超高效液相色譜-串聯質譜法測定酵素梅中12種酚汀（酚丁）、酚酞及其酯類衍生物或類似物?

摘 要：目的：建立超高效液相色譜-串聯質譜儀法測定酵素梅中非法添加的酚汀（酚丁）、酚酞及其酯類衍生物或類似物。方法：樣品經水、甲醇超聲提取，采用C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱分離，以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇為流動相，梯度洗脫，流速0.2 mL·min-1；通過ESI源（正離子）選擇反應監測模式進行定性、定量監測。結果：12種非法添加組分在各自濃度范圍內線性關系良好，相關性系數均大于0.997。在1倍檢出限、2倍檢出限、5倍檢出限3種添加濃度下的平均回收率在93.0%～123.0%，精密度在0.26%～8.58%。結論：該方法靈敏度高、操作簡單、測定快速，可用于酵素梅中12種非法添加藥物的測定。

關鍵詞：超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）；非法添加；酚丁；酚酞；酯類衍生物或類似物

Determination of 12 Oxyphenisatin， Phenolphthalein and Their Ester Derivatives or Analogues in Enzyme Plum by UPLC-MS/MS

LI Xiaofei

（Dalian Product Quality Inspection and Testing Institute Co.， Ltd.， Dalian 116023， China）

Abstract： Objective： To establish a ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the determination of illegally added oxyphenisatin， phenolphthalein， and their ester derivatives or analogues in enzyme plum. Method： The sample was extracted by ultrasound with water and methanol， and separated using a C18 （50 mm×2.1 mm， 1.8 μm） chromatographic column. The mobile phase was 0.1% formic acid aqueous solution-0.1% formic acid methanol， with gradient elution at a flow rate of 0.2 mL·min-1; the detector selected a reaction monitoring mode for qualitative and quantitative monitoring using ESI source （positive ions）. Result： The results showed that the 12 illegally added components had good linear relationships within their respective concentration ranges， with correlation coefficients greater than 0.997. The average recovery rate of the three added concentrations of detection limit， 2-fold detection limit， and 5-fold detection limit is between 93.0% to 123.0%， precision between 0.26% to 8.58%. Conclusion： This method has high sensitivity， simple operation， and fast determination， and can be used for the determination of 12 illegal added drugs in enzyme plum.

Keywords： ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; illegal addition; oxyphenisatin; phenolphthalein; ester derivatives or analogues

酚汀（酚丁）、酚酞及其酯類衍生物或類似物均為臨床上使用的緩瀉劑，通過促排達到減肥的目的。這些藥物一旦過量使用便會改變人體機能，造成人體器官衰竭。2023年10月國家市場監管總局發布了《關于打擊食品中非法添加酚汀（酚丁）、酚酞及其酯類衍生物或類似物違法行為的通知》，列舉了我國多地區查辦的宣稱“減肥”功能食品非法添加藥品、藥品衍生物或類似物系列案件，并指出在食品中檢出酚汀（酚丁）、酚酞及其酯類衍生物或類似物（如4-氯雙醋酚丁），均屬于非法添加。

目前，檢測非法添加化學藥物的方法主要有高效液相色譜法[1]，液相色譜-三重四極桿質譜法[2-3]，液相色譜-高分辨質譜法[4]等。對于新型的非法添加化合物，國家補充檢驗方法有利用液相色譜-質譜聯用法（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）對雙醋酚丁進行定性及定量分析[5]，對于其他酚丁類化合物及衍生物現階段沒有國家標準或檢測方法進行技術支撐，因此有必要盡早建立起酚汀（酚丁）、酚酞及其酯類衍生物或類似物的檢測方法，為食品藥品監管部門打擊非法添加行為提供技術標準，以保障公眾健康。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀（ESI源）；超聲波清洗器；甲醇（色譜級）；乙腈（色譜級）；超純水；甲酸（色譜級）、甲酸銨（色譜級）。

標準品：酚酞、百里香酚酞、雙辛酚丁、4-氯雙醋酚丁、雙丙酚丁、雙戊酚丁、4-氯酚丁、雙丁酚丁、酚汀、雙醋酚丁、雙己酚丁、雙庚酚丁，濃度為1 000 μg·mL-1。

混合標準溶液A（百里香酚酞濃度為10 mg·L-1、雙辛酚丁濃度為5 mg·L-1，其余化合物濃度均為2 mg·L-1）：取百里香酚酞標準原液100 μL、雙辛酚丁標準原液50 μL，其余各標準原液20 μL于同一容量瓶中（10 mL），用甲醇稀釋定容至刻度。

混合標準曲線溶液：分別取混合標準溶液A 0.005、0.010、0.020、0.050 mL和0.100 mL于5個10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，混勻。最終配制成百里香酚酞濃度為5、10、20、50、100 ng·mL-1；雙辛酚丁濃度2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 ng·mL-1；其余化合物濃度為1、2、4、10、20 ng·mL-1的標準曲線工作溶液。

1.2 樣品的前處理方法

稱取樣品1.00 g，置于10 mL刻度管中，加入2 mL水，渦旋混勻，再加入8 mL甲醇，超聲提取30 min，放冷后，離心后2 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜后，供超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀測定。

1.3 UPLC-MS/MS條件

1.3.1 UPLC條件

色譜柱：C18（50 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；進樣量：2 μL；流速：0.20 mL·min-1；流動相A：0.1%甲酸；流動相B：0.1%甲酸甲醇；流動相梯度：0～0.2 min，5% B；0.2～5.0 min，5%→15%B；5.0～10.0 min，15%→90% B；10.0～12.0 min，90%→100% B；12.0～13.0 min，100% B；13.0～13.5 min，100%→10% B，采集時間為16 min。

1.3.2 MS/MS條件

電噴霧離子源（Electrospray Ionization，ESI），多反應監測模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM），正離子模式，毛細管電壓：2.0 kV；錐孔反吹氣：10 L·Hr-1；脫溶劑溫度：450 ℃；離子源溫度：150 ℃。定性離子對、定量離子對及其他質譜參數見表1。

1.3.3 結果計算

按外標法制作標準工作曲線，并據此得到樣品中各化合物含量。樣品中各化合物的含量計算公式如下。

（1）

式中：X為樣品中各化合物的含量，μg·kg-1；C為上機待測液中各化合物的濃度，ng·mL-1；V1為最終定容體積，mL；m為試樣的質量，g。

2 結果與分析

2.1 條件優化

2.1.1 質譜條件優化

將各化合物配制成濃度為100 ng·mL-1的單標溶液，采用針泵持續進樣的方式，利用儀器自動調諧功能，依次對各化合物進行自動優化，得到各化合物的錐孔電壓與碰撞能量的最佳參數，見表1。

2.1.2 液相色譜條件的優化

本實驗采用實驗室常用的甲醇、乙腈、甲酸水、甲酸銨水溶液的兩兩搭配作為流動相，對標準溶液進行液相色譜串聯質譜儀的測定。結果發現，甲酸銨、乙腈同時使用時會對百里香酚酞、酚汀、雙丁酚丁、4-氯雙醋酚汀、雙丙酚汀、4-氯酚丁、雙醋酚汀有明顯的抑制效應，使用0.1% 甲酸甲醇-0.1% 甲酸水體系時，12種化合物的色譜峰型良好，檢測靈敏度較高，因此本實驗選擇0.1% 甲酸甲醇-0.1% 甲酸水作為流動相。

在優化的儀器條件下，12種化合物在14 min內均能得到較好的分離，有些非同分異構化合物保留時間接近，由于質荷比的不同，不影響定性與定量，各化合物定量離子掃描圖見圖1。

2.2 基質效應評價

基質效應是三重四極桿質譜法中影響定量結果準確性的重要因素。本研究對酵素梅樣品基質進行研究，樣品按本方法進行測定，12種化合物均為陰性，將其樣品提取液作為空白基質溶液，用空白基質溶液和甲醇分別配制同濃度的混合標準溶液，上機測定，基質標準溶液和試劑標準溶液各平行測定3次，記錄其各化合物的峰面積，求其平均值。相對基質效應=待測物在基質中的平均峰面積/待測物在純溶劑中的平均峰面積×100%。

實驗發現，在酵素梅樣品基質中，12種化合物相對基質效應均在80%～125%，沒有強基質效應的出現，又由于此類化合物均為非法添加物，在食品中不得檢出，綜合考慮，酵素梅樣品的測定中可用溶劑曲線進行定量分析。

2.3 標準曲線

將1.1標準曲線溶液按上述方法進行儀器測定，以化合物濃度為橫坐標，以化合物定量離子對的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。以標準曲線線性相關性系數r評價其相關性，各化合物的相關性系數如表2。結果符合《化學分析方法驗證確認和內部質量控制要求》（GB/T 32465—2015）中相關性系數不小于0.997的要求。

2.4 方法檢出限

在酵素梅樣品空白基質中采用逐級遞減的方法加入混合標準溶液，按本方法進行測定，以信噪比≥3作為依據確定各個化合物的檢出限，最終確定百里香酚酞的檢出限為50 μg·kg-1；雙辛酚丁的檢出限為25 μg·kg-1；其余化合物的檢出限為10 μg·kg-1。

2.5 準確度與重復性驗證

針對各基質，添加濃度分別在檢出限、2倍檢出限、5倍檢出限的水平下，進行回收測定，12種化合物的回收率為93.0%～123.0%，各水平下的6平行樣品加標回收率的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為0.26%～8.58%，各化合物在不同濃度的回收率及精密度詳見表3。

2.6 提取溶劑的選擇

本實驗考慮12種酚汀（酚丁）、酚酞及其酯類衍生物或類似物在甲醇中溶解效率較高，又因為液相條件使用甲醇作為流動相，為增加溶劑匹配度，減小溶劑效應，所以使用甲醇作為提取試劑；加少量的水是因為有的樣品水分較少，直接加入甲醇，樣品分散性不好，提取效率低，所以先加少量水，使樣品分散后加甲醇，保證方法的回收率。

3 結論

本文建立了超高效液相色譜-串聯質譜儀法測定酵素梅中12種非法添加藥物（包括百里香酚酞、雙辛酚丁、4-氯雙醋酚丁、雙丙酚丁、雙戊酚丁、4-氯酚丁、雙丁酚丁、酚汀、雙醋酚丁、雙己酚丁、酚酞、雙庚酚丁）的方法。經驗證，該方法在基質效應、線性、檢出限、回收率、重復性等方面均滿足相關要求，并且其具有簡單、快速、靈敏度高等優點，可作為檢測酵素梅中非法添加12種藥物的方法。

參考文獻

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作者簡介：李肖斐（1986—），女，遼寧大連人，本科，高級工程師。研究方向：食品檢測。