微生物檢測(cè)中常用液體培養(yǎng)基的保存期限試驗(yàn)研究

摘 要：研究實(shí)驗(yàn)室4種常用選擇性和鑒別液體培養(yǎng)基的保存條件及有效期。滅菌后的培養(yǎng)基用封分口膜密封，并分別于2～8 ℃和常溫避光保存，在不同時(shí)間段（2～8 ℃保存條件下，分別在第15、30、45天和60天；常溫保存條件下，分別在第1、3、5天和7 天）通過接種目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌來驗(yàn)證培養(yǎng)基的選擇性和生長(zhǎng)率情況。結(jié)果表明，所有試驗(yàn)時(shí)間段內(nèi)，4種液體培養(yǎng)基的選擇性和生長(zhǎng)率均滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。

2～8 ℃密封避光保存60 d的4種液體培養(yǎng)基可用；常溫密封避光保存7 d的4種液體培養(yǎng)基可用。

關(guān)鍵詞：微生物；培養(yǎng)基；保存期限

Research on the Shelf Life of Commonly Used Liquid Culture Media in Microbiological Detection

SONG Yingying1， WANG Hongying2， GU Min1， ZHANG Rui1

（1.Gansu Analysis and Research Center， Lanzhou 730000， China; 2.Gansu Vocational College of Agriculture， Lanzhou 730000， China）

Abstract： The storage conditions and expiration dates of four commonly used selective and discriminative liquid media in research laboratories. The sterilized medium was sealed with parafilm and stored at 2～8 ℃ and room temperature in the dark， respectively. At different time periods （2～8 ℃， at 15， 30， 45 and 60 days， respectively; stored at room temperature at 1， 3， 5 and 7 days， respectively.）， the selectivity and growth rate indexes of the medium were verified by inoculating target bacteria and non-target bacteria. The results showed that the selectivity and growth rate of the four liquid media met the requirements of the relevant standards in all test periods. Four kinds of liquid medium were available for 60 days at 2～8 ℃. Four kinds of liquid media were used for 7 days of sealed and dark storage at room temperature.

Keywords： microorganisms; culture medium; shelf life

微生物檢測(cè)工作涵蓋范圍廣且工作量大，專業(yè)性強(qiáng)，在質(zhì)量上有著嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。在整個(gè)微生物檢驗(yàn)流程中，培養(yǎng)基的配制及保存極為關(guān)鍵，它不僅是開展后續(xù)檢驗(yàn)工作的基石，更是決定檢驗(yàn)準(zhǔn)確性和有效性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-3]，對(duì)培養(yǎng)基的質(zhì)量進(jìn)行控制能有效地確保微生物檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[4-5]。

微生物檢驗(yàn)工作具有較強(qiáng)的突發(fā)性和時(shí)效性，實(shí)驗(yàn)室通常要隨時(shí)做好培養(yǎng)基的準(zhǔn)備工作以保證樣品的即送即檢，確保檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及有效性[6-7]。目前，微生物實(shí)驗(yàn)室通常使用商品化培養(yǎng)基，包括即用型和脫水合成培養(yǎng)基。即用型培養(yǎng)基只要按照供應(yīng)商提供的貯存條件保存，并在有效期內(nèi)按照正確方法使用，即可確保培養(yǎng)基的質(zhì)量；脫水合成培養(yǎng)基在使用時(shí)，檢驗(yàn)人員要對(duì)其進(jìn)行配制并在滅菌后方可使用[8]。但目前對(duì)滅菌后的脫水培養(yǎng)基的保存條件及保存期限沒有明確要求，故眾多學(xué)者對(duì)培養(yǎng)基保存條件及期限展開了研究。劉靜等[9]對(duì)幾種微生物致病菌檢測(cè)用平板培養(yǎng)基的保存有效期進(jìn)行了探究，結(jié)果表明，在4 ℃冷藏15 d時(shí)，這幾種平板培養(yǎng)基仍具備可使用性，標(biāo)準(zhǔn)菌株在該培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況良好。翁嘉等[10]對(duì)胰酪大豆胨瓊脂和沙氏葡萄糖瓊脂兩種藥品微生物計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的保存期限進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，兩種培養(yǎng)基在2～8 ℃和常溫避光保存條件下存放180 d后，其適應(yīng)性檢查結(jié)果在0.5～2.0，滿足使用要求。高嘉明等[11]研究了滅菌后平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基的貯存條件，結(jié)果表明，平板計(jì)數(shù)瓊脂在55 ℃恒溫保存3 d后，其理化性能及生長(zhǎng)率均滿足質(zhì)控要求。余佳珍等[12]研究了經(jīng)脈動(dòng)真空滅菌器處理的7.5%氯化鈉肉湯、緩沖蛋白胨水和月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯的儲(chǔ)存期限，結(jié)果表明，在2～8 ℃保存35 d時(shí)，3種培養(yǎng)基的pH值、無(wú)菌性和質(zhì)控指標(biāo)均符合質(zhì)量控制要求。然而，微生物檢測(cè)過程中使用的培養(yǎng)基種類繁多，包括固體培養(yǎng)基（平板、斜面）和液體培養(yǎng)基，以上研究多針對(duì)常用的固體培養(yǎng)基。

本文選擇了食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中大腸菌群計(jì)數(shù)[13]（MPN法）、大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)[14]（MPN法）和糞大腸菌群計(jì)數(shù)[15]使用的月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（Lauryl Sulfate Tryptose Broth，LST）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（Brilliant Green Lactose Bile Broth，BGLB）、EC肉湯，以及水質(zhì)糞大腸菌群[16-17]測(cè)定（多管發(fā)酵法）所用的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2024）[8]，以選擇性和生長(zhǎng)率為主要驗(yàn)證指標(biāo)，結(jié)合培養(yǎng)基狀態(tài)以及pH值對(duì)以上常用液體培養(yǎng)基的保存條件及期限進(jìn)行試驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇性液體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：LST、BGLB、EC肉湯；鑒定培養(yǎng)基：乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基；接種計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）。上述培養(yǎng)基均由北京陸橋技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希氏菌CICC 24176、弗氏檸檬酸桿菌CICC 10296、糞腸球菌CICC 23658、腸沙門氏菌腸亞種腸炎血清型CICC 21513。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ1000電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；LDZM-60L-Ⅲ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；HR30-IIA2生物安全柜，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；BSP-250生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；310RS-232數(shù)字式溫濕度計(jì)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

準(zhǔn)確稱取乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基35.0 g，加入1 000 mL蒸餾水，攪拌使其充分溶解，將培養(yǎng)基分裝入含杜氏小管的試管中，每管10 mL，115 ℃滅菌15 min；分別準(zhǔn)確稱取月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯35.6 g、煌綠乳糖膽鹽肉湯40.0 g、EC肉湯37.0 g，加入1 000 mL蒸餾水，攪拌使其充分溶解，將培養(yǎng)基分裝入含杜氏小管的試管中，每管10 mL，121 ℃滅菌15 min。滅菌完成待冷卻至室溫后，在無(wú)菌環(huán)境下，使用封口膜對(duì)每支試管進(jìn)行密封。隨后，每12支試管為一組，其中3支用于培養(yǎng)基狀態(tài)觀察，3支用于pH值測(cè)定，3支用于接種，3支為空白對(duì)照。分組后的液體培養(yǎng)基用塑料袋密封，分別于2～8 ℃和常溫密封避光保存。

1.3.2 培養(yǎng)基質(zhì)量測(cè)試

參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[8]，以生長(zhǎng)率、選擇性及生化特性為驗(yàn)證指標(biāo)，進(jìn)行培養(yǎng)基質(zhì)量測(cè)試。生長(zhǎng)率：用半定量方法將適量測(cè)試菌株的菌懸液接種至液體培養(yǎng)基中，用目測(cè)的濁度值評(píng)估，0表示無(wú)渾濁、1表示輕微的渾濁、2表示明顯的渾濁，同時(shí)記錄小導(dǎo)管收集氣體的體積比。選擇性：將適量測(cè)試菌株的菌懸液接種至選擇性培養(yǎng)基中，以陽(yáng)性和陰性（不生長(zhǎng)）表示。4種常用液體培養(yǎng)基的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)見表1。生化特性：在2～8 ℃保存條件下，分別在第15、30、45天和60天觀察各液體培養(yǎng)基狀態(tài)（顏色和澄清度），測(cè)量pH值，并接種相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株（表1）進(jìn)行質(zhì)量控制試驗(yàn)，空白對(duì)照組接種等量無(wú)菌蛋白胨水；常溫保存條件下，分別在第1、3、5天和7天觀察各液體培養(yǎng)基狀態(tài)（顏色和澄清度），測(cè)量pH值，并接種相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株（表1）進(jìn)行質(zhì)量控制試驗(yàn)，空白對(duì)照接種等量無(wú)菌蛋白胨水。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液制備

將大腸埃希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌和沙門氏菌分別劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，將糞腸球菌劃線接種于血瓊脂平板上，36 ℃培養(yǎng)18～20 h后，保存于2～8 ℃冰箱中。每次試驗(yàn)前，從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分別挑取4種標(biāo)準(zhǔn)菌株的單菌落，分別接種至裝有10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，36 ℃培養(yǎng)18～20 h，然后采用10倍稀釋法，用無(wú)菌蛋白胨水將4種標(biāo)準(zhǔn)菌株稀釋至所需的適宜濃度，備用。

1.3.4 選擇性液體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基半定量測(cè)試

在待測(cè)培養(yǎng)基中接種10～100 CFU的目標(biāo)菌，同時(shí)接種1 000～5 000 CFU的非目標(biāo)菌，接種3個(gè)平行試管，接種體積0.5 mL，混勻，按表1中的條件培養(yǎng)。同時(shí)，將相同體積的目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌懸液傾注TSA平板，計(jì)數(shù)接種量，每組傾注2個(gè)培養(yǎng)皿。

1.3.5 鑒定培養(yǎng)基定性測(cè)試

吸取0.05 mL標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液（約109 CFU·mL-1）置于待測(cè)培養(yǎng)基內(nèi)，按表1中的條件進(jìn)行培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

4種培養(yǎng)基在不同保存條件下的變化以及質(zhì)量控制情況見表2～表4。

對(duì)于LST，在2～8 ℃和常溫密封避光保存條件下，隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，不同保存時(shí)間下的LST顏色、澄清度和pH值（表2）均未發(fā)生明顯變化。質(zhì)量控制試驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示，各保存時(shí)間段內(nèi)，目標(biāo)菌大腸埃希氏菌和弗氏檸檬酸桿菌在LST培養(yǎng)基中均生長(zhǎng)良好，有明顯的渾濁現(xiàn)象（渾濁度2），且小導(dǎo)管內(nèi)氣體充滿管內(nèi)1/3及以上；而非目標(biāo)菌糞腸球菌在LST培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)，未出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。2～8 ℃保存60 d和常溫保存7 d的LST培養(yǎng)基的選擇性和生長(zhǎng)率滿足選擇性計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)要求。

對(duì)于BGLB，在2～8 ℃和常溫保存條件下，隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色、澄清度和pH值（表2）均未發(fā)生明顯變化。由表3可以看出，各保存時(shí)間段內(nèi)，目標(biāo)菌大腸埃希氏菌和弗氏檸檬酸桿菌在BGLB培養(yǎng)基中均生長(zhǎng)良好，有明顯的渾濁現(xiàn)象（混濁度2），且小導(dǎo)管內(nèi)氣體充滿管內(nèi)1/3及以上；而非目標(biāo)菌糞腸球菌在BGLB培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)，未出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。說明2～8 ℃保存60 d和常溫保存7 d的BGLB培養(yǎng)基的選擇性和生長(zhǎng)率滿足選擇性計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)要求。

對(duì)于EC肉湯，在2～8 ℃和常溫保存條件下，隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，不同保存時(shí)間下的EC肉湯顏色、澄清度和pH值（表2）均未發(fā)生明顯變化。質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示，各保存時(shí)間段內(nèi)，目標(biāo)菌大腸埃希氏菌在EC肉湯中均生長(zhǎng)良好，有明顯的渾濁現(xiàn)象（渾濁度2），且小導(dǎo)管內(nèi)氣體充滿管內(nèi)1/3及以上；而非目標(biāo)菌糞腸球菌在EC肉湯中不生長(zhǎng)，未出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。說明2～8 ℃保存60 d和常溫保存7 d的EC肉湯的選擇性和生長(zhǎng)率滿足選擇性計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)要求。

對(duì)于乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，在2～8 ℃和常溫保存條件下，隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，不同保存時(shí)間下的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基顏色、澄清度和pH值（表2）均未發(fā)生明顯變化。質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表4）顯示，各保存時(shí)間段內(nèi)，目標(biāo)菌大腸埃希氏菌在乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，有明顯的渾濁現(xiàn)象，培養(yǎng)基變成黃色呈陽(yáng)性，同時(shí)小導(dǎo)管內(nèi)有氣體；而非目標(biāo)沙門氏菌在乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)，未出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，培養(yǎng)基顏色沒有變化呈陰性。說明2～8 ℃保存60 d和常溫保存7 d的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基的生化特性滿足鑒定培養(yǎng)基的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 結(jié)論與討論

在2～8 ℃和常溫密封避光保存的條件下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，4種液體培養(yǎng)基的顏色、澄清度和pH值均未發(fā)生明顯變化。接種質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)菌株后，目標(biāo)菌株均生長(zhǎng)良好，而非目標(biāo)菌均不生長(zhǎng)，4種培養(yǎng)基的質(zhì)控指標(biāo)均滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。

培養(yǎng)基質(zhì)量控制是微生物檢驗(yàn)檢測(cè)質(zhì)量控制過程中的重要環(huán)節(jié)，而水分則是影響培養(yǎng)基質(zhì)量的重要因素[18]。培養(yǎng)基水分含量的變化，會(huì)改變培養(yǎng)基中各種成分的比例和pH值，進(jìn)而導(dǎo)致培養(yǎng)基無(wú)法滿足培養(yǎng)微生物需要的生長(zhǎng)繁殖條件，導(dǎo)致培養(yǎng)基失效。研究表明[19-20]，減少培養(yǎng)基中的水分流失，同時(shí)控制微生物污染，能使培養(yǎng)基的存放有效期顯著增長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)室配制的液體培養(yǎng)基在低溫（2～8 ℃）且密封的保存條件下，能有效減少培養(yǎng)基中水分的流失和空氣中微生物的污染，培養(yǎng)基的保存期限能達(dá)到60 d。

本次試驗(yàn)結(jié)果可為實(shí)驗(yàn)室配制的脫水合成液體培養(yǎng)基的保存方法提供一定的數(shù)據(jù)支撐，為食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中大腸菌群計(jì)數(shù)（MPN法）、大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)（MPN法）和糞大腸菌群計(jì)數(shù)，以及水質(zhì)糞大腸菌群（多管發(fā)酵法）的檢測(cè)提供有力的物質(zhì)保障，有助于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員提前準(zhǔn)備培養(yǎng)基，從而及時(shí)高效地完成這些項(xiàng)目的檢測(cè)工作，且能在一定程度上減少不必要的試劑浪費(fèi)，降低檢驗(yàn)檢測(cè)成本。

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基金項(xiàng)目：甘肅省科技計(jì)劃資助（24CXNA057）。

作者簡(jiǎn)介：宋瑛瑛（1988—），女，甘肅天水人，碩士，助理研究員。研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。