‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織誘導條件研究

摘 要：為了開展石榴遺傳轉化研究，以‘突尼斯軟籽’石榴為試材，葉片為外植體，采用響應面回歸分析方法研究了不同生長調節物質對離體葉片愈傷組織再生的影響。結果表明，‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織誘導的最佳培養基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋2，4-D 0.5 mg/L＋NAA 0.3 mg/L，誘導率可達83.9%，且愈傷組織生長狀況良好。本研究建立了‘突尼斯軟籽’石榴高效的離體快繁體系，為石榴繁育技術的改善提供了理論依據。

關鍵詞：‘突尼斯軟籽’石榴；植物生長調節劑；愈傷組織；響應面法

中圖分類號：S665.4 文獻標志碼：A 文章編號：1008-1038（2025）02-0051-05

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2025.02.008

Study on Callus Induction Conditions of Pomegranate

Leaves of ‘Tunisia Soft Seed’

WANG Hong1， JIA Maomao1， TAO Aili2， LI Yuying2， YUAN Chaozheng1， YANG Ling1， GAO Xiaofeng1*

（1. Nanyang Academy of Sciences， Nanyang Key Laboratory of Pomegranate Breeding， Nanyang 473000， China;

2. Nanyang Normal University， Henan Soft Seed Pomegranate Engineering Research Center，

Nanyang 473000， China）

Abstract： In order to develop genetic transformation test of pomegranate， in this paper， using leaves in ‘Tunisia soft-seed’ pomegranate as explants， the different growth regulators on callus regeneration of leaves by response surface method was studied. The results showed that the optimal medium was MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA， the induction rate was 83.9%， and most of the callus grew well. At the same time， a high efficient rapid propagation system of‘Tunisia soft-seed’ pomegranate was established. And it also provided a theoretical basis for improving pomegranate breeding technology.

Keywords： ‘Tunisia soft-seed’ pomegranate; plant growth regulator; callus; response surface method

石榴（Punica granatum L.）屬桃金娘目石榴科（Punicaceae）石榴屬（Punica L.）落葉果樹，小喬木或灌木[1]，果實中含有維生素C、維生素B、有機酸、蛋白質以及鈣、磷、鉀等豐富的營養成分[2]。石榴在我國已有2 000多年的栽培歷史，是優良經濟林樹種之一，栽培效益十分可觀。2020年，我國石榴種植面積約11.6萬hm2，居世界第一位，遠超世界第二大石榴種植國——伊朗[3]。

石榴是木本植物，營養生長期較長，利用傳統育種方法改良性狀遠落后于草本植物，而利用組織培養技術對研究石榴遺傳轉化及分子育種有一定的幫助[4]。目前，關于石榴組織培養方面的研究已經取得了一定的進展[5-6]，對其葉片進行誘導愈傷組織方面的研究也有相關報道[7-8]。但是，葉片愈傷組織誘導受多因素影響，植物生長調節劑的種類和濃度是愈傷組織誘導的關鍵因素[9-10]，但從單一因素出發優化快繁體系較片面，沈慶斌等[11]、史滟滪等[12]、歐陽歡等[13]研究發現，在愈傷組織誘導中單獨使用2，4-D不利于胚性愈傷組織的形成。Huang等[14]、李瑞靜等[15]研究發現單獨使用細胞分裂素也很難完成愈傷組織的誘導。誘導高質量的愈傷組織，生長素和細胞分裂素缺一不可，需相互協同作用，而通過響應面（法Box-Behnken design，BBD）可對不同因素與愈傷組織誘導率的關系建立模型并進行分析，得到可靠有效的試驗因素優化方案[16]，關于利用響應面法優化石榴葉片愈傷組織誘導的相關文獻未見報道。

本試驗以‘突尼斯軟籽’石榴葉片為原料，采用響應面法研究NAA、6-BA和2，4-D濃度配比對石榴葉片愈傷組織誘導率的影響，建立并優化適用于‘突尼斯軟籽’石榴葉片誘導愈傷組織的快繁體系，為石榴愈傷組織的研究提供良好的試驗系統，同時也為石榴愈傷組織的進一步開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為南陽師范學院石榴園試驗基地（112°30′E、33°0′N）3年生‘突尼斯軟籽’石榴樹。

MS培養基、6-BA、NAA、2，4-D，分析純，康倍斯生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得

取3年生‘突尼斯軟籽’石榴樹，當年新抽、無病蟲害、生長健壯枝條，采摘葉片作為試材。用洗滌劑洗去表面塵土，流水下沖洗2 h。置于超凈工作臺上，先后用75%的乙醇震蕩30 s和0.1%氯化汞浸泡6 min進行滅菌，最后用無菌水沖洗2次，再放入無菌水中備用。

1.2.2 培養基及培養條件

將無菌葉片在墊有濾紙的培養皿中，避開主脈剪成0.5 cm×0.5 cm大小，葉片背部向下鋪在培養基上。以MS為基本培養基，pH 5.8。每個處理接種10瓶，每瓶3個外植體，重復3次。接種后暗培養14 d，然后轉至光下培養，培養溫度（25±1） ℃，光照強度1 500～2 000 lx，光照時間16 h/d。30 d后觀察記錄愈傷組織的生長情況并利用公式（1）計算誘導率。

誘導率/%=×100（1）

1.3 單因素試驗

固定MS培養基的激素組成為NAA濃度0.3 mg/L、6-BA濃度1.5 mg/L、2，4-D濃度0.5 mg/L。NAA濃度設置為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L，6-BA濃度設置為1.3、1.4、1.5、1.6、1.7 mg/L，2，4-D濃度設置為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/L，測定葉片誘導率及生長狀況，進行‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織誘導的單因素試驗。

1.4 響應面實驗

在單因素試驗基礎上，利用Design-Expert 10.0.6按照3因素3水平進行響應面優化。如表1所示，以愈傷組織誘導率（Y）為響應值，以對誘導‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織影響顯著的3個因素，即NAA濃度、6-BA濃度及2，4-D濃度為考察因素。

1.5 數據處理

使用Excel 2003進行數據統計，同時，利用Design-Expert 10.0.6對所得數據進行計算和分析，推測出最佳培養基配比，通過試驗驗證結果的準確性。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 NAA對石榴葉片愈傷組織誘導的影響

由表2知，石榴葉片暗培養14 d后，轉入光培養條件下，葉片愈傷組織生長狀況見表2。結果表明，隨NAA濃度的增加，愈傷組織誘導率先增加后減小，當NAA濃度為0.3 mg/L時，誘導率最大，并且得到綠色致密的愈傷組織，其生長非常好。由此可見，‘突尼斯’軟籽石榴葉片愈傷組織誘導的最佳NAA濃度為0.3 mg/L。

2.1.2 6-BA對石榴葉片愈傷組織誘導的影響

由表3可知，6-BA濃度為1.3 mg/L時，誘導率僅為56.7%，生成少量綠色愈傷組織；當濃度1.5 mg/L時，誘導率最高，可達到76.7%，且得到大量綠色致密的愈傷組織；隨著6-BA濃度的增加，誘導率降低，并且誘導的愈傷組織中有黃白色膨大；可能是激素濃度過高，細胞分裂過旺造成提前衰老[7]。綜上，‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織誘導的6-BA最佳濃度為1.5 mg/L。

2.1.3 2，4-D對石榴葉片愈傷組織誘導的影響

由表4可知，不同濃度的2，4-D對石榴葉片愈傷組織誘導率的影響不同。可見生長素濃度適當，一定程度上會促進愈傷組織的形成，但當生長素濃度過高時，會增加多酚氧化酶的活性，褐化嚴重。因此，2，4-D濃度為0.5 mg/L時，‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織的誘導率最高且生長情況最好。

2.2 響應面法優化軟籽石榴葉片愈傷組織的誘導

2.2.1 模型擬合和方差分析

利用Box-Behnken試驗設計與分析3因素3水平響應面優化（表5），研究軟籽石榴葉片誘導愈傷組織的關鍵因素，以獲得最佳的條件參數。對表5的結果進行擬合，得回歸方程為誘導率（Y）=83.54+0.76A+1.95B+0.26C-0.88AB+0.20AC-0.13BC-3.32A2-1.25B2-2.17C2。

根據方差分析和顯著性檢驗的結果（表6）可知，F=3.87，P＜0.05，表明該回歸方程顯著，R2=0.83表示模型可信度較高，模型擬合較好。失擬項的F=3.01，P=0.157 3（P＞0.05），可見失擬項不顯著，擬合情況較好，該模型能較好地預測和分析軟籽石榴愈傷組織的誘導率。

同時由表6回歸模型系數顯著性檢驗表明，模型一次項B影響顯著，因此在本試驗中對其愈傷組織的誘導率的影響的大小為6-BA＞NAA＞2，4-D。

2.2.2 交互作用分析

通過誘導率與各因素之間的響應面，可以看出各因素間的交互作用對響應值影響的顯著性，相互作用越強響應面的曲線越陡[17-18]。圖1可知，6-BA濃度不變，隨著NAA和2，4-D濃度的增大，誘導率呈先增加后降低的趨勢；從圖1也可看出，NAA和6-BA、6-BA和2，4-D 之間的相互作用對誘導率的影響也相對較小。

2.2.3 最佳試驗條件的確定及驗證

分析得到軟籽石榴葉片愈傷組織誘導率最高的激素配比為6-BA濃度1.578 mg/L，NAA濃度為0.301 mg/L，2，4-D濃度為0.504 mg/L，在此條件下軟籽石榴葉片愈傷組織誘導率預測值為84.307%。調整后，最佳試驗條件為6-BA濃度1.5 mg/L、NAA濃度為0.3 mg/L、2，4-D濃度為0.5 mg/L，經驗證試驗，得到軟籽石榴葉片愈傷組織誘導率為（83.9%±0.8%）。

3 結論

本試驗利用響應面試驗設計方法篩選出不同植物生長調節劑對‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織誘導的影響。翟懿銘等[19]研究證明，此方法是選擇最佳試驗方案的一種高效、直觀試驗設計方法，目前已有將此方法用于植物組培的報道，如武愛龍等[20]、趙欣等[21]、段新鈺等[22]分別對珍珠相思不定芽、黃精以及獼猴桃的研究。試驗結果表明，軟籽石榴葉片誘導愈傷組織的最佳培養基為MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L。本試驗得到了‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織誘導的最佳條件，為石榴繁育技術的改善提供了理論依據。

參考文獻：

[1] 中國農業百科全書總編輯委員會. 中國農業百科全書： 果樹卷[M]. 北京： 農業出版社， 1995： 305-306.

[2] 李庚蘭， 高正清， 梁明泰， 等. 云南軟籽石榴產業發展思路探索[J]. 中國果菜， 2020， 40（4）： 88-90， 105.

[3] 劉雪梅， 潘少香， 譚夢男， 等. 果蔬品質評價技術及其在石榴中的應用進展[J]. 中國果菜， 2023， 43（3）： 55-60.

[4] 孟祥玉， 熊亞， 張素勤， 等. 植物生長調節劑對草石蠶愈傷組織和不定芽誘導的影響[J]. 種子， 2019， 38（10）： 14-18.

[5] 陶興魁， 張愛民， 李佳娣， 等. 軟籽石榴胚離體培養和快繁技術探討[J]. 分子植物育種， 2019， 17（12）： 4054-4060.

[6] 朱立武， 張水明， 宋豐順， 等. 石榴離體培養再生體系的研究[J]. 園藝學報， 2003， 30（2）： 207-208.

[7] 陳延惠， 胡青霞， 譚彬， 等. ‘突尼斯軟籽’石榴葉片愈傷組織再生體系的建立[J]. 經濟林研究， 2012， 30（2）： 83-87.

[8] 彭麗萍， 鄭雷. 軟籽石榴離體葉片愈傷組織誘導條件的優化[J]. 安徽農業科學， 2011（7）： 3835-3836， 3838.

[9] 陳琴， 唐紅亮， 梁機， 等. 利用廣西杉木良種未成熟胚誘導胚性愈傷組織發生[J]. 基因組學與應用生物學， 2017， 36（5）： 2076-2018.

[10]" 高敏霞， 葉新福， 王小安， 等. 植物生長調節劑對辣木（Moringa oleifera Lam.）組培快繁的影響[J]. 分子植物育種， 2016， 14（11）： 3154-3158.

[11]" 沈慶斌， 賴鐘雄， 蔡漢權， 等. 枇杷幼胚培養與體胚誘導植株再生[J]. 江西農業大學學報， 2005（3）： 379-384.

[12]" 史滟滪， 劉艷軍， 楊靜慧， 等. 花椰菜松散型胚性愈傷組織的誘導[J]. 天津農業科學， 2019， 25（5）： 9-12.

[13]" 歐陽歡， 熊遂金， 陳健美， 等. 不同甜橙品種胚性愈傷組織的誘導[J]. 浙江農業科學， 2021， 62（10）： 2000-2004.

[14]" HUANG M， FU L， SUN X， et al. Rapid and highly efficient callus induction and plant regeneration in the starch-rich duckweed strains of Landoltia punctata[J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2016， 5（38）： 1-13.

[15]" 李瑞靜， 田菊， 劉洋. 桃葉衛矛莖段愈傷組織誘導及不定芽再生體系的建立[J]. 中國農學通報， 2022， 38（19）： 18-24.

[16]" 楊云舒， 李榮， 姜子濤. 響應面試驗優化廣棗黃酮的微波提取工藝及黃酮的提純[J]. 食品科學， 2015， 36（22）： 18-24.

[17]" 欒慶祥， 趙楊， 周欣， 等. 單因素試驗結合響應面分析優化杜仲最佳提取工藝[J]. 藥物分析雜志， 2013， 33（5）： 859-865.

[18]" 張黎明， 李瑞超， 郝利民， 等. 響應面優化瑪咖葉總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究[J]. 現代食品科技， 2014， 30（4）： 233-239.

[19]" 翟懿銘， 嚴瑞， 李林山， 等. 響應面法優化大花海棠不定芽誘導技術研究[J]. 種子， 2022， 41（2）： 137-144.

[20]" 武愛龍， 何冰， 吳建陽， 等. 響應面法優化珍珠相思不定芽誘導及增殖培養條件[J]. 分子植物育種， 2020， 18（23）： 7868-7878.

[21]" 趙欣， 豆佳媛， 馬存德， 等. 響應面優化略陽黃精組培快繁技術[J]. 種子， 2020， 39（11）： 147-152.

[22]" 段新鈺， 郭婷語， 王朝蘭， 等. 基于響應面設計莖段形成層培養獼猴桃幼苗的優化研究[J]. 廣西植物， 2021， 41（12）： 2091-2099.