg·kg-1，定量限均為0.50 μg·kg-1。4種黃曲霉毒素的加標回收率在79.8%～100.8%，相對標準偏差在1.39%～6.49%。該方法操作簡單、靈敏度高、成本低，能夠滿足花椒樣品中黃曲霉毒素含量的測定要求。

關鍵詞：超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）；花椒；黃曲霉毒素

Determination of Aflatoxins Content in Zanthoxylum bungeanum by UPLC-MS/MS Method

GUO Zhongli， LIU Lihua， ZHAO Cui， HAN Xiaona

（Qingdao Chengyu Food Testing Co.， Ltd.， Qingdao 266108， China）

Abstract： An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method was developed for the determination of four aflatoxins （AFB1， AFB2， AFG1 and AFG2） in Zanthoxylum bungeanum. The samples were extracted by 84% acetonitrile-aqueous solution， purified by liquid-liquid distribution， detected by UPLC-MS/MS instrument， and quantified by external standard method. The results showed that the four aflatoxins had good linear relationships in their respective linear ranges， and the correlation coefficients were all greater than 0.999. The detection limits of AFB1 and AFG1 were 0.25 μg·kg-1， and the detection limits of AFB2 and AFG2 were 0.15 μg·kg-1. The limits of quantification were 0.50 μg·kg-1. The recoveries of four aflatoxins ranged from 79.8% to 100.8%， and the relative standard deviations ranged from 1.39% to 6.49%. The method has the advantages of simple operation， high sensitivity and low cost， and can meet the requirements of determination of aflatoxins in Zanthoxylum bungeanum sample.

Keywords： ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; Zanthoxylum bungeanum; aflatoxins

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產生的雙呋喃環類毒素，是目前已知最強的天然致癌物質之一，其對肝臟傷害最為嚴重，可導致肝臟功能下降，增加罹患肝癌的風險。黃曲霉毒素主要存在于霉變的谷物、堅果、干果、豆類、食用油和香料類等食品中。

目前，各國對花椒中黃曲霉毒素的限量標準不統一。我國食品安全國家標準中僅對黃曲霉毒素B1提出了限量要求[1]，且限量的食品中沒有花椒；歐盟也未對花椒中的4種黃曲霉毒素提出限量要求，但是對部分香料進行了規定，其中黃曲霉毒素B1最大殘留量為5 μg·kg-1，黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）的最大殘留總量為10 μg·kg-1。

黃曲霉毒素的檢測方法有多種，包括液相色譜串聯質譜法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附法和薄層色譜法等[2]。近年來，液相色譜串聯質譜法因其靈敏度高、準確性強、速度快以及可靠性強等優點，在檢測如花椒這類復雜基質中的黃曲霉毒素殘留量時，該方法得到了廣泛應用[3-5]。由于花椒基質復雜，在處理樣品時需要使用內標法及固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）柱，導致實驗成本過高?；诖?，本文在現有檢測方法的基礎上進行優化，建立一種UPLC-MS/MS法測定花椒中黃曲霉毒素含量的方法，以達到降本增效的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純）；正己烷、氯化鈉（分析純）；甲酸銨（色譜純，純度為99%）；實驗用水（一級）。

黃曲霉毒素混標儲備液：AFB1（濃度為1.0 μg·mL-1）、AFB2（濃度為0.3 μg·mL-1）、AFG1（濃度為1.0 μg·mL-1）和AFG2（濃度為0.3 μg·mL-1）。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC H-Class PLUS超高效液相色譜儀、Xevo TQ-XS串聯質譜聯用儀，美國Waters公司；Xbridge BEH C18 XP Column色譜柱（2.1 mm×75 mm，2.5 μm），美國Waters公司；粉碎機，德國?福維克家電有限公司；PL602-L型分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；BB2000S型超聲波清洗儀，美國必能信超聲有限公司；V·DX型振蕩儀，日本IWAKI SANGYO公司；H-103N型離心機（轉速≥3 500 r·min-1），日本KOKUSAN株式會社；TTM-1型渦旋混合器，日本SIBATA柴田科學株式會社。

1.3 黃曲霉毒素混標標準工作液的配制

準確吸取1 mL黃曲霉毒素標準混標儲備液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容，得到AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的濃度分別為100、30、100 μg·L-1和30 μg·L-1的標準工作液。準確移取黃曲霉毒素標準工作液2、4、10、20、40 μL和100 μL，用80%甲醇-水溶液稀釋至1 mL，配制成AFB1、AFG1濃度分別為0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 μg·L-1和10.0 μg·L-1，AFB2、AFG2濃度分別為0.06、0.12、0.30、0.60、1.20 μg·L-1和3.00 μg·L-1的標準系列溶液，供UPLC-MS/MS測定。

1.4 樣品處理

（1）提取。選取花椒樣品，用粉碎機粉碎至均勻粉末狀。稱取2 g花椒粉（精確至0.01 g）于50 mL具塞離心管中，加入20 mL 84%乙腈-水溶液超聲30 min，4 200 r·min-1離心3 min，用吸管吸取全部提取液至50 mL具塞離心管中，再加入20 mL 84%乙腈-水溶液重復提取1次，合并2次提取液，用乙腈定容至50 mL。

（2）凈化。準確移取5 mL提取液于50 mL離心管中，加入4 g氯化鈉，5 mL水，10 mL正己烷，10 mL乙腈振蕩20 min，離心（4 200 r·min-1，3 min），取中間層（乙腈）于50 mL旋干瓶中。

（3）濃縮。40 ℃減壓濃縮至近干，氮氣吹干。加入80%甲醇-水溶液1 mL定容，渦旋1 min，過0.22 μm微孔濾膜，采用UPLC-MS/MS法測定。

1.5 儀器條件

1.5.1 液相色譜條件

Xbridge BEH C18 XP Column色譜柱（2.1 mm×75 mm，2.5 μm）；流動相A為含有0.01%甲酸的2 mmol·L-1甲酸銨水溶液，B相為含有0.01%甲酸的2 mmol·L-1甲酸銨甲醇溶液；流速：0.4 mL·min-1；柱溫；40 ℃；進樣量：1 μL。梯度洗脫條件：0～0.5 min，97%A；0.5～4.0 min，97%→60%A；4.0～5.5 min，60%→50%A；5.5～6.5 min，50%→2%A；6.5～9.0 min，2%A；9.0～9.1 min，2%→97%A；9.1～10.0 min，97%A。

1.5.2 質譜條件

電離電壓：0.5 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：500 ℃；脫溶劑氣流速：16.7 L·min-1；錐孔反吹氣流速：2.5 L·min-1；采集模式：正離子模式（ESI+），多反應監測模式。AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的質譜條件見表1。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

以黃曲霉毒素各自的峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，其線性方程、檢出限和定量限結果見表2。由表2可知，4種黃曲霉毒素在各自線性范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.999，AFB1和AFG1的檢出限為0.25 μg·kg-1，AFB2和AFG2的檢出限為0.15 μg·kg-1，定量限均為0.50 μg·kg-1。

2.2 方法靈敏度

在花椒空白試樣中添加黃曲霉毒素混標標準工作液溶液，當AFB1、AFG1添加濃度為0.25 μg·kg-1，AFB2、AFG2添加濃度為0.15 μg·kg-1時，信噪比

（S/N）＞3，故將其作為方法的檢出限；AFB1、AFB2、AFG1和AFG2添加濃度為0.50 μg·kg-1時，信噪比（S/N）＞10，將其作為方法的定量限。

2.3 準確度與精密度

在2 g花椒空白樣品中分別加入3個濃度水平的黃曲霉毒素混標標準工作液，進行加標回收試驗。結果表明，目標物質的回收率在79.8%～100.8%，相對標準偏差在1.39%～6.49%，準確度和精密度均能滿足有關法規要求。重復6次添加回收實驗的平均回收率和相對標準偏差數據見表3。

3 結論

本文在GB 5009.22—2016基礎上，建立了一種UPLC-MS/MS法測定花椒中黃曲霉毒素含量的方法。通過改變凈化方法，將SPE柱凈化改為液-液分配凈化，并降低了樣品的稀釋倍率。此外，通過降低進樣量、改變流動相梯度，最終達到降低基質效應的目的。方法中AFB1、AFG1的檢出限為0.25 μg·kg-1，AFB2、AFG2的檢出限為0.15 μg·kg-1，定量限均為0.5 μg·kg-1。本方法操作簡單、靈敏度高、成本低，適用于檢測花椒樣品中黃曲霉毒素的含量。

參考文獻

[1]國家食品藥品監督管理總局，國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量：GB 2761—2017[S].北京：中國標準出版社，2017.

[2]國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定：GB 5009.22—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[3]湯富彬，鐘冬蓮，沈丹玉，等.高效液相色譜-串聯質譜法測定堅果中的黃曲霉毒素[C]//第十屆中國林業青年學術論壇論文集.南京：中國林學會，2012：1-5.

[4]伍旭東，羅發美，車濤，等.高效液相色譜串聯質譜法測定普洱茶茶籽油中的黃曲霉毒素B1[J].光譜實驗室，2014，31（5）：610-616.

[5]趙慶林，王孟陽，姚晨，等.超高效液相色譜串聯質譜法檢測山藥丸中4種黃曲霉毒素[J].中國藥業，2024，33（23）：67-70.