聚乙烯吡咯烷酮抑制蒙古櫟組培褐化效果及其生理響應

摘 要：為降低蒙古櫟（Quercus mongolica）組培過程褐化現象，闡明褐化發生是否與抗氧化酶系統及酚類物質產生有關。以蒙古櫟成熟合子胚為材料，利用組織培養技術優化蒙古櫟再生植株體系獲得再生植株，探究聚乙烯吡咯烷酮（PVP）抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發的生理生化指標的影響。結果表明，PVP 40（40代表PVP平均分子量范圍）抑制褐化效果最佳，添加0. 2 g/LPVP 40不定芽誘導率最高，為71. 17%，其芽增殖系數為3. 90，芽生根率為40. 37%，移栽存活率為73%；PVP降低了蒙古櫟外植體抗氧化酶、多酚氧化酶活性及總酚酶活力，有效抑制褐化現象。PVP有效降低蒙古櫟組培褐化效果抑制褐化不再加劇，優化蒙古櫟器官再生植株體系，分析PVP抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發的內在生理機制，為櫟屬其他樹種抑制褐化提供參考。

關鍵詞：蒙古櫟； 聚乙烯吡咯烷酮； 褐化； 植株再生； 生理生化

中圖分類號：S792. 186 文獻標識碼：A DOI：10. 7525/j. issn. 1006-8023. 2025. 02. 008

0 引言

蒙古櫟（Quercus mongolica）又名蒙櫟、柞櫟、柞樹，為殼斗科（Fagaceae）櫟屬（Quercus）落葉喬木，是東北地區重要的闊葉樹種，具有極高的生態和經濟價值［1-3］ 。蒙古櫟主要靠種子繁殖，由于種子繁育周期性強、發芽率低，易遭受蟲害且繁殖速度慢，而扦插、嫁接等傳統的無性繁殖技術無法滿足蒙古櫟優良植株快速規模化繁殖需求［4］。因此利用組織培養技術既可能保證其優良性狀，又可以縮短培育周期，提高產量和成活率。

國內外先后對櫟類樹種進行了組織培養技術研究，麻櫟（Q. acutissima）［5］、栓皮櫟（Q. variabi?lis）［6］、北美紅櫟（Q. rubra）［7］和冬青櫟（Q. ilex）［8］等多樹種已成功通過組織培養技術建立再生植株體系，獲得再生植株。在蒙古櫟器官發生途徑的植株再生研究中，基部愈傷化、植株玻璃化、培養物褐化及壞死等皆是影響其不定芽誘導及生根效率的原因［9］。蒙古櫟與胡桃楸（Juglans mandshurica）［10］、核桃（Walnut）［11］等闊葉樹種在組培過程中的褐化現象較其他木本植物更易發生，在蒙古櫟合子胚萌發培養階段，發現褐化嚴重影響合子胚的萌發率。已知添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可通過控制酚類物質的產生或降低外植體死亡率來改善這些情況的發生［12］，楊旭風等［13］證明了丙二醛（MDA）含量過高對細胞具有毒害作用，主要影響植物細胞中超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶的活性，進而導致植物組織內活性氧動態失衡，激發過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性，催化大量酚類物質轉變成醌類物質導致褐化，地涌金蓮（Musella lasiocarpa）等植物在組織培養中褐化加重時PPO活性和總酚酶活力均較高［14］。然而蒙古櫟組培過程褐化現象是否與抗氧化酶系統及酚類物質產生有關尚需研究。

本研究探究了不同類型PVP對蒙古櫟合子胚萌發及無菌苗莖段的不定芽誘導、不定芽增殖和生根培養的影響，通過分析PVP對蒙古櫟合子胚萌發及組培抑制褐化處理的內在生理機制，降低外植體褐化率，建立高效穩定、重復性良好的蒙古櫟器官發生再生體系，為櫟屬其他樹種抑制組織培養過程中的褐化現象提供參考，為今后應用蒙古櫟組織培養技術并利用分子手段進行遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

材料取自東北林業大學哈爾濱市城市林業示范基地，于2022年9月中上旬采集棕色或紅棕色的蒙古櫟成熟種子并分裝，挑選無蟲眼的成熟種子放置在4 ℃冰箱儲存備用。

1. 2 外植體制備與消毒

將種子在流水下沖洗2 h去除表面雜質，在超凈臺內去除殼斗和種皮，用75%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗3次，選擇2%次氯酸鈉（NaClO）和1%氯化汞（HgCl2）分別浸泡消毒7、10、20 min，后用無菌水清洗5次，滅菌過程震蕩或攪拌使外植體與消毒液充分接觸。在超凈工作臺上用無菌濾紙吸干材料表面水分，將合子胚子葉朝上接種在培養基上。以1/2 MS（Murashige and Skoog）培養基為基本培養基，附加不同質量濃度的萘乙酸（NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、吲哚丁酸（IBA），30 g/L 蔗糖及7 g/L 瓊脂，滅菌前調整pH為5. 8（本研究中基本培養基若未特別注明皆為1/2 MS培養基，蔗糖和瓊脂質量濃度不變）。每個處理培養15個外植體，重復3次，觀察并統計外植體污染率。

污染率（%） = （污染數÷ 接種數） × 100%。（1）

1. 3 PVP抑制褐化處理與蒙古櫟合子胚萌發

將消毒后的合子胚分別接種在添加PVP 30（0. 2、0. 4、0. 6 g/L）和PVP 40（0. 2、0. 4、0. 6 g/L）的萌發培養基（培養基制備同1. 2）上（PVP 30和PVP40中的30和40代表PVP平均分子量范圍），以不添加PVP為對照，每個處理培養15個外植體，重復3次。30 d后觀察統計7種不同抑制褐化處理的合子胚萌發率（%）、褐化率（%）、根系長度（cm）及根面積（cm2），根長、根面積使用根系掃描儀進行測定，重復3次，每次10個樣本。

褐化率（%） = （褐化數÷ 接種數） × 100%。（2）

萌發率（%） = （萌發數÷ 接種數） × 100%。（3）

1. 4 不定芽誘導培養

以萌發獲得的無菌苗莖段為材料，取其莖段切成1～2 cm左右小段，沿形態學方向接種在添加PVP40（0. 2、0. 4、0. 6 g/L）和6-BA（0. 2、0. 4、0. 6 mg/L）的誘導培養基（培養基制備同1. 2）上。每個處理培養15個外植體，重復3次，30 d后觀察并統計芽長度（cm）、不定芽數量（個）及外植體褐化情況，計算不定芽誘導率（%）。

不定芽誘導率（%）=（誘導數÷接種數）×100%。（4）

1. 5 不定芽增殖培養

將誘導獲得的不定芽轉移到增殖培養基上培養，培養基中添加0. 2 g/L PVP 40與不同質量濃度的6-BA（0. 2、0. 4、0. 6 mg/L），觀察6-BA質量濃度對不定芽增殖的影響。每個處理培養15個外植體，重復3次，30 d后觀察統計蒙古櫟不定芽生長情況及增殖系數。

增殖系數= 再生芽總數÷ 接種芽數。（5）

1. 6 生根培養與煉苗移栽

將增殖后生長良好的組培苗轉入生根培養基，分別在培養基中添加不同質量濃度的NAA（0. 1、0. 25、0. 5 mg/L）和IBA（0. 1、0. 25、0. 5 mg/L），每個處理培養10個外植體，重復3次，培養初期暗培養7 d后轉到正常光照培養，2周后觀察統計幼苗生根率及生根情況。

煉苗和移栽：選擇生長良好、根系健壯的組培苗，揭開培養瓶封口膜并放置在培養室內環境下， 7 d后置于溫室內煉苗移栽，清洗干凈幼苗根系上殘留的培養基，移栽至草炭土∶蛭石∶珍珠巖體積比例為2∶1∶1的營養基質上，選擇弱光下培養，光照時間16 h/d，培養溫度為25 ℃±0. 5 ℃，定期澆水保持基質的含水率為50%～60%，2周后統計再生植株的成活率。

生根率（%） = （生根苗數÷ 接種數） × 100%。（6）

成活率（%） = （成活數÷ 移栽數） × 100%。（7）

1. 7 PVP抑制蒙古櫟合子胚褐化的生理生化指標測定

將消毒后的蒙古櫟合子胚接種在添加PVP 30及PVP 40的萌發培養基中，以不添加PVP作為對照（CK），每個處理隨機設置3個重復，每個重復接種外植體10個，萌發過程中每5 d取材1次，共取至第30 d（取材時間為0、5、10、15、20、25、30 d），將待測材料快速切碎混合均勻后液氮冷凍保存于-80 ℃冰箱內，用于不同類型PVP抑制蒙古櫟合子胚褐化的生理生化指標含量的測定，每個處理設置3個重復，每個樣品質量0. 1 g，每個指標共63個樣品，8個指標共504個樣品。

可溶性糖、可溶性淀粉含量采用蒽酮比色法，可溶性蛋白采用考馬斯亮藍法［15］；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑NBT還原法［16］；過氧化物酶（POD）活性采用愈創木酚比色法［15］；過氧化氫酶（CAT）活性采用過氧化氫法［16］；多酚氧化酶（PPO）活性采用鄰苯二酚法，總酚（TP）酶活力測定采用福林酚法［15］。

1. 8 數據分析

所有試驗數據經 Excel 2010整理統計后，利用SPSS Statistics 22. 0使用單因素方差分析（ANOVA）、最小顯著性差異法（LSD）和鄧肯（DUCAN）多重比較分析不同PVP處理組合下蒙古櫟合子胚萌發率、褐化率、不定芽誘導率、增殖率、生根率及蒙古櫟合子胚萌發的酶活性等生理指標的顯著性差異，在P=0. 05水平上進行顯著性檢驗，百分數數據在統計分析前先進行反正弦轉換，方差分析結果以均值±標準差（xˉ ± s）表示，采用不同小寫字母表示Plt;0. 05水平下的差異性顯著；圖像均用Origin軟件進行制圖。

2 結果與分析

2. 1 消毒劑及消毒時間對蒙古櫟合子胚消毒效果的影響

消毒劑及消毒時間對蒙古櫟合子胚消毒效果差異顯著，見表1。2種消毒劑對蒙古櫟合子胚消毒效果差異顯著，1% HgCl2消毒效果優于2% NaClO。隨著消毒時間的增加，污染率及褐化率下降，萌發率顯著升高。因此，選擇1% HgCl2作為蒙古櫟合子胚消毒劑，消毒時間20 min。

2. 2 PVP抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發的影響

蒙古櫟成熟種子平均長2. 16 cm、寬1. 31 cm，單粒質量3. 59 g。不同類型PVP抑制蒙古櫟合子胚褐化效果差異顯著，見表2。由圖1可知，與對照組相比，培養基中添加PVP可以降低蒙古櫟合子胚褐化率，PVP質量濃度提高褐化率隨之降低，最低為31%。PVP 40 較PVP 30 抑制褐化效果差異顯著（Plt;0. 05），當PVP 40質量濃度為0. 4 g/L時，萌發率最高73. 8%，根系長度為8. 04 cm，根面積為10. 39 cm2，高質量濃度的PVP不利于蒙古櫟合子胚萌發。因此，添加0. 4 g/L PVP 40對蒙古櫟合子胚萌發抑制褐化效果最佳。

2. 3 不同質量濃度PVP及6-BA組合對蒙古櫟不定芽誘導的影響

不同質量濃度PVP及6-BA組合對蒙古櫟不定芽誘導效果不同，見表3及圖2。對照組不定芽啟動時間晚，不定芽數量少、褐化率高；隨著6-BA質量濃度增加不定芽誘導率提高，質量濃度為0. 2 mg/L時最高，為71. 17%，芽生長健壯；褐化率隨PVP 質量濃度提高顯著下降。綜上，添加0. 2 g/L PVP 40與0. 2 mg/L 6-BA的培養基為蒙古櫟不定芽誘導的最適培養基。

2. 4 6-BA質量濃度對蒙古櫟不定芽增殖的影響

將誘導培養30 d的不定芽轉移到增殖培養基上，6-BA質量濃度對不定芽增殖效果顯著，見表4及圖3。添加0. 6 mg/L 6-BA增殖系數最高，為4. 2，但多數葉片不舒展，出現輕微玻璃化。6-BA質量濃度為0. 4 mg/L時，芽長勢良好，平均苗高3. 90 cm，莖段生長健壯。隨著6-BA質量濃度逐漸升高，不定芽增殖系數增大，腋芽萌動較快，但葉片出現玻璃化，高質量濃度的生長素不利于不定芽增殖。

2. 5 蒙古櫟不定芽生根及煉苗移栽

NAA和IBA對蒙古櫟不定芽生根效果的影響差異顯著（Plt;0. 05），添加NAA不定芽生根效果優于添加IBA的培養基，見表5及圖4，添加0. 25 mg/L NAA生根率最高為40. 37%。添加IBA（0. 01、0. 25 mg/L）根黃白色較短、無須根；添加NAA（0. 25 mg/L），根系較為粗壯。暗培養7 d后，生根效果有所增加，但葉片開始輕微發黃，隨著NAA與IBA質量濃度（0. 5 mg/L）的增加生根率下降，基部少量愈傷化，分化出的根系細弱相對較短，且不再繼續生根，表明單一較高質量濃度的植物生長調節劑會抑制蒙古櫟不定芽生根的效果。

將已生根30 d的蒙古櫟莖段，選擇生長健壯的幼苗進行煉苗3 d，煉苗移栽后的小植株，移栽到草炭土∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1的營養基質中進行馴化培養（圖4（g））。培養2周后，統計蒙古櫟再生植株的存活率為73%（圖4（h））。

2. 6 PVP抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發的生理生化影響

2. 6. 1 PVP抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發的可溶性糖、可溶性淀粉、可溶性蛋白質量分數的影響

淀粉、糖作為儲能物質為植物生長代謝活動提供物質能量，不同類型PVP抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發的營養物質質量分數的影響差異顯著，如圖5所示。本研究中CK與PVP 30處理組的可溶性糖質量分數呈上升下降趨勢，PVP 40變化趨勢不規則（圖5（a））。第0～10天處理組可溶性糖質量分數均高于對照組，第10天達到峰值，PVP 40處理組最高，為62. 87 mg/g?？扇苄缘矸圪|量分數均呈上升趨勢（圖5（b））；除第10～20天，PVP處理組可溶性淀粉質量分數均高于CK，PVP 40處理組質量分數第30 天達到最大值，為56. 64 mg/g。處理組與CK可溶性蛋白質量分數呈現上升趨勢，在整體培養周期內差異不顯著（圖5（c））；處理組在培養周期末質量分數達到最大值，PVP 30可溶性蛋白質量分數為27. 23 mg/g，PVP 40質量分數為27. 42 mg/g。

2. 6. 2 PVP抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發的酶活性及總酚酶活力的影響

不同類型PVP抑制褐化處理對蒙古櫟合子胚萌發的酶活性及總酚酶活力影響差異顯著（Plt;0. 05）。處理組抗氧化酶活性先上升后下降，如圖6所示。PVP處理組與對照組SOD活性差異顯著，處理組均低于對照組，未添加PVP處理的合子胚在接種5 d時SOD 活性達到高峰，為16. 69 U/g（圖6（a））。除第10～20天對照組POD活性顯著高于PVP處理組，對照組POD活性第10天最高，為77. 75 U/g，PVP 40第10天時最高，為54. 76 U/g，添加PVP能夠降低POD活性。PVP處理下蒙古櫟合子胚CAT活性低于對照差異顯著，PVP 30 與PVP 40 在第10 天達到峰值，分別為24. 72、26. 40 U/g，對照組CAT活性呈現波動式變化，可能是培養基成分及合子胚萌發過程的差異性造成的。

外植體培養第15天和第25天恰好是外植體褐化嚴重的時期。PVP處理組的蒙古櫟合子胚PPO活性顯著低于對照（圖6（d））；在第25天褐化情況加重；PPO活性小范圍上升，PVP 40始終處于較低水平。PVP處理蒙古櫟合子胚萌發的總酚酶活力變化差異顯著；對照組總酚酶活力高于PVP處理組，PVP處理組呈波動式變化，總酚酶活力越高褐化現象越嚴重。添加PVP可以抑制蒙古櫟成熟合子胚中酚類物質的產生，從而抑制蒙古櫟成熟合子胚褐化。

3 討論與結論

在植物組培中，外植體褐化現象嚴重阻礙組織培養的順利進行，本研究通過添加2種類型的PVP抑制蒙古櫟合子胚萌發褐化效果，萌發培養基中添加0. 4 g/L PVP 40抑制褐化效果最佳；0. 2 g/L PVP40促進蒙古櫟莖段不定芽誘導及增殖，不定芽增殖系數3. 90，芽生長健壯；NAA和IBA均能誘導不定芽生根，0. 25 mg/L NAA 生根效果最好，生根率40. 37%，這與劉曉紅等［17］對地被小菊（Chrysanthe?mum morifolium）的研究結果一致。蒙古櫟組培苗移栽存活率為73%；添加PVP處理合子胚萌發過程營養物質質量分數有所提高，酶活性及總酚酶活力顯著降低，表明PVP抑制外植體褐化效果從而提高植物新陳代謝能力，促進生長發育，PVP 40對萌發褐化效果抑制優于PVP 30處理效果。

木本植物器官發生能否獲得再生植株，通常有很多影響因素，外植體類型、母樹基因型、基本培養基類型、植物外源激素和培養環境條件等［18］。大量研究發現，單獨使用細胞分裂素也可以誘導不定芽的發生［19］，隨著6-BA質量濃度逐漸升高，不定芽增殖系數增大，腋芽萌動較快，但葉片干枯玻璃化還易產生矮小芽，不利于后續生根培養［20］，側柏古樹組織培養過程也有相同發現［21］；相比較豎向放置，莖段橫向放置不定芽生長更快，數量更多。在黃樟（Cinnamomum porrectum）的研究中發現生根前添加有機物質可以生根壯苗，暗培養生根效果有所增加［22］。

PVP通過降低蒙古櫟合子胚萌發過程中抗氧化酶活性和總酚酶活力有效抑制外植體褐化效果。PPO催化酚類物質氧化為醌類物質，PPO活性高低影響外植體褐化效果［23］，酚類物質在被多酚氧化酶氧化之前，PVP對其進行吸附，使其不能形成醌類物質，從而抑制褐化［24］。肖婧一等［25］在5種抗褐化劑對草莓莖尖褐化及誘導分化研究中發現，0. 5 g/LPVP抑制褐化效果最好，可起到破壞酚-酶復合物結構而達到抑制褐化的目的。外植體類型不同在組織培養過程中褐化的程度有所差別，通常生長狀態健壯的外植體，褐化率會大幅度降低［26］。綜上所述，PVP能夠抑制蒙古櫟外植體褐化現象從而提高不定芽誘導率促進再生植株成活，本研究優化了蒙古櫟組織培養再生體系，并分析了PVP抑制蒙古櫟組織培養物的褐化效果及其生理響應，可為蒙古櫟及其他櫟屬樹種組織培養過程中解決外植體褐化問題提供參考。

【參 考 文 獻】

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基金項目：國家重點研發計劃（2023YFD2200103）；中央高?；究蒲袠I務費專項資金項目（2572023CT02）。